一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法

本发明涉及一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，属于生物分析。

背景技术：

1、蛋白质组是指在一种细胞、组织或生物体中完整基因组所表达的全套蛋白质。蛋白质组学就是通过研究细胞、组织或生物体中蛋白质组的组成及其变化规律，从而实现对生物学功能的研究，主要研究内容包括：蛋白质丰度、亚细胞定位、周转代谢、相互作用和翻译后修饰等(nat rev mol cell bio,2015,16(5),269-280)。

2、研究蛋白质结构的常见方法有x射线晶体、核磁共振波谱和冷冻电镜。但是x射线晶体需要高纯结晶蛋白；核磁共振波谱需要纯蛋白溶在特定溶剂，并且适用于小分子量蛋白；冷冻电镜破坏蛋白质复合物天然构象。研究蛋白质-蛋白质相互作用的常见方法有亲和纯化质谱、酵母双杂交、免疫共沉淀和邻近标记。亲和纯化质谱和免疫共沉淀都不能捕获瞬时或弱的相互作用，不能区分直接或间接相互作用，而且会导致蛋白质相互作用的重组。酵母双杂交将蛋白与结构域融合，可能改变空间构象。邻近标记在活体和组织中，标记探针递送困难。

3、而化学交联质谱不仅能够提供蛋白质-蛋白质相互作用信息，而且能够补充蛋白质构象信息。它能够捕获瞬时或弱的相互作用，提供相互作用界面信息，而且能够对于天然环境下的大规模蛋白质复合物进行分析。

4、当前交联剂发展迅速，出现大量不同臂长、不同反应基团的化学交联剂，但是分别有溶解度差、极易水解、不能捕获特定位点蛋白质复合物等缺点，并且交联剂在活体中由于血液循环里被猝灭和清除，导致无法用于活体的蛋白质复合物原位分析。因此本专利利用载体进行交联剂递送，能够保护交联剂、改善交联剂溶解度、实现靶向交联。

5、常规载体有高分子聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒(介孔二氧化硅、碳纳米管)、金属纳米颗粒(纳米金)等，它们各自具有稳定性好、生物相容性好、高比表面积、易修饰等优点，但是它们作为药物载体的共同点都是缓释。

6、重要生物标志物活性氧在肿瘤细胞、炎症细胞、激活免疫细胞中存在高表达。细胞内活性氧产生的主要途径有线粒体呼吸链途径和nadph氧化酶途径。线粒体呼吸链是细胞内活性氧产生的主要来源，约90％活性氧产生于线粒体，由于肿瘤细胞的异常增殖和线粒体功能障碍，使得其活性氧浓度高达100μm(asian j pharm sci,2018,13(2),101-112)。nadph氧化酶是活性氧在一些免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)中的主要来源，当细胞膜受到刺激(微生物、非颗粒)后，胞质内的nadph氧化酶复合物的组分向吞噬体膜、核内体膜和质膜上转移，组合成完整的nadph氧化酶复合物，引发呼吸爆发机制，产生大量ros，引起免疫反应。

7、因此，为了实现载体快速释放交联剂进行蛋白质复合物的原位交联，利用内源性高表达的活性氧设计出活性氧响应载体，它能够在高浓度活性氧刺激下，快速并且位点特异性释放交联剂进行蛋白质复合物交联。

8、在本专利中，针对现有化学交联剂溶解度差、极易水解、无法靶向交联等问题，以及现有载体缓释的问题，利用特定细胞、组织和器官内源性高表达活性氧这一特点，发展出基于活性氧响应化学交联剂载体的蛋白质复合物原位分析方法，以实现高浓度活性氧下蛋白质复合物的原位分析。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，通过本发明的方法实现了特定部位(高浓度活性氧环境)蛋白质复合物的原位分析。

2、一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，具体包括以下步骤：

3、(1)制备活性氧响应聚合物。将活性氧响应基团嵌入高分子骨架中，活性氧响应基团由硫醚、缩硫酮、单碲基团或者芳香硼酸酯组成；高分子骨架主要为碳链高分子、杂链高分子、元素有机高分子，如聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚已内酯、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、聚乙醇酸、葡聚糖、壳聚糖等。

4、从生物相容性和快速活性氧响应两个方面构建活性氧响应聚合物，从聚合物嵌段组成、骨架材料两个方面研究生物相容性优异的载体基质；通过调整聚合物链段上活性氧响应基团密度、响应基团种类、亲水/疏水嵌段比例，从而为快速释放奠定基础。

5、(2)制备活性氧响应化学交联剂载体。交联剂可为：二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯、双(磺基琥珀酰亚胺)戊二酸、二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双琥珀酰亚胺亚砜、3,3'-二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)、二甲基吡咪酯、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯、二琥珀酰亚胺二丁基脲、二硫基双马来酰亚胺乙烷、双马来酰亚胺基己烷、1,4-双马来酰亚胺基丁烷、癸二酸二琥珀酰亚胺酯、n-(β-马来酰亚胺丙氧基)琥珀酰亚胺酯、n-ε-马来酰亚胺基己酰-氧琥珀酰亚胺酯、n-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺-6(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)已酸酯、m-马来酰亚胺基苯甲酰-n-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼、n-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯、n-琥珀酰亚胺碘乙酸酯、琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸)、琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、琥珀酰亚胺6-((β-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸)、琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯、磺基琥珀酰亚胺6-(3'-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基)已酸酯、m-马来酰亚胺基苯甲酰-n-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、n-磺基琥珀酰亚胺碘代乙酸盐、磺基琥珀酰亚胺6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯氨基)己酸酯、磺基琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐、ε-马来酰亚胺己酸-磺基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、聚乙二醇化二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸、1,8-双马来酰亚胺基-二乙二醇、1,11-双马来酰亚胺基-三乙二醇，等等。

6、选取合适的活性氧响应聚合物和交联剂搭配，分别利用乳化溶剂蒸发法(单乳法、双乳法)、纳米沉淀法、乳化溶剂扩散法(单乳法、双乳法)进行交联剂的包埋，制备活性氧响应的化学交联剂载体。

7、(3)将活性氧响应化学交联剂载体与细胞在37℃，5％co2条件下，共同孵育1-12小时，并收集细胞；或，将活性氧响应化学交联剂载体经静脉注射入活体鼠体内，经血液循环1-24h，取出肿瘤组织，或具有炎症的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏。

8、活性氧响应化学交联剂载体中的响应基团在特定部位高浓度活性氧刺激下，由疏水向亲水转变，导致聚合物的亲疏水性发生变化，进而载体膨胀破碎，释放出交联剂；或，响应基团在特定部位高浓度活性氧刺激下，发生断裂，导致聚合物分子量降低，进而载体膨胀破碎，释放出交联剂。

9、(4)将得到的细胞中加入含0.5-5％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail的离子液体，每3×106个细胞加入200-600μl离子液体，超声破碎细胞，10000-16000g离心5-30min，取出上清液蛋白质复合物样品；

10、鼠的组织或器官取出后，多次清洗干净、剪碎，加入含0.5-5％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail的离子液体，每0.1g组织或器官加入1-4ml离子液体，冰上研磨匀浆裂解，将匀浆400-1000g离心5-10min，抛弃细胞碎片，上清液进行超声破碎提取，再次进行10000-16000g离心5-30min，取出上清液蛋白质复合物样品。

11、(5)i-fasp进行样品预处理。提取的蛋白质复合物样品中加入二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，高温变性还原，所述高温变性的温度为37-95℃，时间为5min-2h；将样品转移至3k-10k da滤膜上，利用碘乙酰胺进行避光烷基化20-40min；加入蛋白酶，以1：20-1：50(w/w)的蛋白酶与蛋白质复合物的比例进行12-16h酶解，离心收集肽段样品。

12、(6)对收集到的肽段样品采用液质联用进行分析，利用c18色谱柱进行样品分离，利用高分辨质谱进行数据采集。

13、(7)利用软件proteome discoverer(thermo fisher)、maxquant(https://www.maxquant.org/)、pfind(http://pfind.ict.ac.cn/software/pfind/index.html)以及plink(http://pfind.ict.ac.cn/software/plink/index.html)对质谱数据进行解析，从而得到蛋白质复合物及其交联信息。

14、(8)最后利用得到的数据进行高浓度活性氧下蛋白质复合物原位分析。包括：肿瘤细胞敏感株和耐药株中线粒体呼吸链复合物构象和相互作用分析、以及蛋白质复合物规模化分析，进而为耐药机制提供理论依据；炎症细胞、激活免疫细胞质膜、吞噬体、溶酶体、核小体中蛋白质复合物的动态变化，进而解析免疫激活通路；以及活体上肿瘤组织、具有炎症的心肝脾肺肾的蛋白质复合物规模化分析。

15、本发明将活性氧响应基团引入聚合物，利用构建的活性氧响应聚合物装载交联剂，制备位点特异性释放的活性氧响应化学交联剂载体。将活性氧响应化学交联剂载体与细胞共孵育，经过细胞内吞作用，载体到达细胞内特定部位；或将活性氧响应化学交联剂载体静脉注射入活体鼠体内，经血液循环渗透到特定组织或器官。在特定部位微环境中高浓度活性氧的刺激下，载体的聚合物发生响应，进行交联剂的快速、定点释放，原位交联蛋白质复合物。将细胞、组织、器官破碎，进行蛋白质复合物的提取，随后利用i-fasp样品预处理方法，结合液质联用技术，对高浓度活性氧下蛋白质复合物进行原位分析。这一方法对于解析氧化应激下的蛋白质复合物动态变化规律，理解炎症、免疫、以及耐药产生的通路具有重要意义，进而对免疫相关疾病、抑制耐药现象提供理论支撑。

16、本发明具有如下优点：

17、(1)本发明通过活性氧响应载体进行化学交联剂的装载，克服了交联剂溶解度差、极易水解、不能捕获特定位点蛋白质复合物的问题，使该发明成为交联剂进行高浓度活性氧下蛋白质复合物原位分析的广谱方法。

18、(2)本发明将活性氧响应基团引入聚合物，通过调整聚合物链段上活性氧响应基团密度、响应基团种类、亲水/疏水嵌段比例，制备出快速活性氧响应的载体，解决了传统载体对于化学交联剂缓慢释放的问题。

19、(3)本发明制备的活性氧响应化学交联剂载体，解决了交联剂由于被猝灭和清除而无法用于活体研究的问题，能够用于活体的蛋白质复合物原位研究。