一种检测非洲猪瘟病毒的双抗体夹心ELISA诊断试剂盒及其方法

一种检测非洲猪瘟病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其方法
技术领域
1.本发明涉及一种诊断试剂盒及其方法，更具体一点说，涉及一种检测非洲猪瘟病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其方法，属于生物技术中的基因工程领域。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起的一种高传染性、常致死性的传染性疾病，主要在家猪和野猪中引起高热、严重出血和高致死率。该病自1921年首次在非洲爆发以来，随后迅速传入欧洲和南美洲。2018年首次在我国辽宁省发现，现该病已经成为全球养猪业关注的主要问题。目前由于暂无asfv相关疫苗，快速有效的诊断方式是防控该病的关键，因此，开展asf的诊断试剂具有重要意义也是必然的发展趋势。


技术实现要素：

3.本发明目的在于提供检测非洲猪瘟病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其方法，可以有效检出asfv，为非洲猪瘟防控提供了新的技术手段，检测快速、准确，对猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒抗原及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原均无反应，特异性强。
4.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
5.一种检测非洲猪瘟病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗p30蛋白单克隆抗体的酶标板、稀释好的p30抗原、稀释好的抗p30蛋白多克隆抗体、稀释好的hrp标记羊抗兔igg酶标抗体、阴性对照、显色液、洗涤液、终止液、封闭液。
6.优选的，所述elisa诊断试剂盒检测p30抗原，最低灵敏度为3.125ng/ml。
7.优选的，所述elisa诊断试剂盒检测asfv临床样本灵敏度为1:10稀释的血样。
8.优选的，所述抗p30蛋白单克隆抗体、抗p30蛋白多克隆抗体中表达蛋白的质粒为重组质粒pet-32a-p30。
9.一种利用所述试剂盒的检测方法，该检测方法包括：asfv双抗夹心elisa方法的建立，所述asfv双抗夹心elisa方法的建立包括如下步骤：
10.1)包被抗体：将稀释好的抗p30蛋白单克隆抗体加入96孔酶标板中，每孔100μl，4℃冰箱放置12h，12h后甩去包被液，用elisa洗涤液洗涤4次，每次在振荡仪振荡20s，每次洗涤完将96孔酶标板在吸水纸上反复拍打，保证孔内无液体；
11.2)封闭：每孔加入250μl封闭液，37℃生化培养箱中封闭2h，甩去封闭液，用elisa洗涤液洗涤3次，且每次在振荡仪振荡20s，每次洗涤完都需要将96孔酶标板在吸水纸上反复拍打；
12.3)p30抗原：向每孔中加入提前梯度稀释好的p30抗原，每孔100μl，盖上盖子，并在37℃生化培养箱孵育1h，孵育完成后，用elisa洗涤液洗涤3次；
13.4)检测抗体：每孔中加入稀释好的抗p30蛋白多克隆抗体，37℃生化培养箱放置
1h，甩去封闭液，用elisa洗涤液振荡洗涤3次；
14.5)酶标二抗：每孔加入稀释好的hrp标记羊抗兔igg 100μl，盖上盖子，于37℃生化培养箱孵育1h，孵育结束后，同样的洗涤方法洗涤4次；
15.6)显色：每孔加入100μl显色液，常温显色；
16.7)终止显色：每孔加入50μl终止液，终止显色；
17.8)吸光度值测定：保证elisa酶标板底部干净，放入酶标仪中，读取450nm波长下的吸光度值，将待测抗体孔od450数值比阴性对照孔od450数值的2.1倍大，判为阳性。
18.优选的，对asfv双抗夹心elisa方法的检测条件优化，其优化为：
19.根据棋盘法，按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000和1:32000横向稀释捕获抗体包被浓度，按照1:1000、1:2000、1:4000和1:8000纵向稀释检测抗体浓度，并把p/n最大稀释倍数作为最佳浓度。
20.优选的，为了找出最佳诊断试剂条件，进一步对封闭液浓度和时间进行优化，分别选择2％bsa、5％bsa、5％脱脂奶粉、5％bsa和5％脱脂奶粉作为封闭液，并且各封闭0.5、1和2h，通过检测分析，把p/n最大值确定为最佳封闭液和封闭时间；
21.加入p30抗原，分别在37℃恒温培养箱中孵育40min、60min、90min和120min，把p/n最大值底物最佳反应时间；
22.加入37℃恒温培养箱中将hrp标记羊抗兔igg酶标抗体，孵育40min、60min、90min和120min，把p/n最大值酶标抗体反应时间作为最佳时间；
23.在以上条件相同时，加入tmb显色液，常温孵育10min、15min、20min，把p/n最大值显色时间作为最佳时间。
24.优选的，选择5％bsa、5％脱脂奶粉作为封闭液，且封闭时间2h，p30抗原和hrp标记羊抗兔酶标抗体孵育时间均为60min，显色时间15min为最佳检测条件。
25.优选的，所述抗p30蛋白单克隆抗体、抗p30蛋白多克隆抗体中表达蛋白的质粒为重组质粒pet-32a-p30。
26.一种检测非洲猪瘟病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒的敏感性验证方法，将p30抗原梯度稀释成不同浓度，其分为25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml和0.781255ng/ml，以测定酶标孔最大稀释倍数是否为阴性对照孔od值的2.1倍作为敏感性判断标准，所述敏感性是指所述试剂盒可以检测到最低抗原浓度。
27.有益效果：可以有效检出asfv，为非洲猪瘟防控提供了新的技术手段，检测快速、准确且特异性强，对猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒抗原及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原均无反应，为asfv检测产品的开发提供了有效方法和数据支撑，对非洲猪瘟的预防和控制具有重大的意义。
附图说明
28.图1是本发明pet-32a-p30构建示意图。
29.图2是本发明纯化后重组pet-32a-p30蛋白sds-page电泳图。
30.图3是本发明重组pet-32a-p30蛋白的western blot鉴定图。
31.图4是本发明纯化后多抗的sds-page鉴定图。
32.图5是本发明纯化后蛋白的western blot鉴定图。
具体实施方式
33.以下结合说明书附图1-5，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
34.本技术首先通过基因工程技术，构建含有p30基因的重组原核表达载体pet-32a-p30和pet-duet-sumo-p30，通过优化表达条件，选择pet-32a-p30进行后续蛋白的表达和纯化，sds page和western blot鉴定正确的重组蛋白rp30，免疫新西兰大白兔获得抗p30蛋白的多克隆抗体，检测其抗体效价为1:5120000。在此基础上，以rp30、抗p30蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体为材料，通过对封闭液、抗原孵育时间、抗体孵育时间及显色时间等的优化，选择5％bsa和5％脱脂奶粉，封闭时间2h、抗原和酶标抗体孵育时间60min，显色时间15min为最佳检测条件，在实验室条件下初步建立了一套检测asfv血样抗原的双抗体夹心elisa诊断体系。用该诊断试剂检测p30蛋白，最低灵敏度为3.125ng/ml，检测asfv临床样本灵敏度为1:10稀释的血样。对猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒抗原及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原均无反应，其特异性较好。p30蛋白是asfv中由基因cp204l编码的一种结构蛋白，该蛋白在病毒感染早期出现，并持续至整个时期，通常被选定为诊断试剂的首选抗原蛋白。本技术技术方案为asfv检测产品的开发提供了有效方法和数据支撑，对非洲猪瘟的预防和控制具有重大的意义。
35.一、目的基因的获取及表达载体的构建
36.ncbi数据库下载asfv抗原性结构蛋白相对应的基因序列，genebank登录号：aal68657.1，通过大肠杆菌密码子偏好性对该序列进行优化合成并在c端添加6
×
his序列，设计一对特异性的引物，pcr扩增p30基因序列。经过bamhi和xhoi酶切位点进行双酶切，然后克隆到pet-32a和petduet-sumo载体中，转入tg1克隆菌，经过筛选后构建表达重组质粒pet-32a-p30和petduet-sumo-p30。
37.二、目的蛋白的表达纯化
38.将重组质粒pet-32a-p30和petduet-sumo-p30分别转化到bl21和rosetta感受态细胞中，iptg诱导表达、镍柱纯化，sds-page和western blot鉴定该蛋白。具体如下步骤：
39.①
蛋白表达：向lb培养基中按1：100比例接入重组表达菌，加入终浓度为1mm amp抗生素，37℃，220rpm摇菌3-4h，再加入终浓度为1mm iptg诱导，16℃，220rpm诱导培养12h。
40.②
菌体破碎：收集诱导过夜的培养的菌液，4000rpm离心40min获得菌体；加入适量无菌pbs溶液重悬洗涤，12000rpm，4℃离心10min弃上清；用少量预冷的洗涤液重悬菌体，超声破碎仪中破碎，条件为超3s停5s，冰浴超声8min；12000rpm，4℃离心20min弃上清，重悬菌体于溶解液中，4℃，12000rpm离心20min，弃去沉淀，将上清用0.45μm滤膜过滤并置于冰上。
41.③
蛋白纯化：将获得的上清液加入预处理好的镍柱中，结合2h，用含尿素的缓冲液洗涤镍柱5～10min，自然流下溶液目的为了去除杂蛋白；加入含有尿素的复性液，将其放置到摇床上冰浴孵育过夜以复性目的蛋白，最后流去复性液；用含尿素的洗脱液洗脱3次，每次15～20min，洗脱目的蛋白。通过优化表达条件并比较表达量，最终选定重组质粒pet-32a-p30在rosetta中大量表达和纯化。
42.三、目的蛋白多克隆抗体的制备
43.通过背部皮下多点注射方法免疫新西兰大白兔，共持续4次，第0d免疫等量的弗氏完全佐剂和抗原，第10、20和30d每次免疫用弗氏不完全佐剂和抗原。在第0d免疫前首先对
实验兔子进行耳缘静脉取血，将血液静置37℃静置2h分离血清，将分离的血清每管1ml分装放置-20℃作为阴性对照。四次免疫结束后，在第38d对实验兔进行耳缘静脉和心脏取血，同样的方法分离血清。
44.四、asfv双抗夹心elisa方法的建立和优化
45.(1)双抗夹心elisa基本操作方法实验步骤：
46.1)包被抗体：将稀释好的抗p30蛋白单克隆抗体加入96孔酶标板中，每孔100μl，4℃冰箱放置12h。12h后甩去包被液，用elisa洗涤液洗涤4次，每次在振荡仪振荡20s，每次洗涤完将96孔酶标板在吸水纸上反复拍打，保证孔内无液体；
47.2)封闭：每孔加入250μl封闭液，37℃生化培养箱中封闭2h，甩去封闭液，用elisa洗涤液洗涤3次，且每次在振荡仪振荡20s，每次洗涤完都需要将96孔酶标板在吸水纸上反复拍打；
48.3)p30抗原：向每孔中加入提前梯度稀释好的p30抗原，每孔100μl，盖上盖子，并在37℃生化培养箱孵育1h。孵育完成后，参考以上方法用elisa洗涤液洗涤3次；
49.4)检测抗体：每孔中加入稀释好的抗p30蛋白多克隆抗体，37℃生化培养箱放置1h。甩去封闭液，用elisa洗涤液振荡洗涤3次；
50.5)酶标二抗：每孔加入稀释好的hrp标记羊抗兔igg 100μl，盖上盖子，于37℃生化培养箱孵育1h。孵育结束后，同样的洗涤方法洗涤4次；
51.6)显色：每孔加入100μl显色液，常温显色；
52.7)终止显色：每孔加入50μl终止液，终止显色；
53.8)吸光度值测定：保证elisa酶标板底部干净，放入酶标仪中，读取450nm波长下的吸光度值。将待测抗体孔od450数值比阴性对照孔od450数值的2.1倍大，判为阳性。
54.(2)检测条件的优化：
55.根据棋盘法，按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000和1:32000横向稀释捕获抗体包被浓度，按照1:1000、1:2000、1:4000和1:8000纵向稀释检测抗体浓度。并把p(阳性值)/n(阴性值)最大稀释倍数作为最佳浓度。为了找出最佳诊断试剂条件，进一步对封闭液浓度和时间进行优化。分别选择2％bsa、5％bsa、5％脱脂奶粉及5％bsa和5％脱脂奶粉作为封闭液各封闭0.5、1和2h，通过检测分析，把p(阳性值)/n(阴性值)最大值确定为为最佳封闭液和封闭时间。
56.加入p30抗原，分别在37℃恒温培养箱中孵育40、60、90和120min。把p(阳性值)/n(阴性值)最大值底物最佳反应时间。
57.加入37℃恒温培养箱中将hrp标记羊抗兔酶标抗体，孵育40、60、90和120min。把p(阳性值)/n(阴性值)最大值酶标抗体反应时间作为最佳时间。
58.在以上条件相同时，加入tmb显色液，常温孵育10、15、20min，把p(阳性值)/n(阴性值)最大值显色时间作为最佳时间。
59.(3)诊断试剂方法的验证
60.敏感性是指该诊断试剂可以检测到最低抗原浓度。为了检测该诊断试剂的敏感性，我们把p30蛋白梯度稀释成不同浓度：25、12.5、6.25、3.125、1.5625和0.781255ng/ml，以测定酶标孔最大稀释倍数是否为阴性对照孔od值的2.1倍作为敏感性判断标准。
61.elisa特异性来自抗原和抗体的特异性反应，为了验证该诊断试剂是否对其它无
关病毒有反应，本实验分别对猪瘟活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗检验该诊断试剂得特异性。
62.取qpcr检测为阳性和阴性的asfv样本，通过把样本稀释不同浓度，用建立的双抗夹心elisa方法检测，比较检测方法和qpcr结果是否一致，并判断其灵敏度。
63.本技术中涉及的试剂配方：
64.amp存储液：100mg/ml的amp水溶液；
65.iptg存储液：240mg/ml的iptg水溶液；
66.pbs溶液：8g nacl，0.2g kcl，1.44g na2hpo4，0.24g kh2po4溶于ddh2o定容至1l；
67.纯化洗涤液：尿素60.06g，tris 3.03g，edta 0.19g，ddh2o至480ml；充分溶解，调节ph至8.0，并定容到500ml，0.45μm滤膜过滤，4℃保存；
68.纯化溶解液：尿素24.03g，β-巯基乙醇0.23g，ddh2o至50ml，混合均匀，0.45μm滤膜过滤，4℃保存；
69.纯化缓冲液：tris
·
hcl 1.21g，尿素240.3g，精氨酸1.74g，nacl 5.84g，咪唑0.34g，ddh2o至450ml，调节ph至8.0，并定容到500ml，0.45μm滤膜过滤，4℃保存。
70.纯化复性液：tris 0.121g，尿素0.3g，精氨酸0.174g，nacl 5.84g，咪唑0.034g，ddh2o至45ml调节ph至8.0，定容到50ml，0.45μm滤膜过滤，4℃保存。
71.纯化洗脱液：tris 1.21g，尿素3.003g，精氨酸1.74g，nacl 5.84g，咪唑10.215g，ddh2o至450ml，调节ph至8.0，并定容到500ml，0.45μm滤膜过滤，4℃保存。
72.抗原包被缓冲液：1.59g na2co3，2.93g nahco3，ddh2o定容至1l；
73.elisa洗涤液：0.05％tween-20的pbs溶液；
74.elisa封闭液：5％脱脂奶粉，5％bsa的pbs溶液；
75.elisa抗体稀释液：2％脱脂奶粉，1％bsa的pbs溶液；
76.elisa终止液：2m h2so4；
77.原始p30基因序列：
78.gatttcatcctgaatatcagtatgaaaatggaagttatcttcaagaccgatctgcgtagtagcagtcaggttgtttttca
79.tgcaggcagtctgtataattggtttagtgtggaaattatcaacagtggccgcattgttaccaccgccattaagaccctgc
80.tgagtaccgtgaaatatgatattgttaaaagcgcccatatctatgcaggccagggttataccgaacatcaggcacaggaa
81.gaatggaatatgattctgcatgttctgtttgaagaagaaaccgaaagcagtgccagcagcgaaagcattcatgaaaagaa
82.tgataatgagaccaacgaatgcaccagcagttttgaaaccctgtttgaacaggaaccgagcagtgaagaaccgaaagata
83.gcaaactgtatatgctggcccagaaaaccgttcagcatattgaacagtatggtaaagccccggattttaataaggttatt
84.cgcgcccataattttattcagaccattcatggcaccccgctgaaagaagaagaaaaagaagttgtgcgtctgatggttat
85.taagctgctgaaaaagaataagctgctgagccatctgcatctgatgttt
86.优化后p30基因序列：
87.gacttcatcctgaacattagcatgaagatggaagtgatctttaaaaccgacctgcgtagcagcagccaagtggttttcca
88.cgcgggtagcctgtacaactggtttagcgtggaaatcattaacagcggccgtatcgttaccaccgcgattaagaccctgc
89.tgagcaccgtgaagtatgacatcgttaaaagcgcgcacatttacgcgggtcagggctataccgagcaccaggcgcaagag
90.gaatggaacatgatcctgcacgttctgttcgaggaagagaccgaaagcagcgcgagcagcgagagcattcacgaaaagaa
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93.cgtgcgcacaactttatccagaccattcacggcaccccgctgaaggaagaggaaaaagaggtggttcgtctgatggtgat
94.taagctgctgaagaaaaacaaactgctgagccacctgcacctgatgttt
95.表1多克隆抗体效价的测定
[0096][0097]
表2mab包被浓度与p30蛋白多克隆抗体稀释浓度的确定
[0098][0099]
表3elisa诊断试剂盒敏感性检测
[0100][0101]
表4elisa诊断试剂盒特异性检测
[0102][0103]
表5elisa诊断试剂盒临床样品检测
[0104][0105]
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。