Ras相关蛋白Rab-8A及其多肽片段作为尿液参比标志物的应用的制作方法

本发明涉及尿液外泌体ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段的新用途，具体涉及ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段作为尿液外泌体的稳定表达蛋白，具有在儿童、青少年、中年及老年整个人体生命周期尿液稳定表达特点，可作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测，外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。

背景技术：

1、rab gtpases 属于小g蛋白超家族成员中的一种，通常被认为是小膜囊泡运输的主要调节剂，同时也是细胞内吞和分泌系统中各种细胞器和囊泡的特异性标记和识别物。目前研究发现的rab蛋白近70余种，主要存在于细胞核、线粒体、高尔基体及内涵体等真核细胞中几乎所有与膜相关的细胞器内。它们通过胞吞、胞吐的方式参与内吞体、吞噬体以及外泌体等囊泡的运输。

2、rab蛋白结构为单体形式的鸟苷三磷酸（guanosine triphosphatase，gtp）结合蛋白，约由200个氨基酸组成，能够结合gtp并将其水解。rab蛋白结构中具有一些共性特征，例如保守的g结构域和高度可变的n端和c端。rab蛋白在执行功能时，在鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate，gdp）结合和gtp结合两种构象中循环。活化的rab为gtp-rab结合形式位于胞膜而未活化状态的rab与gdp结合位于胞浆内，已有研究表明rab蛋白参与囊泡转运、吞噬体成熟、马达分子调控及抑制神经细胞等生物过程。

3、rab8a是rab 蛋白家族中的一种。研究发现rab8a在自噬体成熟过程中起到关键作用，通过控制自噬通量，进而维护机体内环境稳态。作为纤毛生长机制的重要组成部分，rab8定位于纤毛形成过程中的初级纤毛膜，在转导细胞外环境中的各种环境信号中有着至关重要的作用。除此之外，rab8是极化运输的重要调节剂，参与反高尔基网络至基底外侧质的膜运输，突起形成和纤毛发生。rab8a的稳定存在维护了机体的正常运行与发育，是发育过程中不可或缺的蛋白。本研究rab8a在不同年龄分组的人群尿液外泌体中普遍存在，且组间无差别稳定表达。

4、与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后很快被代谢并排泄入尿液，其在尿液中被检测到的概率较血中大幅增加；尿中可能的蛋白降解过程在样本收集前已经完成，尿蛋白可在较长时间内保持稳定。外泌体具有膜性囊泡结构，分子稳定性高，尿液外泌体蛋白质组学研究将二者优势结合，具备良好生物标志物来源的特质。本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现将无创、方便、快捷、易重复的尿液外泌体稳定表达蛋白应用于尿液内参标志物、尿液外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种尿液外泌体ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测，外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。

2、优选地，所述尿液外泌体ras相关蛋白rab-8a的氨基酸序列包括seq id no.1所示（maktydylfk llligdsgvg ktcvlfrfse dafnstfist igidfkirti

3、eldgkriklq iwdtagqerf rtittayyrg amgimlvydi tneksfdnir nwirnieehasadvekmilg nkcdvndkrq vskergekla ldygikfmet sakaninven afftlardik akmdkklegnspqgsnqgvk itpdqqkrss ffrcvll ）；或由seq id no:1所示的氨基酸序列衍生的，且与seqid no:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

4、优选地，所述制剂为尿液外泌体ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段检测试剂盒。

5、优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

6、优选地，所述检测方法包括直接检测ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

7、优选地，所述检测方法包括直接检测ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

8、优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

9、优选地，所述标准品包括ras相关蛋白rab-8a标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：ras相关蛋白rab-8a质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

10、优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

11、发明人首先收集不同年龄段男性及女性健康人尿液标本，参照人类尿液蛋白质组计划(human urine proteome project，hkupp)和欧洲肾脏和尿液蛋白质组(europeankidney and urine proteomics, eurokup)组(http://www.eurokup.org)标准操作程序对尿液外泌体的提取，通过透射电子显微镜、外泌体纳米微粒追踪检测及蛋白免疫印迹对尿液外泌体进行鉴定，通过液相二级质谱技术（liquid chromatography tandem massspectrometry，lc-ms/ms)，采用数据非依赖性扫描模式（data-independent acquisition，dia），构建正常人群尿液外泌体蛋白质图谱，通过生信分析尿液外泌体稳定无差异表达蛋白ras相关蛋白rab-8a，发明人利用蛋白免疫印迹法对不同性别不同年龄健康人尿液外泌体ras相关蛋白rab-8a及其含量进行了验证。

12、本发明通过研究证实，健康人尿液外泌体rab8a及其多肽片段稳定表达，从而提出检测尿液外泌体ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段可用于尿液内参标志物、尿液外泌体、健康人群及相关疾病患者的各种目的应用检测。

13、本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液外泌体ras相关蛋白rab-8a及其多肽片段。

14、为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。