利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法

1.本发明属于毒性评价技术领域，具体涉及一种利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法。


背景技术：

2.婴幼儿对于婴童化妆品的使用时必不可少的，然而在使用过程中必须考虑该类产品的安全性，尤其是沐浴、洗发类的产品由于接触眼睛，对婴童类化妆品的眼刺激评价是安全性评价的重要项目。长期以来的眼刺激评价方法为兔眼draize试验，然而随着“3r”原则的实施，draize试验在伦理上及科学上均受到质疑，对动物造成极大的痛苦，且试验数据存在主观性，已经不被认可。目前已有多种体外替代方法得到了欧洲化学品局、美国国家环境保护及经济合作与发展组织(oecd)的认可，其中有5种替代试验得到了oecd的认可，分别是牛角膜不透明度和渗透性试验，离体鸡眼试验、短时暴露试验、重组人角膜上皮模型试验试验以及荧光素渗漏试验。
3.牛角膜不透明度和渗透性试验属于离体器官试验，利用新鲜分离的牛角膜，将受试物直接加到角膜上皮的表面，通过定量检测角膜浑浊度及渗透性改变，评价待测样品的眼刺激程度；离体鸡眼试验属于离体器官试验，利用短期体外培养的鸡眼球，将受试物暴露于角膜表面。通过定量检测角膜厚度、角膜浑浊度、荧光素滞留情况及肉眼观察形态学的改变来评价角膜上皮的损伤程度，还能够通过鸡眼球的组织病理学结果来评价角膜损伤的深度并预测损伤的可逆性；短时暴露试验利用单层兔眼角膜细胞，将受试物溶解或混匀在0.9％生理盐水中，暴露于受试物5min后，用mtt法测定细胞存活率从而对受试物进行识别；重组人角膜上皮模型试验试验是将来源于正常人的表皮角质细胞、人永生化角膜上皮细胞及原代人角膜上皮细胞培养成多层高度分化的鳞状上皮组织，形成与人角膜十分相似的3d模型。将一定剂量的受试物与模型的表面充分接触，并在暴露后和暴露后的潜伏期用mtt法测量细胞存活率；荧光素渗漏试验属于基于细胞功能测定的试验。利用单层的犬肾小管上皮细胞暴露于受试物1min后，导致细胞单层上皮荧光素钠渗透性的增加情况来判断受试物引起的眼毒性强弱。
4.然而上述现有的评价方法的评价指标评判的主观性较强，依赖于实验者的经验，导致试验评分主观性强，实验结果具有不确定性；同时动物实验方法对动物伤害大，不符合动物保护和福利的要求；存在实验周期长，实验复杂等问题。因此急需一种能够快速简单评价婴童化妆品眼刺激性的方法的方法。


技术实现要素：

5.本发明为解决上述技术问题进行，提供了一种新的利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法，实现婴童化妆品对眼睛刺激的直观评价。
6.本发明选用野生型ab品系斑马鱼为模型。由于其具有繁殖周期短，使用药物量少、遗传水平与人类相似、个体小、胚胎透明、便于显微操作，并且斑马鱼的视觉系统与包括人
类在内的其他脊椎动物非常相似的优势，因此斑马鱼眼睛可作为较好的视觉模型。通过斑马鱼暴露于待测样品后，以眼睛形态变化和行为轨迹为评价指标，并结合检测眼部发育相关基因转录水平，能够快速准确评价待测样品是否具有眼刺激性。
7.为了实现上述目的，本发明提供的利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法包括如下步骤：将发育至3天的斑马鱼胚胎暴露于含有婴童化妆品的胚胎培养液中，采用半静态培养法，在特定温度、周期性明暗环境下培养，待斑马鱼胚胎发育至6天时，对斑马鱼幼鱼的眼刺激、对光刺激的反应能力以及眼部发育相关基因的变异情况进行评价。
8.优选的，斑马鱼胚胎为野生斑马鱼ab品系胚胎。
9.优选的，进行暴露前，先配置不同浓度的待测婴童化妆品溶液，给药72h后，统计每组斑马鱼死亡情况，计算死亡率，选取死亡率小于5％且不会引起斑马鱼机体器官损伤的样品浓度作为待测样品安全浓度。
10.优选的，进行胚胎选择时，选取发育良好的，由斑马鱼繁殖发育至三天已孵化的胚胎进行暴露实验，每个培养皿中放置20个胚胎。
11.优选的，进行培养时，将培养容器置于恒温光控培养箱中，温度控制在28
±
1℃，光照与黑暗周期为14/10h，采取半静态培养法，每隔24h更换培养液，暴露时长为72h。
12.优选的，进行眼部刺激性评价时，斑马鱼幼鱼的眼刺激的指标包括眼部形态变化，测量虹膜带宽和瞳孔直径、并计算两者的比值；对光刺激的反应能力指标包括计算黑暗中以及光照条件下特定时间段的平均速度、以及对应的运动距离；眼部发育相关基因的变异评价的指标包括评价斑马鱼眼睛发育相关基因unc45b、foxc1、chm的转录水平。
13.其中，进行眼刺激的指标评价时，采用在体式显微镜下观察斑马鱼幼鱼眼部形态变化并拍照记录；然后利用image j软件测量虹膜带宽和瞳孔直径，并计算两者的比值；
14.进行光刺激的反应能力评价时，包含如下步骤：
15.1)待斑马鱼胚胎在含有婴童化妆品的胚胎培养液中发育至6天后，清洗3遍，置于96孔板中，每孔一条鱼，每组至少10条鱼，放入斑马鱼行为轨迹跟踪系统中静置10min；
16.2)黑暗中静置5min后立即给予光刺激20s，每20s记录一次数据，以此循环重复3次；
17.3)计算黑暗中第280～300秒的平均速度、光照20s的平均速度，以及对应的运动距离，并跟踪记录各处理组幼鱼在黑暗条件下最后20s和光照条件下20s的游泳轨迹。
18.进行转录水平检测时，斑马鱼眼睛发育相关基因unc45b、foxc1、chm的rt-pcr的引物序列如下表1所示：
19.表1 rt-pcr引物序列汇总
[0020][0021]
优选的，待测婴童化妆品包括含有失水山梨醇单水桂酸脂、酰基谷氨酸盐、环氧乙烷加成物、脂肪酸皂、十二烷基硫酸钠、油酸单甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油中的任意一种或多种的化妆品。
[0022]
本发明的有益效果如下：
[0023]
首先，本发明中所用的模式生物斑马鱼，具有繁殖周期短，使用药物量少、遗传水平与人类相似、个体小、胚胎透明、便于显微操作，并且斑马鱼的视觉系统与包括人类在内的其他脊椎动物非常相似的优势，斑马鱼眼睛可作为较好的视觉模型。
[0024]
其次，本发明选用刚繁殖发育的斑马鱼胚胎为模型，对于婴幼化妆品的评价更具有代表性。
[0025]
第三，进行眼部刺激评价时，本发明检测暴露待测样品后斑马鱼眼睛形态的虹膜带宽和瞳孔直径，可以简单快速评价是否样品对眼睛产生眼损伤；检测暴露样品后斑马鱼在黑暗、光照交替条件下的运动距离和运动速度，可以评价样品是否影响斑马鱼对光的刺激性反应；将形态学眼损伤和行为轨迹评价标准相结合，可以准确、快速、科学评价对待测样品的眼刺激性。
[0026]
本发明能够实现婴童化妆品眼刺激性的评价，具有代表性、普遍性、准确性高等特点，值得推广应用。
附图说明
[0027]
图1为婴童化妆品暴露后斑马鱼死亡率示意图。
[0028]
图2为婴童化妆品暴露后斑马鱼机体器官形态示意图。
[0029]
图3为婴童化妆品暴露后斑马鱼虹膜带宽/瞳孔直径示意图。
[0030]
图4为婴童化妆品暴露后斑马鱼行为轨迹中运动速度示意图。
[0031]
图5为婴童化妆品暴露后斑马鱼行为轨迹中运动总距离示意图。
[0032]
图6为婴童化妆品暴露后斑马鱼眼睛发育相关基因unc45b转录水平示意图。
[0033]
图7为婴童化妆品暴露后斑马鱼眼睛发育相关基因foxc1转录水平示意图。
[0034]
图8为婴童化妆品暴露后斑马鱼眼睛发育相关基因chm转录水平示意图。
[0035]
图9为琼脂糖凝胶电泳检测化妆品暴露后斑马鱼提取rna质量。
具体实施方式
[0036]
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以
本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0037]
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
[0038]
实施例1待测婴童化妆品安全浓度的选定：
[0039]
1)本发明选择试验模型为野生ab型；
[0040]
2)采用二甲基亚砜(dmso)作为溶剂将含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的婴童化妆品配制成浓度为120mg/ml的高浓度母液，于-20℃保存；
[0041]
3)将配置好的母液用胚胎培养液稀释为10、20、40、60、80、100和120μg/ml的工作液，溶液现配现用，保持dmso的浓度小于千分之一；
[0042]
4)将含有待测婴童化妆品的培养液与不含待测样品的培养液注入6cm的培养皿中，培养液的体积控制在8～9ml.；
[0043]
5)选取健康发育良好的由斑马鱼繁殖发育的胚胎，进行暴露实验，每个培养皿中放置20个胚胎；
[0044]
6)将培养皿置于恒温光控培养箱中，温度控制在28
±
1℃，光照与黑暗周期为14/10h，采取半静态培养法，每隔24h更换培养液，暴露时长为72h；
[0045]
7)给药72h后，统计每组斑马鱼死亡情况，计算死亡率(％)，并观察斑马鱼形态机体是否发生损伤。
[0046]
死亡率结果如图1所示，暴露72h后，浓度为10μg/ml的实验组死亡率为2.1％，20μg/ml死亡率为3.5％。形态结果如图2所示，机体器官正常没有发生发育损伤现象。因此选用10μg/ml和20μg/ml作为安全浓度。
[0047]
实施例2活体观察含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品斑马鱼眼损伤
[0048]
1)随机选取发育正常的3dpf斑马鱼，每组各20条；
[0049]
2)选用含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品，其他组分均温和无刺激性，浓度为10μg/ml和20μg/ml作为实验组，以0.1％dmso为对照组。
[0050]
3)将培养皿置于恒温光控培养箱中，温度控制在28
±
1℃，光照与黑暗周期为14/10h，采取半静态培养法，每隔24h更换培养液，暴露时长为72h；
[0051]
4)在体式显微镜下观察斑马鱼幼鱼眼部形态变化并拍照记录；
[0052]
5)利用image j软件测量虹膜带宽和瞳孔直径，并计算两者的比值。
[0053]
结果如图3所示，对照组虹膜带宽与瞳孔直径比值为7.5，10μg/ml实验组虹膜带宽与瞳孔直径比值为3.2，20μg/ml实验组虹膜带宽与瞳孔直径比值为1.4，与对照组相比无明显差异，则表明该含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品产生眼损伤刺激。
[0054]
实施例3暴露含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品72h后斑马鱼行为轨迹分析
[0055]
1)随机选取发育正常的3dpf斑马鱼，每组各20条；
[0056]
2)选用含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品，其他组分均温和无刺激性，浓度为10μg/ml和20μg/ml作为实验组，以0.1％dmso为对照组；
[0057]
3)将培养皿置于恒温光控培养箱中，温度控制在28
±
1℃，光照与黑暗周期为14/10h，采取半静态培养法，每隔24h更换培养液，暴露时长为72h；
[0058]
4)72h后，清洗3遍，置于96孔板中，每孔一条鱼，每组15条鱼，放入斑马鱼行为轨迹跟踪系统(斑马鱼行为检测仪)中静置10min；
[0059]
5)黑暗中5min后立即给予光刺激20s，每20s记录一次数据，以此循环重复3次
[0060]
6)计算黑暗中第280～300秒的平均速度、光照20s的平均速度，以及对应的运动距离，并跟踪记录各处理组幼鱼在黑暗条件下最后20s(第280～300秒)和光照条件下20s的游泳轨迹。
[0061]
暴露含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品72h后的平均速度结果如图4所示，对照组在黑暗中的平均运动速度为0.3cm/s，在光明中的平均运动速度为0.26cm/s；浓度为10μg/ml的实验组在黑暗中的平均运动速度为0.15cm/s，在光明中的平均运动速度为0.09cm/s；浓度为20μg/ml的实验组在黑暗中的平均运动速度为0.13cm/s，在光明中的平均运动速度为0.06cm/s。
[0062]
暴露含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品72h后的运动总距离结果如图5所示，对照组在黑暗中的运动总距离为6cm，在光明中的运动总距离为5cm/s；浓度为10μg/ml的实验组在黑暗中的平均运动速度为5.2cm/s，在光明中的平均运动速度为2.3cm/s；浓度为20μg/ml的实验组在黑暗中的平均运动速度为3.6cm/s，在光明中的平均运动速度为1.3cm/s。
[0063]
与对照组相比，浓度为10μg/ml和20μg/ml实验组在黑暗和光明环境下的平均运动速度均下降，且具有明显差异，则表明10μg/ml和20μg/ml的该样品影响斑马鱼的对光刺激的调节能力。则证明该化妆品具有眼刺激性。
[0064]
实施例4rt-pcr方法检测眼部发育相关基因的转录水平
[0065]
1)随机选取发育正常的3dpf斑马鱼，每组各20条；
[0066]
2)选用含有酰基谷氨酸盐含量0.59％的化妆品，其他组分均温和无刺激性，浓度为10μg/ml作为实验组，以0.1％dmso为对照组；
[0067]
3)将培养皿置于恒温光控培养箱中，温度控制在28
±
1℃，光照与黑暗周期为14/10h，采取半静态培养法，每隔24h更换培养液，暴露时长为72h；
[0068]
4)暴露结束后收集样品，液氮速冻，trizol法提取总rna，琼脂糖凝胶电泳检测提取rna质量利用m-mlv反转录酶反转录为cdna，以cdna为模板进行rt-pcr。以β-actin为内参对照，以对照组为外对照。所用引物序列如表1所示。
[0069]
结果如图6、7、8所示，与对照组相比，unc45b、foxc1、chm基因均明显下调，unc45b可能会导致晶体去核不完全或空泡，foxc1可能会导致虹膜，小梁网，角膜异常，chm可能会导致视网膜色素上皮缺陷，表明该样品可能通过降低一些眼发育相关基因的表达水平影响了斑马鱼的眼睛正常发育，从而产生损伤和刺激性。则证明该婴童化妆品具有眼刺激性。
[0070]
实施例5样品暴露斑马鱼72h后使用trizol法提取总rna
[0071]
1)收集麻醉后的胚胎于1.5ml离心管，弃去培养液，加入1ml trizol，针筒抽提；
[0072]
2)加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5分钟后，12000g，4℃离心15分钟；
[0073]
3)取上清于1.5ml离心管，加入600μl异丙醇，温和混合，室温静置10分钟后，12000g，4℃离心10分钟，弃上清；
[0074]
4)加入1ml 75％乙醇/depc h2o，7500g，4℃离心5分钟，弃上清；
[0075]
5)7500g，再次4℃离心1分钟，随后开盖室温干燥1分钟；
[0076]
6)加入20μldepc h2o充分溶解。
[0077]
实施例6琼脂糖凝胶电泳鉴定样品暴露斑马鱼72h后提取的rna质量
[0078]
1)制备1％琼脂糖凝胶：称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml 1
×
tae。微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0％凉脂糖凝胶液；
[0079]
2)胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽制胶槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子；将内槽置于水平位置，并放好梳子；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1
×
tae电泳缓冲液至没过胶板为止。
[0080]
3)加样：取1μl的rna样品，与5μl的6
×
dna loading buffer混匀，加入样孔中，开始跑胶。
[0081]
结果如图9所示，所提rna质量完整，有明显三个条带，可用于下一步rt-pcr。
[0082]
本发明提供的评价婴童化妆品眼刺激性的方法，利用野生斑马鱼ab品系。以斑马鱼眼睛形态、行为轨迹和眼睛发育相关基因转录水平为评价指标，能够快速、直观地检测化妆品暴露后眼睛损伤和刺激情况，提高了检测的灵敏度和结果的准确性。
[0083]
建立的婴童化妆品对斑马鱼眼刺激的评价模型具有简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点。
[0084]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。