染料分子在检测酪氨酸磷酸化肽和监测蛋白激酶活性中应用

本发明属于分析，且特别涉及一种无标记、多功能、低成本和高通量的酪氨酸磷酸化监测方法。

背景技术：

1、蛋白质的磷酸化是代谢中最基本、最常见和最重要的生物学过程之一，它控制着许多细胞内信号转导并调节各种细胞活动，包括细胞生长、分化和凋亡。确凿的证据表明，异常的蛋白激酶活性会破坏蛋白磷酸化网络，从而导致各种人类疾病。例如，由于基因突变或其他机制，通常观察到癌细胞具有过度活跃的蛋白磷酸化水平，截至2020年，美国食品和药品管理局(fda)批准了大约52种蛋白激酶小分子抑制剂。这些药物主要是批准用于治疗癌症的多靶点受体酪氨酸激酶(rtk)抑制剂。

2、开发癌症靶向药物通常涉及蛋白激酶活性的监测，主流方法包括使用放射性32p标记atp的方法和使用针对磷酸化残基的特异性抗体的免疫测定法。这些测定方法虽然在评估蛋白激酶活性方面取得了巨大进步。然而，利用放射性32p检测pka会产生大量放射性废物，造成严重的环境污染。此外放射性化合物的分析需要长时间暴露在放射性环境中，严重危害人体健康。基于抗体的免疫测定法通常需要昂贵和特异性的抗体，这些抗体的分离纯化需要复杂的过程，因此迫切需要开发新的酪氨酸磷酸化监测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新的方法用于酪氨酸磷酸化肽的检测以及蛋白激酶活性的监测。该探针可以应用于酪氨酸磷酸化肽的定性分析以及定量检测中，还可以作为一种监测方法用于蛋白激酶活性的监测。和传统的酶联免疫吸附测定、质谱检测方法相比，该探针在检测酪氨酸磷酸化肽时，具有操作简单、成本低、无需标记的优点。非常适用于酪氨酸磷酸化肽的检测分析。

2、该探针的检测原理是通过染料分子h-hpmo在水溶液中特异性结合铜离子后导致h-hpmo荧光淬灭，当溶液中存在磷酸化肽或底物肽被蛋白激酶磷酸化时，肽上的磷酸基团会通过竞争取代反应夺取铜离子导致h-hpmo荧光的恢复，通过这种开启型荧光响应就可以实现酪氨酸磷酸化肽的检测以及蛋白激酶活性的监测。在激酶抑制剂筛选实验中，如果候选抑制剂能够抑制蛋白激酶催化底物磷酸化，底物肽上的酪氨酸基团无法生成磷酸基团，因此，染料分子h-hpmo继续与cu2+紧密结合，荧光被淬灭，酶标仪显示为初始荧光值，因此可以根据酶标仪荧光数值的大小判断该候选抑制剂是否具有抑制蛋白激酶催化底物发生磷酸化的作用。基于上述原理就可以用于磷酸化肽的检测，蛋白激酶活性的监测以及激酶抑制剂的初步筛选。

3、本发明技术方案是：

4、荧光探针用于酪氨酸磷酸化肽的检测以及蛋白激酶活性的监测。

5、探针分子h-hpmo溶解在hepes(50mmol·l–1,ph＝7.3)缓冲溶液中，加入硝酸铜混合均匀，然后加入配置好的各种磷酸化肽溶液；通过荧光光谱仪检测探针分子对不同磷酸化肽的荧光响应；在包含探针分子h-hpmo–cu2+的测试溶液中加入不同浓度的酪氨酸磷酸化肽记录一定波长下的荧光值，通过浓度与荧光强度比值的关系建立标准曲线；在测试溶液中加入蛋白激酶通过酶标仪监测蛋白激酶催化底物肽形成磷酸化肽的过程；在激酶反应溶液中加入激酶抑制剂通过酶标仪监测抑制剂抑制蛋白激酶催化底物肽形成磷酸化肽的过程；通过在测试溶液中加入不同的离子探究常见离子对探针分子h-hpmo–cu2+荧光性能的影响。

6、所述磷酸化肽溶液包括单酪氨酸磷酸化肽、双酪氨酸磷酸化肽、三酪氨酸磷酸化肽；所述蛋白激酶为酪氨酸蛋白激酶c-abl；所述离子为钠离子、镁离子、钙离子、硝酸根离子、碳酸根离子、硫酸根离子、异硫氰酸根离子，腺嘌呤核苷三磷酸(atp)；上述所有的测试中荧光光谱仪激发波长均设置为500nm，酶标仪激发波长设置为560nm。

7、步骤1，合成探针分子h-hpmo

8、该分子的合成是通过中间体hpmo上的醛基与含有活性甲基的杂环季胺盐在无水条件下缩合而成，然后用甲醇重结晶，固体通过甲醇反复洗涤得到最终产物。

9、步骤2，h-hpmo–cu2+测试液的制备

10、将步骤1合成的染料h-hpmo加入到hepes缓冲溶液中，进行超声波震荡使其完全溶解，随后加入等摩尔的硝酸铜，室温下搅拌混匀，得到h-hpmo–cu2+测试液。

11、步骤3，对标准酪氨酸磷酸化肽进行检测

12、采用500nm的激发波长测试步骤2制备的h-hpmo–cu2+测试液的荧光发射光谱，记为初始荧光光谱。然后再分别加入单或双的酪氨酸磷酸化肽和对应的非磷酸化肽进行荧光光谱测试，分别记录对应的荧光发射光谱。通过对比待测溶液的荧光光谱与初始荧光光谱判断是否探针h-hpmo–cu2+能够用于检测酪氨酸磷酸化肽。

13、步骤4，对酪氨酸磷酸化肽定量分析；

14、采用500nm的激发波长测试步骤2制备的h-hpmo–cu2+测试液在598nm处的荧光强度值，记为初始荧光值。

15、配制不同浓度的酪氨酸磷酸化肽标准溶液，然后将上述溶液加入到含有步骤2制备的h-hpmo–cu2+的测试液中记录每一个浓度在598nm处对应的荧光强度值，通过酪氨酸磷酸化肽浓度与荧光强度比值的关系建立标准曲线。

16、加入未知浓度的酪氨酸磷酸化肽到含有步骤2制备的h-hpmo–cu2+的测试液中记录598nm处的荧光强度值，将该值代入到标准曲线中计算出对应的浓度。

17、步骤5，蛋白激酶活性监测

18、配制激酶反应混合液，在tris-hcl缓冲液中加入底物肽ee-13的标准储备液，然后加入各种盐溶液包括：atp2-、mgcl2和nacl。第一组实验：取上述反应混合液200μl加入到黑色96孔板中，加入步骤2制备的h-hpmo–cu2+测试液并记录598nm处荧光强度在0到60min之间的背景荧光值。

19、第二组实验在上述反应混合液中加入c-abl蛋白激酶原液，在37℃下孵育5min后加入到黑色96孔板中，同时快速加入步骤2制备的h-hpmo–cu2+测试液并记录598nm处荧光强度在0到60min之间的变化。

20、步骤6，激酶抑制剂筛选；

21、将各种候选蛋白激酶抑制剂分别加入到步骤5所述的反应混合液中，在与步骤5第二组实验相同的条件下记录60min时的荧光强度值。

22、根据加入蛋白激酶抑制剂和未加蛋白激酶抑制的测试液在598nm处的荧光值大小判断候选激酶抑制剂是否有抑制效果。

23、上述方法步骤(1)中，反应温度设置为为65℃，反应时间为12到18小时，反应溶剂使用超干甲醇，重结晶所用溶剂为甲醇，反应原料的摩尔比为1比1。

24、上述方法步骤(2)中，所述染料h-hpmo的浓度可为3～300μmol·l–1，具体可为33μmol·l–1；超声波震荡时间可为2-10min，具体可为5min。

25、上述方法步骤(3)中h-hpmo–cu2+测试液的体积可为2～4ml，具体可为3ml；标准磷酸化肽的浓度为0.005mol，体积可为20-80μl，具体为60μl。测试温度为室温，缓存液可以为25mmol·l–1tris、50mmol·l–1tris、25mmol·l–1hepes、50mmol·l–1hepes，具体为50mmol·l–1hepes缓存液。

26、上述步骤(4)中，酪氨酸磷酸化肽的浓度为29μmol·l–1,33μmol·l–137.5μmol·l–1,45μmol·l–1,54μmol·l–1,58μmol·l–1,62μmol·l–1,66μmol·l–1，探针h-hpmo–cu2+的浓度为33μmol·l–1，检测体系为50mmol·l–1hepes缓存液，选取598nm处的荧光强度值。

27、上述步骤(5)中的h-hpmo的浓度为33μmol·l–1体积为3ml。测试是在酶标仪中进行，腺嘌呤核苷三磷酸(atp)的体积为15μl(0.1mol·l–1)、氯化镁体积300μl(0.1mol·l–1)、氯化钠的体积300μl(0.1mol·l–1)，底物肽ee-13体积120μl(0.005mol·l–1)，激酶c-abl 10μl(0.24μg/μl)，tris-hcl缓冲液体积2255μl。

28、程序设置采用双轨道振动模式(中速)使反应液混合均匀，c-abl激酶的最终浓度为100nmol·l–1

29、上述步骤(6)激酶抑制剂筛选实验的候选抑制剂浓度为5μmol·l–1，设置参数为37℃下孵育60min，线性双轨道振动模式(中速)。孔板中样品的体积可为200-300μl，实际为200μl。

30、本发明提供了一种荧光探针用于无标记、多功能、低成本和高通量的酪氨酸磷酸化实时监测。荧光分子，其在水溶液中可以特异性结合铜离子导致荧光淬灭，在淬灭后的体系中加入酪氨酸残基被磷酸化的底物肽后会引起荧光的剧烈变化，并且溶液颜色由紫色变为红色，而加入非磷酸化的底物肽和其他磷酸根相关离子均没有观察到明显的荧光变化。通过这种开启型荧光响应就可以实现酪氨酸磷酸化的实时监测，最低检测限为100nm。该方法也可应用于蛋白激酶抑制剂的快速筛查，还可用于检测丝氨酸、苏氨酸、以及单和双磷酸化位点的磷酸化肽。该荧光光谱方法的最大优势是不需要抗体和放射性同位素，操作步骤简单，非常适合蛋白酪氨酸磷酸酶活性的实时检测。

31、本发明的有益效果为：基于h-hpmo–cu2+，实现了标准磷酸化肽的检测，酪氨酸磷酸化过程的实时监测以及蛋白激酶抑制剂的初步筛选。与传统检测方法相比，本发明不需要特殊的信号分子标记，操作简单、成本低、高通量、无需复杂的仪器设备，在靶向药物研发领域具有应用价值。