神经丛素B2及其多肽片段作为尿液参比标志物的应用的制作方法

本发明涉及尿液外泌体神经丛素b2及其多肽片段的新用途，具体涉及神经丛素b2及其多肽片段作为尿液外泌体的稳定表达蛋白，具有在儿童、青少年、中年及老年整个人体生命周期尿液稳定表达特点，可作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测，外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。

背景技术：

1、神经丛素（plexins）是一个广泛分布的跨膜受体家族，其作为信号素（semaphorins）受体介导 semaphorins 细胞内信号传导。semaphorins是一类分泌型、跨模型或糖基化磷脂酰肌醇（gpi）锚定蛋白，多个研究表明其在调节轴突导向、细胞运动、器官形成、肿瘤血管形成、癌症进展和免疫应答等方面起着重要作用。神经丛素b2（plexin-b2）属于丛状蛋白家族，是plexin-b亚家族的一员，是sema4c, sema4d和sema4g的细胞表面受体，在细胞-细胞信号传导中起重要作用。在神经发育过程中，sema4c结合plexin-b2激活rac同源基因家族成员 a，促使颗粒祖细胞增殖和迁移。除此之外，有研究证实其在谷氨酸能突触发育中也发挥着重要作用。本研究plexin-b2在不同年龄分组的人群尿液外泌体中普遍存在，且组间无差别稳定表达。

2、与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后很快被代谢并排泄入尿液，其在尿液中被检测到的概率较血中大幅增加；尿中可能的蛋白降解过程在样本收集前已经完成，尿蛋白可在较长时间内保持稳定。外泌体具有膜性囊泡结构，分子稳定性高，尿液外泌体蛋白质组学研究将二者优势结合，具备良好生物标志物来源的特质。本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现将无创、方便、快捷、易重复的尿液外泌体稳定表达蛋白应用于尿液内参标志物、尿液外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种尿液外泌体神经丛素b2及其多肽片段作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测，外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。

2、优选地，所述尿液外泌体神经丛素b2的氨基酸序列包括seq id no.1所示（malqlwaltl lgllgagasl rprkldffrs ekelnhlavd easgvvylga

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38、yydeiinale edpaaqkmql afrlqqiaaa lenkvtdl）；或由seq id no:1所示的氨基酸序列衍生的，且与seq id no:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

39、优选地，所述制剂为尿液外泌体神经丛素b2及其多肽片段检测试剂盒。

40、优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合神经丛素b2及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

41、优选地，所述检测方法包括直接检测神经丛素b2及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

42、优选地，所述检测方法包括直接检测神经丛素b2及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

43、优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

44、优选地，所述标准品包括神经丛素b2标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：神经丛素b2质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

45、优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

46、发明人首先收集不同年龄段男性及女性健康人尿液标本，参照人类尿液蛋白质组计划(human urine proteome project，hkupp)和欧洲肾脏和尿液蛋白质组(europeankidney and urine proteomics, eurokup)组(http://www.eurokup.org)标准操作程序对尿液外泌体的提取，通过透射电子显微镜、外泌体纳米微粒追踪检测及蛋白免疫印迹对尿液外泌体进行鉴定，通过液相二级质谱技术（liquid chromatography tandem massspectrometry，lc-ms/ms)，采用数据非依赖性扫描模式（data-independent acquisition，dia），构建正常人群尿液外泌体蛋白质图谱，通过生信分析尿液外泌体稳定无差异表达蛋白神经丛素b2，发明人利用蛋白免疫印迹法对不同性别不同年龄健康人尿液外泌体神经丛素b2及其含量进行了验证。

47、本发明通过研究证实，健康人尿液外泌体plexin-b2及其多肽片段稳定表达，从而提出检测尿液外泌体神经丛素b2及其多肽片段可用于尿液内参标志物、尿液外泌体、健康人群及相关疾病患者的各种目的应用检测。

48、本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液外泌体神经丛素b2及其多肽片段。

49、为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。