人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法及其应用

1.本发明关于中药成分分类鉴定技术领域，尤其涉及一种人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法及其应用。


背景技术：

2.近年，人参属中药在医疗和大健康产业发展中优势凸显，被广为研究和开发利用。尤其是，人参、红参、西洋参、三七、竹节参、珠子参等不同的人参属中药药性不同，在实际应用过程必须精准配伍才能对症下药，故对于含有人参属中药的产品质量而言，药材的鉴别至关重要。中药饮片被粉碎、加工后，常规的性状鉴定、显微鉴定难以将其区分；加之，中国药典对于人参属来源中药的理化鉴别多以人参皂苷为指标，但人参皂苷为人参属来源中药中的主要活性成分，存在于多种人参属来源中药中，且每种人参属来源中药往往含有多种亚型的人参皂苷，故以单一某种或少数几种人参皂苷进行鉴别难以准确区分不同的人参属中药。因此，探索能够精准表征、鉴别人参属中药中不同亚型皂苷成分的方法对于人参属中药及其产品的准确鉴别具有重要意义。


技术实现要素：

3.针对以上技术问题，本发明提供一种人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法及其应用，用该分类鉴定方法能够分类鉴定出567种人参皂苷，可用于人参属中药以及含有人参属中药的产品的表征与鉴别。
4.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
5.一种人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法，用高效液相色谱/质谱联用分析方法分类鉴定所述人参属中药中的人参皂苷；
6.所述质谱为三重四极杆-线性离子阱质谱；采用信息依赖采集-增强产物离子扫描的技术对人参皂苷进行分类鉴定，用mrm-ida-epi模式检测中性皂苷和丙二酸酰化皂苷，用mim-ida-epi模式检测齐墩果酸型人参皂苷。
7.该分类鉴定方法采用信息依赖采集-增强产物离子扫描(ida-epi)的技术对人参皂苷进行分类鉴定。对于中性皂苷和丙二酸酰化皂苷，mrm采集模式与nl和mim模式相比有更好的灵敏度与离子响应，mrm-ida-epi方法得到的有效epi个数高于nl-ida-epi，采集得到的二级碎片丰富度均优于nl-ida-epi和mim-ida-epi，因此针对中性皂苷和丙二酸酰化皂苷选择采用mrm-ida-epi。但实验发现，对于oa型(齐墩果酸型)成分，mim能够捕获到二级的成分远远高于mrm模式，能够捕获更多的未知成分，因此选择mim-ida-epi方法来进行oa型皂苷的表征与鉴定。
8.优选地，所述中性皂苷包括原人参三醇型人参皂苷、原人参二醇型人参皂苷、奥克梯隆型人参皂苷和人参皂苷元。
9.优选地，所述原人参三醇型人参皂苷包括人参皂苷f1，20(s)-人参皂苷rh1，20(r)-人参皂苷rh1，人参皂苷f3，20(s)-三七皂苷a3，人参皂苷f5，三七皂苷r2，20(r)-三七
皂苷r2，人参皂苷rg2，人参皂苷rf，人参皂苷rg1，三七皂苷r1，三七皂苷fp1，人参皂苷re，20-o-葡萄糖基-人参皂苷rf，人参皂苷re2和人参皂苷re3等。
10.优选地，所述原人参二醇型人参皂苷包括人参皂苷rh2，20(r)-人参皂苷rh2，人参皂苷k，人参皂苷f2，人参皂苷rg3，20(r)-人参皂苷rg3，三七皂苷fe、人参皂苷rd2，三七皂苷k，人参皂苷rd，绞股蓝皂苷xvii，人参皂苷rb2，人参皂苷rb3，人参皂苷rc，人参皂苷ra1，人参皂苷ra2，三七皂苷r4和三七皂苷t等。
11.优选地，所述奥克梯隆型人参皂苷包括24(r)-拟人参皂苷rt5和24(r)-拟人参皂苷f11等。
12.优选地，所述人参皂苷元包括20(s)-原人参三醇，20(s)-原人参二醇，齐墩果酸和20(s),24(r)-奥克梯隆苷元等。
13.优选地，所述人参皂苷还包括人参皂苷rk3，人参皂苷rh4，三七皂苷t5，人参皂苷rg5，人参皂苷rg6，人参皂苷f4，人参皂苷rk1，5,6-脱氢人参皂苷rd，越南参皂苷r8和5,6-脱氢人参皂苷rb1等。
14.优选地，所述齐墩果酸型人参皂苷包括竹节参皂苷iva，竹节参皂苷iv，拟人参皂苷rt1和人参皂苷ro等。
15.优选地，所述丙二酸酰化皂苷包括丙二酸酰基人参花蕾皂苷re1，丙二酸酰基人参皂苷rd，丙二酸酰基人参皂苷rc，丙二酸酰基人参皂苷rb2和丙二酸酰基人参皂苷rb1等。
16.优选地，所述高效液相色谱的色谱条件为：
17.色谱柱：极性修饰十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
18.流动相a为乙腈，流动相b为0.1％v/v甲酸-水溶液，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
[0019][0020]
流速：0.28～0.32ml/min；
[0021]
柱温：30～40℃。
[0022]
液相色谱中流动相的选择对于不同性质成分的出峰情况以及峰型均有影响，本发明所采用的流动相以及线性洗脱程序能够提高不同人参皂苷的分离度并减少拖尾现象，且
各成分在该流动相下的峰面积较大，有利于各成分的有效分类鉴定。
[0023]
以上线性梯度洗脱程序中，如果不同时间后流动相a与流动相b的体积百分比有变化，则表示流动相在该时间段内是线性变化的，如，0min流动相a的比例为12％，6min流动相a的比例为20％，表示流动相a在0至6min从12％线性增加到20％。45min与41min的流动相比例相同，表示这个时间段内流动相比例不变。
[0024]
优选地，所述色谱柱为beh shield rp18。在本发明的色谱条件下，采用该色谱柱可达到更好的分离度、峰型以及色谱峰出峰个数。
[0025]
优选地，所述柱温为40℃。在本发明的色谱条件下，柱温40℃时可达到更多的出峰个数以及更好分离度。
[0026]
优选地，所述流速为0.3ml/min。
[0027]
优选地，所述质谱采用q-trap 4500三重四极杆-线性离子阱质谱仪。
[0028]
优选地，所述质谱的离子源为电喷雾离子源，在负离子模式下采集数据；所述离子源的参数为：离子化电压(ionspray voltage)为-4500v，温度(temperature)为550.0℃，气帘气(curtain gas)为35.0psi，喷雾气1(gas 1)为55.0psi，辅助加热气2(gas 2)为55.0psi，碰撞气(collision gas)为high，碰撞室出口电压(collision cell exit potential)为-13.0v。
[0029]
优选地，所述mim-ida-epi模式中的碰撞能量(ce值)为70ev～100ev，mrm-ida-epi模式中的碰撞能量为70ev～120ev；信息依赖采集响应强度为1～2。
[0030]
去簇电压(dp)能够给予离子一定的共振能量，阻止溶剂分子的吸附，实现去簇。若是去簇电压过大时，离子会因共振而碎裂，导致源内裂解(cid)。碰撞能量(ce)对于化合物解析表征与鉴定起着重要的作用。信息依赖采集响应强度可对epi总数产生影响。通过对关键质谱参数优化，可提高仪器的灵敏度，有助于化合物数据的精准分析与鉴定。
[0031]
以及，本发明还提供上述人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法在人参皂苷表征与鉴定中的应用。以上方法能够鉴别出人参属中药中的多种皂苷，可用于对人参属中药的鉴别以及对含有人参属中药的中成药进行人参皂苷的表征与鉴定。
[0032]
本发明的有益效果在于：本发明提供的人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法在分类鉴定人参皂苷过程中所得色谱峰具有良好的分离度和较大的峰面积，能够分类鉴定出567种人参皂苷，可通过人参皂苷的表征和鉴别来辅助人参属中药及含有人参属中药的中成药的质量控制。
附图说明
[0033]
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0034]
图1是本发明实施例2中齐墩果酸型皂苷预测流程图；
[0035]
图2是本发明实施例2中中性皂苷裂解示意图；
[0036]
图3是本发明实施例2中丙二酸酰化皂苷裂解示意图；
[0037]
图4是本发明实施例2中齐墩果酸型皂苷裂解示意图；
[0038]
图5是本发明对比例1中不同流动相添加剂比较图；图中noto-r1、re、rb1、m-rb2、p-f11、ro、chiku-iva、m-floral-re1分别代表三七皂苷r1、人参皂苷re、丙二酸酰基人参皂苷rb1、24(r)-拟人参皂苷f11、人参皂苷ro、竹节参皂苷iva、丙二酸酰基人参花蕾皂苷re1；
[0039]
图6是本发明对比例2中10根反相色谱柱sim色谱图中分离的峰个数比较图；
[0040]
图7是本发明对比例3中色谱分离中beh shield rp18色谱柱柱温比较图；
[0041]
图8是本发明对比例4中不同采集模式与mrm-ida-epi方法比较图。
[0042]
图9是本发明对比例5中不同去簇电压下的结果比较；图中noto-r1、re、rb1、m-rb2、p-f11、ro、chiku-iva、m-floral-re1分别代表三七皂苷r1、人参皂苷re、丙二酸酰基人参皂苷rb1、24(r)-拟人参皂苷f11、人参皂苷ro、竹节参皂苷iva、丙二酸酰基人参花蕾皂苷re1；
[0043]
图10是本发明对比例5中nl46-ida-epi模式下nl中不同碰撞能量值下的结果比较；
[0044]
图11是本发明对比例5中nl46-ida-epi模式下epi中不同碰撞能量值下的结果比较；
[0045]
图12是本发明对比例5中nl44-ida-epi模式下nl中不同碰撞能量值下的结果比较；
[0046]
图13是本发明对比例5中nl44-ida-epi模式下epi中不同碰撞能量值下的结果比较；
[0047]
图14是本发明对比例5中mim-ida-epi模式下不同碰撞能量比较图；
[0048]
图15是本发明对比例5中不同信息依赖采集响应强度的结果比较。
具体实施方式
[0049]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0050]
人参皂苷属于三萜皂苷，根据人参皂苷的化学性质，大致可分为中性皂苷、丙二酸酰化皂苷和酸性皂苷，其中，中性皂苷包括ppd型(原人参二醇型)、ppt型(原人参三醇型)和ot型(奥克梯隆型)，含ppd型或ppt型苷元的人参皂苷为最常见的人参皂苷，和ot型皂苷一起可结合甲酸形成甲酸加合离子；丙二酸酰化皂苷是一种特殊存在的皂苷形式，很容易丢失co2(44.01da)和c3h2o3(86.00da)，尤其是丢失co2基团；酸性皂苷包括oa型皂苷多数存在于竹节参中，特点为无明显的甲酸加合离子。针对人参皂苷不同的化学性质，本发明实施例基于超高效液相与三重四极杆-线性离子阱质谱仪构建的了多种“信息依赖采集-增强产物离子扫描(ida-epi)”技术结合非靶向与靶向扫描技术对人参属多来源药材进行全方位分类表征与鉴定。由于中性皂苷和丙二酸酰化皂苷容易丢失46da和44da，中性皂苷在流动相中加甲酸情形时容易加合甲酸基团46，丙二酸酰化皂苷容易丢失co2基团44，oa型皂苷本身呈酸性，不容易与甲酸加合，具有无明显加合形式且无明显丢失碎片，本发明实施例分别构建了mrm-ida-epi方法进行中性皂苷和丙二酸酰化皂苷成分的采集，确定了mim-ida-epi方法用来捕获oa型皂苷，针对不同性质的成分具有较好的互补性和目标性，系统地实现了人参属不同品种药材成分的分类捕获。
[0051]
以下实施例中所采用的试剂和药品：
[0052]
乙腈(fisher,fair lawn,nj,usa)，甲醇(fisher,fair lawn,nj,usa)，甲酸fisher,fair lawn,nj,usa)均为lc-ms级。去离子水经milli-q系统(millipore,bedford,
ma,usa)纯化。
[0053]
60个对照品主要分为：
[0054]
18个原人参三醇型人参皂苷(ppt)：人参皂苷f1(1)，20(s)-人参皂苷rh1(2)，20(r)-人参皂苷rh1(3)，人参皂苷f3(4)，20(s)-三七皂苷a3(5)，人参皂苷f5(6)，三七皂苷r2(7)，20(r)-三七皂苷r2(8)，人参皂苷rg2(9)，人参皂苷rf(10)，人参皂苷rg1(11)，三七皂苷r1(12)，三七皂苷fp1(13)，人参皂苷re(14)，20-o-葡萄糖基-人参皂苷rf(15)，人参皂苷re2(16)，人参皂苷re3(17)；
[0055]
22个原人参二醇型人参皂苷(ppd)：人参皂苷rh2(19)，20(r)-人参皂苷rh2(20)，人参皂苷k(21)，人参皂苷f2(22)，人参皂苷rg3(23)，20(r)-人参皂苷rg3(24)，三七皂苷fe(25)，人参皂苷rd2(26)，三七皂苷k(27)，人参皂苷rd(28)，绞股蓝皂苷xvii(29)，人参皂苷rb2(31)，人参皂苷rb3(32)，人参皂苷rc(33)，人参皂苷ra1(37)，人参皂苷ra2(38)，三七皂苷r4(39)，三七皂苷t(40)；
[0056]
2个奥克梯隆型人参皂苷(ot)：24(r)-拟人参皂苷rt5(45)，24(r)-拟人参皂苷f11(46)；
[0057]
四个人参皂苷元：20(s)-原人参三醇(57)，20(s)-原人参二醇(58)，齐墩果酸(59)，20(s),24(r)-奥克梯隆苷元(60)；
[0058]
其他中性皂苷：人参皂苷rk3(47)，人参皂苷rh4(48)，三七皂苷t5(49)，人参皂苷rg5(50)，人参皂苷rg6(51)，人参皂苷f4(52)，人参皂苷rk1(53)，5,6-脱氢人参皂苷rd(54)，越南参皂苷r8(55)，5,6-脱氢人参皂苷rb1(56)；
[0059]
4个齐墩果酸型人参皂苷(oa)：竹节参皂苷iva(41)，竹节参皂苷iv(42)，拟人参皂苷rt1(43)，人参皂苷ro(44)；
[0060]
5个丙二酸酰化皂苷：丙二酸酰基人参花蕾皂苷re1(18)，丙二酸酰基人参皂苷rd(30)，丙二酸酰基人参皂苷rc(34)，丙二酸酰基人参皂苷rb2(35)，丙二酸酰基人参皂苷rb1(36)。
[0061]
上述对照品全部来自于上海诗丹德生物技术有限公司及成都德斯特生物技术有限公司。
[0062]
人参属中药样品分别为五加科植物人参(产自吉林省长白山，5-6年生)、红参(产自吉林省长白山，5年生)、西洋参(产自美国威州，长型巨大)、三七(产自云南文山，20头)、竹节参(产自四川)、珠子参(产自四川)、人参叶(产自吉林省长白山)。
[0063]
以下实施例中所采用的分析仪器：
[0064]
i-class超高效液相系统，q-trap 4500三重四极杆-线性离子阱质谱仪(applied biosystems-sciex scientific,concord,canada)。
[0065]
实施例1
[0066]
本发明实施例提供了一种人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法，用高效液相色谱/质谱联用分析方法分类鉴定人参属中药样品(人参、红参、西洋参、三七、竹节参、珠子参、人参叶)中的人参皂苷；
[0067]
样品溶液的制备：
[0068]
分别取药典收载的7种人参属中药的不同批次样品(人参、红参、西洋参、三七、竹节参、珠子参、人参叶)粉末各25mg，加70％的甲醇-水溶液(v/v)5ml溶解，并涡旋震荡2min，
超声提取1h，提取液冷却后用70％甲醇-水溶液补足失重，并14000rpm(11481g)离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜过滤，制得浓度为5mg/ml的人参属中药样品溶液，取100μl滤液用于lc-ms分析。
[0069]
高效液相色谱分析在i-class超高效液相系统下完成，色谱条件具体如下：
[0070]
色谱柱：beh shield rp18(2.1
×
100mm，1.7μm)；
[0071]
流动相：乙腈(a)，0.1％v/v甲酸-水溶液(b)；
[0072]
柱温：40℃；
[0073]
流速：0.3ml/min；
[0074]
进样量：3μl；
[0075]
进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
[0076][0077]
以q-trap 4500三重四极杆-线性离子阱质谱作为分析的检测器，质谱条件为：
[0078]
离子源为电喷雾离子源，离子化电压为-4500v，温度为550.0℃，气帘气为35.0psi，喷雾气1为55.0psi，辅助加热气2为55.0psi，碰撞气为high，碰撞室出口电压为-13.0v。
[0079]
采用以上参数，设定进样量为3μl，对七个人参属中药样品进行三种母离子列表两种采集方法的靶向采集，用mrm-ida-epi模式检测中性皂苷和丙二酸酰化皂苷，用mim-ida-epi模式检测齐墩果酸型人参皂苷。mim-ida-epi模式中的ce值为70ev～100ev，mrm-ida-epi模式中的ce值70ev～120ev；信息依赖采集响应强度为1～2。数据分析采用analyst(1.6.3)软件。
[0080]
实施例2
[0081]
本发明实施例提供了实施例1的人参属中药皂苷成分的分类鉴定方法在人参属中药皂苷成分的表征与鉴定中的应用。
[0082]
按实施例1的液相色谱条件和质谱条件对人参属中药皂苷成分进行分类鉴定，采用信息依赖采集-增强产物离子扫描(ida-epi)的技术对人参皂苷进行表征与鉴定，用mrm-ida-epi模式检测中性皂苷和丙二酸酰化皂苷，用mim-ida-epi模式检测齐墩果酸型人参皂
苷。mim-ida-epi模式中的ce值为70ev～100ev，mrm-ida-epi模式中的ce值70ev～120ev；信息依赖采集响应强度为1～2。
[0083]
1、离子对的构建
[0084]
(1)人参皂苷母离子列表构建
[0085]
先根据oa型皂苷已知结构特征预测可能存在的结构(苷元+糖基+取代基)，构建“oa型皂苷数据库”。根据已知报道的oa型苷元结构，共统计出此类皂苷特点如下；已报道的oa型皂苷共有44种，如表1所示，糖基质量数为5种，取代基4种(-ch2/-c2h4/-c3h6/-c4h8)。
[0086]
表1已报道齐墩果酸型皂苷信息表
[0087]
[0088][0089]
根据以上规律，本发明通过对44种皂苷结构中含有的糖基数和取代基个数进行总结，在已知齐墩果酸型皂苷原来的结构基础上进行糖基和取代基的预测：设定分子设计规则为在预测过程中连接在每种齐墩果酸型苷元上5种糖基数目最少为1个，最多不超过6个，非糖取代基数目最多不超过2个、最少为1个，最终预测的糖基数与取代基个数均包含已知皂苷结构中已有的个数，均满足规则的情况即可。
[0090]
依据此规则对oa型皂苷数据库进行扩展预测，共构建了8905个分子式，其中包括了已知的齐墩果酸型皂苷，对预测的所有质量数进行去重复，最终得到338个不同的质量数，作为oa型人参皂苷预测母离子输入mim方法的列表，并用于人参属来源中药数据的靶向
采集。oa型分子预测流程图如图1所示。
[0091]
(2)mrm离子对构建
[0092]
对q1传输的母离子，经过ida模式进行条件选择后，送入q3得到子离子，通过母离子与子离子匹配的方式确认该成分再送入离子阱中进行裂解。对中性皂苷、丙二酸酰化皂苷离子对进行确认，统一标准为考察nl(46/44)-ida-epi模式下采集的七种人参属来源中药样品的数据，找到列表中的质量数为[m
–
h]
－
峰，作为mrm模式的母离子，而每个成分对应响应最强的二级碎片作为子离子，构建用于mrm-ida-epi模式采集的离子对。最终中性皂苷得到106个离子对，丙二酸酰化共23个离子对，mim-ida-epi模式中分子预测能够捕捉到二级碎片的成分质量数共有150个，用于人参属多品种来源药材的数据采集与鉴定。
[0093]
2、人参皂苷的表征与鉴定
[0094]
(1)基于mrm-ida-epi数据的中性人参皂苷的表征与鉴定
[0095]
将得到鉴定的数据与实验室已有的标准品进行对照，确定了一些人参皂苷成分。中性皂苷中包含ppt型、ppd型和ot型三大类，容易加合甲酸离子，形成[m
–
h+hcooh]-，本实施例从七种人参属来源中药鉴定的结果中挑选具有代表性的成分，对其鉴定结果进行描述。以化合物#275为例说明中性皂苷的裂解行为，二级裂解过程如图2所示，该化合物脱掉一个甲酸分子后得到分子离子峰m/z 945.5，失去一分子葡萄糖后得到m/z 783.4([m
–h–
glc]-)的碎片，继续丢掉一个鼠李糖分子得到碎片m/z 637.3([m
–h–
glc]-)，再继续丢失一个葡萄糖分子得到ppt型特征苷元碎片m/z 475.3([ppt
–
h]-)；与标准品比对保留时间和二级碎片等后，最终将该化合物#275鉴定为人参皂苷re。根据对化合物#275的鉴定过程，再继续根据其裂解规律对未知成分305进行鉴定，如图2所示，分子离子峰m/z 959.3失去一个鼠李糖后得到m/z 797.4的碎片，继续失去一个葡萄糖醛酸分子后得到637.2的碎片，最后失去一个葡萄糖分子得到苷元碎片m/z 475.4，根据二级碎片裂解结果，最终将化合物#305鉴定为原人参三醇-葡萄糖基-葡萄糖醛酸基-鼠李糖苷(ppt-glc-glca-rha)。
[0096]
(2)基于mrm-ida-epi数据的丙二酸酰化人参皂苷的表征与鉴定
[0097]
基于所建立的丙二酸酰化皂苷离子对列表，采用mrm-ida-epi方法对人参属来源中药中的丙二酸酰化类皂苷进行鉴定。丙二酸酰化人参皂苷的特点是在裂解过程中容易丢失co2和c3h2o3，从而得到分子离子峰。以化合物#499为例说明丙二酸酰化类皂苷的裂解行为，二级裂解过程如图3所示，该化合物m/z 1163.6，丢掉一个丙二酸酰基团，得到1077.6，接着继续得到碎片m/z 945.6、783.4、621.5、459.5和375.4，根据质量数推算分别丢失一个木糖和三个葡萄糖，和丙二酸酰基人参皂苷rc产生的碎片基本相同，最终将化合物#499与标准品比对，将其鉴定为丙二酸酰基人参皂苷rc。对于未知化合物#348(1017.4-637.4)，如图3所示，丢失86da后的中性部分的分子离子峰为m/z 931.4([m
–h–
mal]
－
)，继续丢失一个木糖分子，得到碎片m/z 799.4([m
–h–
xyl
–
mal]-)；再丢失两个葡萄糖分子得到ppt型皂苷苷元碎片m/z 475.3([ppt
–
h]
－
)和391.2，根据裂解情况与碎片，将化合物#348鉴定为丙二酸酰基原人参三醇-双葡萄糖基-木糖苷(ppt
–
2glc
–
xyl
–
mal)。
[0098]
(3)基于mim-ida-epi数据的oa型人参皂苷的表征与鉴定
[0099]
根据苷元结构特征，人参属还有一类皂苷为oa型皂苷，在竹节参和珠子参中富含此类皂苷，其特点为无明显加合甲酸的母离子，因此本发明实施例采用mim-ida-epi方法对此类成分进行捕获。以化合物#167为例说明oa型皂苷的裂解行为，如图4所示，化合物#167
(m/z 925.5，925.5-569.4)，其裂解过程中出现明显的二级碎片m/z 793.3、631.3和455.3，根据质量数推算，分别代表着此成分在裂解过程中丢失一个木糖，一个葡萄糖和一个葡萄糖醛酸分子，通过与文献中报道的结构与标准品对照，确定该成分竹节参皂苷iv。根据oa型已知成分的裂解特征，根据二级碎片对未知化合物#271(m/z 981.5，981.5-793.3)进行解析。如图4所示，能够看到低质量端出现oa型特征性碎片m/z 455.3，暂时可认为该成分为oa型皂苷；由m/z 981.5得到碎片m/z 793.3，丢失188da，推测可能对应一个鼠李糖和一个乙酰基；另外，二级碎片m/z 793.3、613.3以及苷元碎片m/z 455.3，推测脱掉一个葡萄糖与一个葡萄糖醛酸分子。所以最终将化合物#271鉴定为乙酰化齐墩果酸-葡萄糖醛酸基-葡萄糖基-鼠李糖苷(oa-glca-glc-rha-ac)。
[0100]
本实施例通过上述负离子模式结合多种“ida-epi”模式对七种人参属来源中药进行表征和鉴定，采用mrm-ida-epi方法鉴定(或推导)中性皂苷，鉴定出各人参属中药样品中含有的中性皂苷的种类数量为：人参68种，红参59种，西洋参44种，三七65种，竹节参62种，珠子参56种，人参叶63种；鉴定出各人参属中药样品中含有的丙二酸酰化皂苷的种类数量为：人参16种，红参10种，西洋参14种，三七15种，竹节参14种，珠子参16种，人参叶25种；采用mim-ida-epi方法鉴定齐墩果酸型皂苷，鉴定出各人参属中药样品中含有的齐墩果酸型皂苷的种类数量为：人参23种，红参16种，西洋参25种，三七20种，竹节参36种，珠子参29种，人参叶20种。
[0101]
对比例1
[0102]
本对比例列举了不同流动相对人参皂苷检测的影响：流动相a均为乙腈，流动相b分别采用0.1％v/v甲酸-水溶液、0.1％v/v乙酸-水溶液、3mm/l甲酸铵-水溶液以及3mm/l醋酸铵水溶液。其他色谱条件同实施例1。
[0103]
本对比例从中性皂苷、oa型皂苷和丙二酸酰化皂苷中选择了8个标准品(三七皂苷r1、人参皂苷re、丙二酸酰基人参皂苷rb1、24(r)-拟人参皂苷f11、人参皂苷ro、竹节参皂苷iva、丙二酸酰基人参花蕾皂苷re1、丙二酸酰基人参皂苷rb2)作为指标成分来评价以上流动相对人参皂苷检测结果的影响，统计不同流动相下化合物的峰面积，如表2所示。
[0104]
表2不同流动相添加剂下不同成分的峰面积表
[0105][0106]
由上表可直观看出在四种流动相中每个化合物的峰面积，除了竹节参皂苷iva和
rp18为59个。结果如图6所示。由该结果可见，beh shield rp18色谱柱出峰个数最多。
[0123]
以上各色谱柱均可得到良好峰形。
[0124]
综合以上结果可见，beh shield rp18在分离度、峰型以及色谱峰出峰个数方面均优于其他色谱柱。
[0125]
对比例3
[0126]
本对比例比较了不同柱温对人参皂苷检测的影响：柱温分别选择25℃、30℃、35℃、40℃，其他色谱条件同实施例1。分别考察响应值0.5e6以上的峰个数，结果如图7所示，25℃出峰个数为50个，30℃出峰个数56个，35℃出峰个数53个，40℃出峰个数59个。柱温为40℃时出峰个数最多，分离度最好，25℃时对于ppd和ppt型皂苷分离度较差，30℃时对于oa型和ppt型皂苷分离度较差，35℃时对于丙二酸酰化类皂苷和oa型皂苷分离度较差，40℃时虽然1031和793分离不是很好，但其他的成分分离较好，经过优化后，峰个数增加了9个。综合以上结果可见，柱温40℃时可达到更多的出峰个数以及更好分离度。
[0127]
对比例4
[0128]
本对比例考察了不同采集模式对人参皂苷检测的影响：
[0129]
设定mrm-ida-epi采集中性皂苷的列表为m1，采集丙二酸酰化皂苷的列表为m2，采集oa型皂苷的列表为m3。将m1作为母离子列表的mrm-ida-epi方法与nl46-ida-epi进行比较，发现mrm-ida-epi方法获得的epi总数和有效的epi个数更多；m2作为母离子列表的mrm-ida-epi方法与nl44-ida-epi方法进行比较，虽然后者获得的epi个数远远超出前者，但mrm-ida-epi方法得到的有效epi个数高于nl-ida-epi。因此针对中性皂苷和丙二酸酰化皂苷选择采用mrm-ida-epi更加有优势。
[0130]
结合二级谱图质量与碎片丰富度来分析，选择不同方法下相同保留时间下的相同成分，针对二级谱图质量以及碎片的丰富程度进行分析，结果如图8所示。图中分别将mrm-ida-epi方法与中性皂苷和丙二酸酰化皂苷采用的nl-ida-epi方法、oa型皂苷采用的mim-ida-epi方法平行比较，结果发现三种皂苷中在mrm-ida-epi方法采集得到的二级碎片丰富度均优于nl-ida-epi和mim-ida-epi；虽然mrm-ida-epi方法对于oa型皂苷二级响应更高，但是从能够触发epi个数上来分析，mim-ida-epi方法能够捕获更多的未知成分。
[0131]
不同采集模式与mrm-ida-epi方法比较结果如表3所示。
[0132]
表3不同采集模式与mrm-ida-epi方法比较结果
[0133]
[0134]
对比例5
[0135]
本对比例考察了不同质谱参数对人参皂苷检测的影响：
[0136]
1、选取了代表性成分的混标样品(三七皂苷r1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、24(r)-拟人参皂苷f11、人参皂苷ro、竹节参皂苷iva、丙二酸酰基人参花蕾皂苷re1、丙二酸酰基人参皂苷rb2)，考察dp值20、40、60、80、100、120时加合离子eic峰面积与最高响应值。取3针数据，每个指标成分计算两者的平均值与rsd值。三种扫描方法针对不同的结构亚型，根据中性、酸性、丙二酸酰化皂苷分类评价获得最优dp值。如图9所示。
[0137]
结论：针对中性皂苷(ppd/ppt/ot)类成分，三七皂苷r1、人参皂苷re、人参皂苷rb1在dp值为20时，加合离子的相应强度最高，丙二酸酰基人参皂苷rb2在dp值为40时相应强度最高，但和20时相差很小，24(r)-拟人参皂苷f11在dp值为20时相应强度最高；针对oa型皂苷，目标成分人参皂苷ro在dp值为60和80时相应强度最好，且相差很小，竹节参皂苷iva在dp值为60时相应强度最好；针对丙二酸酰化类皂苷，丙二酸酰基人参花蕾皂苷re1在dp值为20时较好，丙二酸酰基人参皂苷rb2在dp值为60时最好。综上，nl46-ida-epi模式中最佳dp值为20ev，nl44-ida-epi和mim-ida-epi模式中最佳dp值为60ev。
[0138]
2、考察针对nl中的ce值与epi中的ce值：
[0139]
(1)nl46-ida-epi模式下nl中的ce值
[0140]
在每个ce值下(18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60)分别采集1针，考察中性皂苷能够引起epi的母离子个数。结果如图10所示，选择699.5、683.5、815.5、829.5、845.5、977.3、991.6、1007.6、1033.4、1165.5、1123.7、1153.7、1255.5、1285.7作为评价ce值的目标质量数，根据能够触发epi母离子个数的情况可见，最佳nl的ce值为54ev。
[0141]
(2)nl46-ida-epi模式下epi的ce值
[0142]
采用两步法进行二级碰撞能量的优化。首先中性皂苷采用nl-ida-epi扫描模式每个ce值下(40、60、70、80、90、100、120、140)进样1针，再设定动态ce值，选出较好的ce值范围，根据二级谱图的质量，从分子离子到苷元离子较平衡的二级质谱图来进行考察，第二步确定较合适的能量范围为70、80、90、100、110、120，根据二级谱图质量再继续设置动态能量范围，考察中性皂苷中能够引起的epi的母离子个数。如图11所示，根据二级碎片情况，较好的两个能量范围是80ev～120ev和60ev～120ev，针对1个糖的皂苷，60ev～120ev能量较好，碎片质量能够体现出皂苷元、二级碎片和母离子，但糖个数为4、5个的皂苷碎裂情况差，而80ev～120ev中糖个数为4和5个的皂苷碎片质量较好，而1个糖的皂苷较弱，但人参皂苷总体结构中糖个数的皂苷居多，因此80ev～120ev更佳。
[0143]
(3)nl44-ida-epi模式下nl中的ce值
[0144]
在每个ce值下(18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60)分别采集1针，考察丙二酸酰化皂苷能够触发epi的母离子个数。选择1325、1295、1193、1179、1177、1163、1047、1031、1017、959、885、869作为评价ce值的目标质量数，根据能够触发epi母离子个数的情况，如图12所示，最佳nl的ce值为54ev。
[0145]
(4)nl44-ida-epi模式下epi的ce值
[0146]
在每个ce值下(70、80、90、100、110、120)分别采集1针，根据二级碎片情况再继续设置动态能量范围，考察二级质谱图的质量(不分结构亚型，所有亚型都适用)：从分子离子到苷元离子较平衡的二级质谱图，根据单一能量初步优化，结果显示-80ev和-90ev裂解情
况稍好，设置动态ce值为80ev～120ev、70ev～110ev、80ev～100ev、90ev～110ev、70ev～100ev，如图13所示，根据二级碎片情况，较好的能量范围是70ev～110ev，相比其他能量范围，此能量范围时不同糖个数的皂苷二级谱图中均能显示母离子、碎片以及皂苷元，且强度较均匀，碎片显示较多，因此epi的更佳ce值为70ev～110ev。
[0147]
(5)mim-ida-epi模式下的ce值
[0148]
选择质量数1189.6、1599.9、1157.5、955.5、925.5、793.4进行能量优化，如图14考察目标成分质量数的二级碎片情况。采集ce值为50、60、70、80、90、100、110、120时的数据，再设置动态ce值范围。70ev和80ev针对高质量数能量稍小，90ev和100ev对于低质量数有些稍高，无母离子碎片，当设置70ev～100ev动态能量范围作为碰撞能量时，二级碎片的质量及完整性较好，能清晰看到母离子、二级碎片以及苷元，因此最佳ce值范围为70ev～100ev。
[0149]
mrm-ida-epi模式是基于两部分nl(46/44)-ida-epi采集结果所建立的方法，因此mrm-ida-epi采集方法的最佳ce值为70ev～120ev。
[0150]
3、信息依赖采集响应强度
[0151]
信息依赖采集响应强度分别设置了1～2、1～3和1～5，参考标准为考察采集到的母离子列表中捕获能够触发epi的总个数以及总个数中有效的epi个数(指的是ms2谱图能够用于鉴定，清晰地得到二级碎片)，统计结果如图15所示。其中设置为1～2时能够得到的epi总数为203个，有效的epi个数为177个；1～3能够得到的epi总数为182个，有效的epi为170个；1～5能够得到的epi总数为201个，有效的epi为173个。综合以上数据，最佳信息依赖采集响应强度为1～2。
[0152]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。