神经导向分子5A及其多肽片段作为尿液参比标志物的应用的制作方法

本发明涉及尿液外泌体神经导向分子5a及其多肽片段的新用途，具体涉及神经导向分子5a及其多肽片段作为尿液外泌体的稳定表达蛋白，具有在儿童、青少年、中年及老年整个人体生命周期尿液稳定表达特点，可作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测，外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。

背景技术：

1、神经导向分子5a（semaphorin-5a，sema 5a）是神经轴突导向分子家族成员之一，其最初是在脑神经生长、发育过程中得到一定程度的认识，其主要功能是起化学排斥作用，调控轴突的生长方向，引导轴突进入正确的位置并建立突触联系。研究表明sema 5a在人体中参与细胞迁移、肿瘤生长、血管生成及免疫调节等多个病理生理过程。sema 5a还可促进t细胞、自然杀伤细胞增殖及诱导辅助t细胞1/辅助t细胞17炎性细胞因子的分泌。近期有研究还发现在sema 5a在胃癌、神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、前列腺癌以及黑素瘤中高表达，其可能参与了调控肿瘤发生与形成的生物过程，还有研究证实sema 5a与肿瘤的侵袭转移和预后息息相关。本研究sema 5a在不同年龄分组的人群尿液外泌体中普遍存在，且组间无差别稳定表达。

2、与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后很快被代谢并排泄入尿液，其在尿液中被检测到的概率较血中大幅增加；尿中可能的蛋白降解过程在样本收集前已经完成，尿蛋白可在较长时间内保持稳定。外泌体具有膜性囊泡结构，分子稳定性高，尿液外泌体蛋白质组学研究将二者优势结合，具备良好生物标志物来源的特质。本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现将无创、方便、快捷、易重复的尿液外泌体稳定表达蛋白应用于尿液内参标志物、尿液外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种尿液外泌体神经导向分子5a及其多肽片段作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测，外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。

2、优选地，所述尿液外泌体神经导向分子5a的氨基酸序列包括seq id no.1所示（mkgtcviawl fsslglwrla hpeaqgttqc qrtehpvisy keigpwlref

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23、fnphltgkty snayftdlnn ydey）；或由seq id no:1所示的氨基酸序列衍生的，且与seq id no:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

24、优选地，所述制剂为尿液外泌体神经导向分子5a及其多肽片段检测试剂盒。

25、优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合神经导向分子5a及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

26、优选地，所述检测方法包括直接检测神经导向分子5a及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

27、优选地，所述检测方法包括直接检测神经导向分子5a及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

28、优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

29、优选地，所述标准品包括神经导向分子5a标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：神经导向分子5a质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

30、优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

31、发明人首先收集不同年龄段男性及女性健康人尿液标本，参照人类尿液蛋白质组计划(human urine proteome project，hkupp)和欧洲肾脏和尿液蛋白质组(europeankidney and urine proteomics, eurokup)组(http://www.eurokup.org)标准操作程序对尿液外泌体的提取，通过透射电子显微镜、外泌体纳米微粒追踪检测及蛋白免疫印迹对尿液外泌体进行鉴定，通过液相二级质谱技术（liquid chromatography tandem massspectrometry，lc-ms/ms)，采用数据非依赖性扫描模式（data-independent acquisition，dia），构建正常人群尿液外泌体蛋白质图谱，通过生信分析尿液外泌体稳定无差异表达蛋白神经导向分子5a，发明人利用蛋白免疫印迹法对不同性别不同年龄健康人尿液外泌体神经导向分子5a及其含量进行了验证。

32、本发明通过研究证实，健康人尿液外泌体sema 5a及其多肽片段稳定表达，从而提出检测尿液外泌体神经导向分子5a及其多肽片段可用于尿液内参标志物、尿液外泌体、健康人群及相关疾病患者的各种目的应用检测。

33、本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液外泌体神经导向分子5a及其多肽片段。

34、为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。