紫草的含量测定方法及应用与流程

1.本发明涉及医药技术检测领域，特别是涉及一种紫草的含量测定方法及应用。


背景技术：

2.紫草别名硬紫草、软紫草，是中国药典收录的草药，性味甘、咸，寒，归心、肝经，具有凉血、解毒透疹、活血化瘀之功效，用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等。
3.含量测定是紫草药材的重要检验项目之一，通过测定紫草有效成分的含量，可以判断紫草药材的质量好坏。β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁便是紫草中的有效成分之一。紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量测定流程可简化为样品前处理、对照品溶液配制、高效液相色谱分析、数据处理四个步骤，目前，对紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的测定时间较长，通常达19小时以上，综合成本较高，同时紫草的质量检测也是白蚀丸所有药材质量检测中所需时间最长的，严重影响了白蚀丸的生产进度。


技术实现要素：

4.基于此，本发明提供了一种紫草的含量测定方法，所述检测方法所需的时间较短，仅需8小时。
5.本发明通过如下技术方案实现。
6.一种紫草的含量测定方法，包括如下步骤：
7.将β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁与第一溶剂混合，制备对照品；所述第一溶剂包括乙腈、水与甲酸的混合物；
8.将紫草与第二溶剂混合，然后过滤，取滤液，蒸干，再与所述第一溶剂混合，过滤，取滤液，制备供试品；
9.将所述供试品与所述对照品分别进行高效液相色谱测定，高效液相色谱测定的条件为：流动相为体积比为(61～79):(21～39):0.05的乙腈、水与甲酸的混合物；柱温为25℃～35℃；流速为1.2ml/min～1.5ml/min。
10.在其中一个实施例中，在所述第一溶剂中，所述乙腈、所述水与所述甲酸的体积比为(68～72):(28～32):0.05。
11.在其中一个实施例中，高效液相色谱测定采用的色谱柱为c
18
色谱柱。
12.在其中一个实施例中，所述第二溶剂为石油醚。
13.在其中一个实施例中，高效液相色谱测定采用的检测波长为275
±
5nm。
14.在其中一个实施例中，高效液相色谱测定中的进样体积为5μl～20μl。
15.在其中一个实施例中，将所述紫草与所述第二溶剂混合前还包括如下步骤：粉碎所述紫草后过筛。
16.在其中一个实施例中，在所述对照品中，所述β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁的浓度为0.09mg/ml～0.11mg/ml。
17.在其中一个实施例中，所述紫草为新疆紫草或内蒙紫草。
18.本发明还提供一种如上所述的紫草的含量测定方法在白蚀丸质量控制中的应用。
19.与现有技术相比较，本发明的紫草的含量测定方法具有如下有益效果：
20.本发明所述的检测方法通过限定β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁的溶剂种类包括乙腈、水与甲酸的混合物，并限定柱温为25℃～35℃、流速为1.2ml/min～1.5ml/min，在很大程度上缩短了β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁的出峰时间，从而缩短检测时长，同时节约了人力成本与仪器运行成本。
附图说明
21.图1为本发明提供的6批紫草样板的回收率；
22.图2为实施例1提供的色谱图；
23.图3为对比例7提供的色谱图；
24.图4为对比例8提供的色谱图。
具体实施方式
25.为了便于理解本发明，下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。实施例中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
26.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
27.本发明提供了一种紫草的含量测定方法，包括如下步骤：
28.将β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁与第一溶剂混合，制备对照品；第一溶剂包括乙腈、水与甲酸的混合物；
29.将紫草与第二溶剂混合，然后过滤，取滤液，蒸干，再与第一溶剂混合，过滤，取滤液，制备供试品；
30.将供试品与对照品分别进行高效液相色谱测定，高效液相色谱测定的条件为：流动相为体积比为(61～79):(21～39):0.05的乙腈、水与甲酸的混合物；柱温为25℃～35℃；流速为1.2ml/min～1.5ml/min。
31.流速过快会使系统压力过高，且成分峰与杂质峰分离度下降，而柱温过高对色谱柱性能有损坏，色谱柱填料不耐受。
32.可以理解地，在本发明中，流速包括但不限于1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min与1.5ml/min。优选地，流速为1.2ml/min。
33.可以理解地，在本发明中，柱温包括但不限于25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃与35℃。优选地，柱温为35℃。
34.在一个具体的示例中，高效液相色谱测定采用的流动相为乙腈、水与甲酸以体积比为70:30:0.5的混合物。
35.本发明人发现传统的溶剂制得的对照品溶液稳定性较差，易出现回收率不达标的现象，从而增加重复检测的次数，进一步提高检测时长与成本。本发明人通过筛选出乙腈、水与甲酸的混合物作为溶剂溶解β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁，制备得到的对照品溶液稳定性较好，在24小时内相对峰面积变化为
±
1％，减少了因对照品浓度变小而导致的重复检测的次数，有效规避质量风险，进一步降低了批量检测的所需时长，也节约了人力成本与消耗检验成本。
36.更具体地，在第一溶剂中，乙腈、水与甲酸的体积比为(68～72):(28～32):0.05。优选地，在第一溶剂中，乙腈、水与甲酸的体积比为70:30:0.5。
37.在一个具体的示例中，高效液相色谱测定采用的色谱柱为c
18
色谱柱。更具体地，高效液相色谱测定采用的色谱柱为spolar c
18
色谱柱、xbridge c
18
色谱柱与mgii c
18
色谱柱。优选地，高效液相色谱测定采用的色谱柱为spolar c
18
色谱柱。
38.在一个具体的示例中，第二溶剂为石油醚。
39.在一个具体的示例中，高效液相色谱测定采用的检测波长为275
±
5nm。更具体地，高效液相色谱测定采用的检测波长为275nm。
40.在一个具体的示例中，高效液相色谱测定中的进样体积为5μl～20μl。
41.在一个具体的示例中，石油醚的沸程为60℃～90℃。
42.在一个具体的示例中，将紫草与第二溶剂混合前还包括如下步骤：粉碎紫草后过筛。
43.在一个具体的示例中，过筛为过4号筛。
44.在一个具体的示例中，在对照品中，β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁的浓度为0.09mg/ml～0.11mg/ml。
45.在一个具体的示例中，高效液相色谱进样之前，过滤供试品与对照品。更具体地，过滤为经0.22μm滤膜或0.45μm滤膜过滤。
46.在一个具体的示例中，紫草为新疆紫草或内蒙紫草。
47.本发明还提供一种上述紫草的含量测定方法在白蚀丸中紫草含量测定中的应用。
48.以下结合具体实施例对本发明的紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。
49.实施例1
50.本实施例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
51.1仪器和溶液配制
52.1.1仪器
53.色谱柱：shiseido spolar c
18
(250mm)柱。
54.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
55.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
56.2检测条件
57.柱温：35℃；
58.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
59.流速：1.2ml/min；
60.检测波长：275nm。
61.实施例2
62.本实施例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
63.1仪器和溶液配制
64.1.1仪器
65.色谱柱：waters xbridge c
18
(250mm)柱。
66.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
67.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
68.2检测条件
69.柱温：25℃；
70.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
71.流速：1.2ml/min；
72.检测波长：275nm。
73.实施例3
74.本实施例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
75.1仪器和溶液配制
76.1.1仪器
77.色谱柱：shiseido mgii c
18
(250mm)柱。
78.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
79.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
80.2检测条件
81.柱温：30℃；
82.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
83.流速：1.2ml/min；
84.检测波长：275nm。
85.对比例1
86.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
87.1仪器和溶液配制
88.1.1仪器
89.色谱柱：shiseido spolar c
18
(250mm)柱。
90.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
91.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
92.2检测条件
93.柱温：25℃；
94.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
95.流速：0.8ml/min；
96.检测波长：275nm。
97.对比例2
98.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
99.1仪器和溶液配制
100.1.1仪器
101.色谱柱：shiseido spolar c
18
(250mm)柱。
102.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
103.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
104.2检测条件
105.柱温：30℃；
106.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
107.流速：1.0ml/min；
108.检测波长：275nm。
109.对比例3
110.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
111.1仪器和溶液配制
112.1.1仪器
113.色谱柱：waters xbridge c
18
(250mm)柱。
114.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
115.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加
流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
116.2检测条件
117.柱温：30℃；
118.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
119.流速：0.8ml/min；
120.检测波长：275nm。
121.对比例4
122.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
123.1仪器和溶液配制
124.1.1仪器
125.色谱柱：waters xbridge c
18
(250mm)柱。
126.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
127.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
128.2检测条件
129.柱温：35℃；
130.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
131.流速：1.0ml/min；
132.检测波长：275nm。
133.对比例5
134.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
135.1仪器和溶液配制
136.1.1仪器
137.色谱柱：shiseido mgii c
18
(250mm)柱。
138.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
139.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
140.2检测条件
141.柱温：35℃；
142.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
143.流速：0.8ml/min；
144.检测波长：275nm。
145.对比例6
146.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
147.1仪器和溶液配制
148.1.1仪器
149.色谱柱：shiseido mgii c
18
(250mm)柱。
150.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
151.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
152.2检测条件
153.柱温：25℃；
154.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
155.流速：1.0ml/min；
156.检测波长：275nm。
157.对比例7
158.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
159.1仪器和溶液配制
160.1.1仪器
161.色谱柱：shiseido spolar c
18
(250mm)柱。
162.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加乙醇溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
163.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
164.2检测条件
165.柱温：35℃；
166.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
167.流速：1.2ml/min；
168.检测波长：275nm。
169.对比例8
170.本对比例提供一种紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的检测方法，具体如下：
171.1仪器和溶液配制
172.1.1仪器
173.色谱柱：shiseido spolar c
18
(250mm)柱。
174.1.2对照品溶液的制备：取β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，精密称定，加甲醇溶剂制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
175.1.3供试品溶液的制备：取供试品紫草粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞
锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
176.2检测条件
177.柱温：35℃；
178.流动相：乙腈-水-甲酸(70:30:0.05)；
179.流速：1.2ml/min；
180.检测波长：275nm。
181.效果验证试验
182.(一)实施例1-3与对比例1-6的检测参数、β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁的色谱峰出峰时间如表1所示。
183.表1
[0184][0185]
由表1所示，色谱柱条件在流速为1.2ml/min，柱温为25℃～35℃时，该色谱条件下紫草β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁色谱峰理论塔板数和分离度均能满足药典要求，且β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁色谱峰出峰时间基本≤17min，缩短了检验时长。
[0186]
(二)色谱分析时长从6至24小时不等，为了保障在色谱分析的实验过程中数据的准确性，需要确保对照品溶液浓度在至少24小时内保持稳定。保持稳定的标准为：对照品在24小时内浓度变化≤
±
2％。
[0187]
对上述实施例1与对比例7-8进行对照品溶剂稳定性测量，对照品在不同溶剂下的24小时浓度变化如表2所示，结果显示乙醇作溶剂时对照品的稳定时长为4小时，甲醇作溶剂时对照品的稳定时长为5小时，乙腈-水-甲酸作溶剂时对照品的稳定时长达24小时。实施例1中对照品溶液的稳定时间明显长于对比例7与对比例8。回收率若超出规定范围，说明实验准确度不佳，需重新进行实验，则增加了色谱分析时长。当β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁色谱峰相对峰面积变化≤
±
2％时，其回收率结果可达98％～102％，符合部门sop要求。
[0188]
表2
[0189][0190]
实施例1、对比例7与对比例8获得的色谱图分别如图2、图3与图4所示，可见乙醇与甲醇作溶剂时，除对照品峰外均出现杂质峰，而乙腈-水-甲醇作溶剂所获得的图谱则没有出现杂质峰。
[0191]
本发明人对6批紫草样板进行β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量测定，采用以乙腈-水-甲酸作为对照品溶剂的方案，考察回收率，回收率结果如表3与图1所示：6批紫草样板回收率均符合要求，证明β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁色谱峰相对峰面积变化≤
±
2％。
[0192]
表3
[0193][0194]
本发明人对12批紫草含量进行测定并统计了分析时长，结果如表4所示，平均检测分析时长为7.99h，相较于传统方法检测所需的19h，很大程度上缩短了紫草中β,βˊ-二甲基丙烯酰阿卡宁含量测定分析时长，缩短了紫草检验周期，白蚀丸全药材检验从原来14天缩短至10天，提高了生产效率。
[0195]
表4
[0196]
样品批号样品前处理h对照品配制h色谱分析h数据处理h分析时长h2006011.40.84.80.67.62006411.40.64.90.37.22007011.50.85.10.88.22007021.30.65.20.77.82007031.50.74.70.67.52009011.70.85.40.88.72009021.30.76.00.58.52009421.50.55.40.47.82010021.40.65.80.88.62011011.60.55.70.98.72012011.80.85.40.48.42012411.20.74.70.36.9平均值1.470.685.260.597.99
[0197]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0198]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。