基于生物成像的定量分析方法、分离方法、装置及设备与流程

1.本技术涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种基于生物成像的定量分析方法、分离方法、装置及设备。


背景技术：

2.生物体内核酸和蛋白质复杂多样，在生物体内行使着各种各样的功能；现有技术中，生物体组织样本的定量分析一般采用单色标记的方式进行，但这种标记方式针对不同荧光标记使用时，需要重复染色而影响组织样本，且检测效率低；若同时进行多荧光标记，组织样本会产生自发荧光，自发荧光会干扰常规的荧光显微成像系统而导致无法实现定量分析。
3.针对上述问题，目前尚未有有效的技术解决方案。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种基于生物成像的定量分析方法、分离方法、装置及设备，实现了多重荧光的同时原位检测，避免了重复洗脱染色对组织样本产生的影响。
5.第一方面，本技术提供了一种基于生物成像的定量分析方法，用于对组织样品标记成像以进行定量分析，所述定量分析方法包括以下步骤：对所述组织样本进行多重染色以使所述组织样本产生多重荧光信号；获取包含所述多重荧光信号的高光谱图像；获取荧光端元库，所述荧光端元库为根据所述高光谱图像和所述组织样本的多重染色的情况建立；根据所述高光谱图像从所述荧光端元库中选取合适的荧光端元；根据所述合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对所述高光谱图像进行解混，获取分离的荧光信号；基于所述分离的荧光信号进行定量分析。
6.本技术的一种基于生物成像的定量分析方法，根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立荧光端元库，能快速确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以进行解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，该方法结合了高光谱成像和荧光显微手段，实现了多重荧光的同时原位检测，避免了重复洗脱染色对组织样本产生的影响，提高了分析检测效率和准确性。
7.所述的一种基于生物成像的定量分析方法，其中，所述对所述组织样本进行多重染色以使所述组织样本产生多重荧光信号的步骤包括：采用单色紫外光源激发所述组织样本的多重荧光探针以使所述组织样本产生多重荧光信号。
8.在该示例的一种基于生物成像的定量分析方法中，组织样本中具有多种高性能荧光探针，且均能受单色紫外光源进行激发，单色紫外光源照射在组织样本上激发多重荧光信号。
9.所述的一种基于生物成像的定量分析方法，其中，在完成所述根据所述合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对所述高光谱图像进行解混，获取分离的荧光信号的步骤后，获取所述合适的荧光端元的丰度并根据所述丰度计算分解误差，并在所述分解误差超出预设值时，再次执行根据所述高光谱图像从所述荧光端元库中选取合适的荧光端元的步骤。
10.在该示例的一种基于生物成像的定量分析方法中，设计分解误差对荧光端元验证，能确保多重荧光信号分离更准确。
11.所述的一种基于生物成像的定量分析方法，其中，所述荧光端元包括探针荧光端元和自发荧光端元。
12.所述的一种基于生物成像的定量分析方法，其中，所述自发荧光端元为根据所述高光谱图像进行估计。
13.所述的一种基于生物成像的定量分析方法，其中，所述探针荧光端元为根据荧光光谱库获取。
14.第二方面，本技术还提供了一种基于生物成像的分离方法，用于从包含多重荧光信号的高光谱图像中获取多重分离的荧光信号，所述分离方法包括以下步骤：根据所述高光谱图像从荧光端元库中选取合适的荧光端元，所述荧光端元库为根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立；根据所述合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对所述高光谱图像进行解混，获取分离的荧光信号。
15.本技术的一种基于生物成像的分离方法，利用根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立荧光端元库，快速确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以进行解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，具有分离准度高、分离迅速的特点。
16.第三方面，本技术还提供了一种基于生物成像的分离装置，用于从包含多重荧光信号的高光谱图像中获取多重分离的荧光信号，所述分离装置包括：选取模块，用于根据所述高光谱图像从荧光端元库中选取合适的荧光端元，所述荧光端元库为根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立；解混模块，用于根据所述合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对所述高光谱图像进行解混，获取分离的荧光信号。
17.本技术的一种基于生物成像的分离装置，利用根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立荧光端元库，从选取模块中快速选取并确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以供给解混模块进行多重荧光信号的解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，具有分离准度高、分离迅速的特点。
18.第四方面，本技术还提供了一种电子设备，包括处理器以及存储器，所述存储器存储有计算机可读取指令，当所述计算机可读取指令由所述处理器执行时，运行如上述第一方面提供的所述方法中的步骤。
19.第五方面，本技术还提供了一种获取设备，用于获取上述第一方面提供的所述方法中的所述高光谱图像，包括：激光发光光源、荧光滤光模组、带切换功能的物镜、运动平台、带有组织样本的载玻片、分光系统和探测器；
所述激光发光光源发出的激光依次经过所述荧光滤光模组、所述物镜和所述运动平台后照射在所述载玻片的所述组织样本上，使所述组织样本发出多重荧光信号；所述多重荧光信号依次经过所述物镜、所述荧光滤光模组、所述分光系统后被所述探测器获取而生成所述高光谱图像；所述运动平台用于调节所述载玻片位置以实现所述载玻片的对焦和推扫成像。
20.本技术的一种获取设备，能迅速且精确地获取包含多重荧光信号的高光谱图像，以供上述第一方面的任一可选的实现方式中的定量分析方法进行定量分析。
21.由上可知，本技术提供了一种基于生物成像的定量分析方法、分离方法、装置及设备，其中，定量分析方法根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立荧光端元库，能快速确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以进行解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，实现了多重荧光的同时原位检测，避免了重复洗脱染色对组织样本产生的影响。
附图说明
22.图1为本技术实施例提供的基于生物成像的定量分析方法的流程图。
23.图2为实施例1中多重荧光信号解混结果示意图。
24.图3为本技术实施例提供的基于生物成像的分离方法的流程图。
25.图4为本技术实施例提供的基于生物成像的分离装置的结构示意图。
26.图5为本技术实施例提供的电子设备的结构示意图。
27.图6为本技术实施例提供的获取设备的结构示意图。
28.附图标记：100、选取模块；200、解混模块；300、电子设备；301、处理器；302、存储器；303、通信总线；401、激光发光光源；402、荧光滤光模组；403、物镜；404、运动平台；405、载玻片；406、分光系统；407、探测器。
具体实施方式
29.下面将结合本技术实施例中附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和展示出的本技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。基于本技术的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
30.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。同时，在本技术的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
31.第一方面，请参照图1和图2，图1和图2是本技术一些实施例中的一种基于生物成像的定量分析方法，用于对组织样品标记成像以进行定量分析，定量分析方法包括以下步骤：s1、对组织样本进行多重染色以使组织样本产生多重荧光信号；具体地，组织样本置于载玻片上，该步骤中利用探针对组织样本进行多重染色，然
后利用激光光源照射在组织样本上，使已进行多重染色的组织样本激发出多重荧光信号；具体地，多重荧光信号为组织样本受激光激发的多重荧光标记信息。
32.具体地， 组织样本为待测定对象的生物样本。
33.s2、获取包含多重荧光信号的高光谱图像；具体地，该步骤一般通过探测设备采集包含多重荧光信号的高光谱图像，高光谱图像集组织样本的图像信息与光谱信息于一身，高光谱图像像元的光谱数据能反映组织样本不同位置的多重荧光信号混合特点。
34.s3、获取荧光端元库，荧光端元库为根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立；具体地，根据组织样本的多重染色的情况能获取染色用的探针，进而能根据探针获取对应的荧光端元。
35.具体地，端元只包含一种荧光探针信息，像元能分解为多种端元以进行定量描述，因此，步骤s3获取基于关于荧光信号的荧光端元建立的荧光端元库，具有多种不同的荧光端元组合，能反映出不同像元的光谱数据的特点。
36.更具体地，荧光端元为能反映高光谱图像像元中荧光信号的端元。
37.s4、根据高光谱图像从荧光端元库中选取合适的荧光端元；具体地，步骤s4包括：根据高光谱图像像元的光谱数据，从荧光端元库中选取合适的荧光端元。
38.具体地，荧光端元库为根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立，即包含了能反映探针荧光标记特性的荧光端元和能反映组织样本的荧光标记特性的荧光端元，确保了步骤s4能顺利获取到合适的荧光端元。
39.具体地，高光谱图像像元的光谱数据以光谱图的形式进行展示，该步骤中，根据高光谱图像像元的光谱数据的谱线特点在荧光端元库中选取合适的荧光端元组合，可以是根据谱线峰型位置选择具有对应端元光谱峰型的荧光端元进行组合，还可以先是将不同荧光端元的端元光谱组合建立多个光谱图组，在光谱图组中选择光谱谱线特点与高光谱图像近似的光谱图，再获取对应光谱图的荧光端元。
40.具体地，该步骤中根据高光谱图像像元的光谱数据的波形特点确定荧光端元的选取数量，如一光谱图上具有四个波峰，则根据四个波峰波形特点选取四个荧光端元。
41.s5、根据合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对高光谱图像进行解混，获取分离的荧光信号；具体地，步骤s5包括：根据合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对高光谱图像像元的光谱数据进行解混，获取该像元中分离的荧光信号以获取高光谱图像待进行定量分析的一个或多个像元中的分离的荧光信号。
42.步骤s4选取了多个荧光端元，然后结合稀疏约束的非负矩阵分解对高光谱图像像元的光谱数据解混，即利用稀疏约束的非负矩阵分解将高光谱图像像元的光谱数据分解为多个荧光端元对应的荧光信号；然后根据组织样本需要进行定量分析的位置，获取高光谱图像中不同像元中的分离的荧光信号。
43.s6、基于分离的荧光信号进行定量分析。
44.本技术实施例的一种基于生物成像的定量分析方法，根据高光谱图像和组织样本
的多重染色的情况建立荧光端元库，能快速确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以进行解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，该方法结合了高光谱成像和荧光显微手段，实现了多重荧光的同时原位检测，避免了重复洗脱染色对组织样本产生的影响，提高了分析检测效率和准确性。
45.在一些优选的实施方式中，对组织样本进行多重染色以使组织样本产生多重荧光信号的步骤包括：采用单色紫外光源激发组织样本的多重荧光探针以使组织样本产生多重荧光信号。
46.具体地，单色紫外光源为波长为375nm或者405nm的激光光源。
47.具体地，组织样本中具有多种高性能荧光探针，且均能受单色紫外光源进行激发，单色紫外光源照射在组织样本上激发多重荧光信号。
48.更具体地，组织样本通过多色荧光标记手段将高性能荧光探针修饰到二维杂交链高分子聚合物单元核酸链末端，以使多重荧光信号能清楚指示组织样本中不同待测物的荧光信号混合特点。
49.在一些优选的实施方式中，在完成根据合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对高光谱图像进行解混，获取分离的荧光信号的步骤后，获取合适的荧光端元的丰度并根据丰度计算分解误差，并在分解误差超出预设值时，再次执行根据高光谱图像从荧光端元库中选取合适的荧光端元的步骤。
50.具体地，即步骤s5和步骤s6之间还包括步骤：s5
’ꢀ
、获取合适的荧光端元的丰度并根据丰度计算分解误差，并在分解误差超出预设值时，返回步骤s4。
51.具体地，增加步骤s5’对荧光端元进行验证，能确保多重荧光信号分离更准确。
52.具体地，丰度为端元在一像元中占据的百分比，因此，本技术实施例中，荧光端元的丰度能反映该荧光端元在高光谱图像像元的光谱数据中的占比。
53.具体地，由于荧光端元为根据高光谱图像像元的光谱数据的谱线特点从荧光端元库中选取的，因此可能会选择出一些不合适的荧光端元，故在步骤s5和s6之间增加一个验证步骤s5’，以验证当前选择的荧光端元是否与该高光谱图像像元的光谱数据匹配，其中，验证过程为基于分解误差的大小进行判断，当计算出分解误差超出预设值时，返回步骤s4中以重新选取别的荧光端元。
54.更具体地，验证过程为基于步骤s4获取的所有荧光端元的丰度计算组合光谱数据，分解误差为组合光谱数据和高光谱图像像元的光谱数据的差值。
55.更具体地，利用分解误差验证荧光端元是否选择准确的具体过程如下：将高光谱图像中一像元的光谱数据对应的荧光光谱线性模型的数学表达式定义为：
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（1）其中，x表示多重荧光信号，m为该像元内荧光端元的数量，sk表示该像元内一荧光端元，ak表示该像元内荧光端元sk对应的丰度，满足，故s表示荧光端
元矩阵，a表示丰度向量，w表示噪声光谱向量；以一像元内仅具有两荧光端元为例，则有m=2，荧光端元s1和s2组成端元矩阵s；另外，噪声光谱向量w为预设的噪声补偿数据，多重荧光信号实测数据中一般包含噪声数据，故设计噪声光谱向量w构建荧光光谱线性模型，噪声光谱向量w的数值为根据使用场景进行设定。
56.设实际多重荧光信号的真实值为：
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（2）其中，x*为多重荧光信号的真实值，a*为丰度向量的真实值；具体地，这里所指的真实值为实测值，即包含了噪声数据的测量结果，若对测量结果中进行了去噪处理，则公式（1）中w可设置为0。
57.定义分解误差为矩阵e，则有：
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（3）故矩阵e与矩阵s正交，根据e
⊥
s可得，矩阵s的转置矩阵与矩阵e相乘结果为0，即：
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（4）其中，s
t
为s的转置矩阵。
58.将公式（4）代入公式（2），有：
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（5）将公式（5）和（2）代入公式（3），有：
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（6）再将公式（1）代入公式（6）中即可计算获得分解误差为e，然后判断分解误差e是否超出预设值即可确认荧光端元选择是否合适。
59.更具体地，定义荧光光谱线性模型的过程还需满足，即荧光端元对应的丰度和为1。
60.在一些优选的实施方式中，步骤s5’设有重复次数上限，步骤s5’执行次数达到重复次数上限且分解误差仍然超出预设值时，表明难以从当前建立的荧光端元库获取合适的荧光端元，此时需要暂停高光谱图像的解混，等操作人员进行荧光端元库的校验调整，避免对高光谱图像解混继续进行无用功。
61.在一些优选的实施方式中，在确定荧光端元后，步骤s5的解混过程为利用稀疏约束的非负矩阵分解(nonnegative matrix factorization，nmf)进行像元的光谱数据的解混，以丰度作为稀疏约束限制，即以和分别作为非负限制性条件以及总和为一的限制性条件，将光谱数据中的多重荧光信号根据荧光端元分解为对应的荧光信号。
62.在一些优选的实施方式中，荧光端元包括探针荧光端元和自发荧光端元。
63.具体地，多重荧光信号是荧光探针的发射光和组织样本自发荧光的线性混合信
号，探针荧光端元为单一荧光探针的荧光光谱，自发荧光端元为单一样本的自发荧光。
64.在一些优选的实施方式中，自发荧光端元为根据高光谱图像进行估计。
65.具体地，根据高光谱图像像元构成，估计并提取所有可能的自发荧光端元，并作为荧光端元编入荧光端元库；该估计过程为从高光谱图像的光谱曲线中剔除探针荧光端元后根据端元间的相关性确定自发荧光端元个数，并根据频谱确定自发荧光端元类型。
66.在一些优选的实施方式中，探针荧光端元为根据荧光光谱库获取。
67.具体地，探针荧光端元为已知数据，可在荧光光谱库直接查找数据获取。
68.实施例1如图2所示，图中虚线为获取的高光谱图像中一像元的光谱数据，即为多重荧光信号的谱线，对该光谱数据解混后获得图2中四条实线所示的荧光信号曲线，而实际产生的荧光信号的量子点数据如下表：表1 实际产生的荧光信号的量子点数据no.起始波长/nm峰值波长/nm末端波长/nm峰值数据1420.0485.2510.6870.82510.6559.8589.2933.13589.2608.4646.4904.04646.4658.0710.0781.4结合上表和附图2可见，在没有去除光谱混叠时，相邻的荧光信号之间干扰严重，如图2中峰值609.8nm处的荧光信号影响了峰值在681.2nm处的荧光信号峰值，导致多重荧光信号在681.2nm处的量子点数据比在681.2nm处的荧光信号的峰值数据高出61.4%；解混后的4种荧光信号基本符合表1中实际产生的荧光信号的量子点数据的特点，表明本技术实施例提供的一种基于生物成像的定量分析方法，能准确、高效地将多重荧光信号分解。建议对图2的横纵坐标进行说明第二方面，请参照图3，图3是本技术一些实施例中提供的一种基于生物成像的分离方法，用于从包含多重荧光信号的高光谱图像中获取多重分离的荧光信号，分离方法包括以下步骤：a1、根据高光谱图像从荧光端元库中选取合适的荧光端元，荧光端元库为根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立；a2、根据合适的荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对高光谱图像进行解混，获取分离的荧光信号。
69.本技术实施例的一种基于生物成像的分离方法，利用根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立荧光端元库，快速确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以进行解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，具有分离准度高、分离迅速的特点。
70.第三方面，请参照图4，图4为本技术实施例提供的一种基于生物成像的分离装置，用于从包含多重荧光信号的高光谱图像中获取多重分离的荧光信号，分离装置包括：选取模块100，用于根据高光谱图像从荧光端元库中选取合适的荧光端元，荧光端元库为根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立；解混模块200，用于根据荧光端元和稀疏约束的非负矩阵分解对高光谱图像进行
解混，获取分离的荧光信号。
71.本技术实施例的一种基于生物成像的分离装置，利用根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立荧光端元库，从选取模块100中快速选取并确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以供给解混模块200进行多重荧光信号的解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，具有分离准度高、分离迅速的特点。
72.第四方面，请参照图5，图5为本技术实施例提供的一种电子设备的结构示意图，本技术提供一种电子设备300，包括：处理器301和存储器302，处理器301和存储器302通过通信总线303和/或其他形式的连接机构（未标出）互连并相互通讯，存储器302存储有处理器301可执行的计算机程序，当计算设备运行时，处理器301执行该计算机程序，以执行时执行上述实施例的任一可选的实现方式中的定量分析方法。
73.第五方面，请参照图6，图6为本技术实施例提供的一种获取设备，用于获取上述实施例的任一可选的实现方式中的定量分析方法中的高光谱图像，包括：激光发光光源401、荧光滤光模组402、带切换功能的物镜403、运动平台404、带有组织样本的载玻片405、分光系统406和探测器407；激光发光光源401发出的激光依次经过荧光滤光模组402、物镜403和运动平台404后照射在载玻片405的组织样本上，使组织样本发出多重荧光信号；多重荧光信号依次经过物镜403、荧光滤光模组402、分光系统406后被探测器407获取而生成高光谱图像；运动平台404用于调节载玻片405位置以实现载玻片405的对焦和推扫成像。
74.具体地，激光发光光源401为单色紫外光源，组织样本已在多色荧光标记系统作用下将荧光探针修饰到二维杂交链高分子聚合物单元核酸链末端。
75.具体地，荧光滤光模组402用于过滤激光发光光源401发出的特定频率激光以外的杂光，并用于将多重荧光信号反射至分光系统406。
76.具体地，带切换功能的物镜403用于调节光源及多重荧光信号的光学倍率，其包含5x、10x、20x、40x四种可切换的物镜。
77.更具体地，运动平台404为三维精密运动平台，能实现载玻片405的精准对焦和推扫成像，其xy轴能实现载玻片405上组织样本的扫描功能，z轴能实现对焦功能。
78.更具体地，分光系统406为光谱分光光路器件，优选为棱镜光栅分光系统。
79.更具体地，探测器407为高灵敏探测器407，优选emccd或scmos探测器407，能精确获取高光谱图像。
80.本技术实施例的一种获取设备，利用激光发光光源401产生单色紫外光源照射在载玻片405的已进行多重染色的组织样本上，而激发出的荧光由探测器407接收而获取了具有多重荧光信号的高光谱图像，以供上述实施例的任一可选的实现方式中的定量分析方法进行定量分析，该获取设备结构简单，并能根据使用需求调节运动平台404获取位置定位准确、高精度的高光谱图像。
81.综上，本技术实施例提供了一种基于生物成像的定量分析方法、分离方法、装置及设备，其中，定量分析方法根据高光谱图像和组织样本的多重染色的情况建立荧光端元库，能快速确定高光谱图像像元中荧光端元的组成以进行解混，从而将荧光探针和组织样本激发的荧光信号进行分离，实现了多重荧光的同时原位检测，避免了重复洗脱染色对组织样
本产生的影响。
82.在本技术所提供的实施例中，应该理解到，所揭露装置和方法，可以通过其它的方式实现。以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，又例如，多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些通信接口，装置或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。
83.另外，作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部单元来实现本实施例方案的目的。
84.再者，在本技术各个实施例中的各功能模块可以集成在一起形成一个独立的部分，也可以是各个模块单独存在，也可以两个或两个以上模块集成形成一个独立的部分。
85.在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
86.以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。