检测神经系统自身免疫性疾病致病抗体的蛋白芯片

1.本发明涉及医学体外诊断技术领域，具体涉及一种检测神经系统自身免疫性疾病致病抗体的蛋白芯片及制备方法和应用。


背景技术：

2.神经系统自身免疫性疾病是神经病学领域中的一大类重要疾病，具有免疫疾病的复杂性和神经系统疾病的高致死、致残性的特点，因而受到临床医师和研究人员高度关注。目前国内外常用的抗体检测方法多以elisa检测法为基础，一次只能检测一种抗体，如果要检测所有抗体，则工作量大，消耗时间长，所需费用较高。


技术实现要素：

3.本发明的目的是针对现有神经系统自身免疫性疾病检测中存在的低效率、耗时长等方面技术存在的问题，提供一种检测神经系统自身免疫性疾病致病抗体的蛋白芯片。
4.本发明的技术方案为：一种检测神经系统自身免疫性疾病致病抗体的蛋白芯片，该芯片为玻璃基片上分布有不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中分别固定能检测神经系统自身免疫性疾病抗体的特异性抗原探针。
5.所述探针能与致病抗体特异性结合，设计24个探针，所设计的探针来源如下：
6.[0007][0008]
一种检测神经系统自身免疫性疾病致病抗体的蛋白芯片制备方法，按如下步骤进行：
[0009]
1.设计抗原特异性探针：
[0010]
目的基因经pcr扩增后插入相应的表达载体，通过测序验证所构建载体的序列，正确的质粒被扩增并传递到下游；
[0011]
2.表达和纯化：
[0012]
(1)hek293系统
[0013]
质粒以最佳比例与转染试剂混合，然后添加到烧瓶或含有hek293的生物反应器中，细胞在无血清培养基中培养，并在37℃下以合适的搅拌速度在轨道振动筛或生物反应器上的锥形瓶中保持6天，细胞培养液离心；将细胞培养上清液以合适的流速加载到亲和纯化柱上，通过sds-page分析纯化蛋白的分子量和纯度；
[0014]
(2)insectcell
[0015]
将目标cdna插入杆状病毒载体，然后根据制造商手册生成重组杆状病毒，在细胞中扩增重组杆状病毒以制备高滴度病毒库，对于蛋白质表达，按照标准方案用重组杆状病毒感染细胞，并在最佳条件下表达目标蛋白，通过离心收集细胞颗粒并在均质缓冲液中再悬浮，将颗粒均质并离心以去除细胞碎片，收集裂解液上清液并将其装载到亲和纯化柱上，使用洗脱缓冲液从柱上洗脱目标蛋白，将含有所需蛋白质的组分汇集，并将其交换到配方缓冲液中，最终产品的蛋白质浓度通过uv或bca分析确定，通过sds-page分析最终产物的纯度；
[0016]
(3)e.colic
[0017]
将含有感兴趣基因(goi)的载体转移到大肠杆菌中，然后选择并建立高表达转化子。选择一株表达菌株进行发酵以表达目的蛋白，单个菌落在mdg培养基(sinobiologic)中37℃培养过夜。将种子培养物接种到tb培养基(sinobiologic)中，并在37℃下培养至od600为0.8，通过使用0.4mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导培养物来启动蛋白质表达，iptg诱导后，将培养温度移到18℃，并允许发酵过夜以进行目标蛋白表达，通过离心收集细胞，细胞经超声裂解，包涵体经离心提取，在变性过程之前，用洗涤缓冲液将颗粒洗
涤3 次，包涵体溶解在8m尿素中，通过离心去除过程中的任何沉淀，并将蛋白质溶液装载到金属离子亲和色谱柱上，使用含有8m尿素和250mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，将含有感兴趣蛋白质的组分合并并进行重新折叠，纯化的目标蛋白在4℃下通过透析在重折叠缓冲液中重折叠2天，通过离心去除过程中的任何沉淀，并使用sephadex 25柱将重新折叠的缓冲液交换为蛋白质储存缓冲液，在还原条件下，通过考马斯蓝染色sds-page凝胶测定蛋白质纯度，使用 bca定量方法对蛋白质浓度进行定量；
[0018]
3.制备芯片：
[0019]
(1)用探针稀释液稀释到需要浓度，分装于384孔板中，并存放于4℃备用(如果是1天内点制可放4度，超过的话需存放到-80度)；
[0020]
(2)设定点样仪软件参数，阵列如下：
[0021] 123456789101112apos1pos1pos1pos2pos2pos2negnegneg111b222333444555c666777888999d101010111111121212131313e141414151515161616171717f181818191919202020212121g222222232323242424252525h262626272727negnegnegpos1pos1pos1
[0022]
(3)将阵列设计的输出参数输入到机器软件并保存和记录；
[0023]
样品放置于样品台上(样品台上可提前设定温度以保护样品)，运行机器；机器将样品点制在相应的载体上；芯片点制完成后，运行质控程序，以检验点制的样品是否点制在了设定的位置，即阵列是否整齐和规则，将不符合标准的芯片挑出并弃用；保存每张可用和不可用玻片的质控图片和参数；点制完成；
[0024]
(4)芯片点制完成后，需要进行干燥3-5小时；干燥完成后，密封包装放于4度；选出一张，进行实验测定，通过与质控的信号值进行比较来评估该次点制的芯片是否符合标准；符合标准的芯片进行包装和输出。
[0025]
检测神经系统自身免疫性致病抗体的蛋白芯片的应用，包括以下步骤：
[0026]
(1)处理样品：
[0027]
用样品稀释液稀释样品，得到上样标本每个100μl；
[0028]
(2)干燥芯片：
[0029]
将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时；
[0030]
(3)样本孵育：
[0031]
每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育1h，封闭定量抗体芯片，抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的样品到孔中，4℃过夜孵育；
[0032]
(4)清洗芯片：
[0033]
使用thermo scientific wellwash versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用洗液i进行清洗，每孔250μl的洗液i，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高。然后换用
洗液ii通道进行清洗，每孔250μl的洗液ii，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高；
[0034]
(5)生物素抗体孵育：
[0035]
离心生物素抗体小管，所有种属的生物素抗体均6000倍稀释，混合均匀后再次快速离心。添加100μl的检测抗体到每个孔中，rt摇床上孵育2小时；
[0036]
(6)清洗芯片：
[0037]
使用thermo scientific wellwash versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用洗液i进行清洗，每孔250μl的洗液i，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高。然后换用洗液ii通道进行清洗，每孔250μl的洗液ii，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高；
[0038]
(7)cy3-链霉亲和素的孵育：
[0039]
离心cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，rt摇床上孵育1个小时；
[0040]
(8)清洗芯片：
[0041]
使用thermo scientific wellwash versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用洗液i进行清洗，每孔250μl的洗液i，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，然后换用洗液ii通道进行清洗，每孔250μl的洗液ii，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高；
[0042]
(9)荧光检测：
[0043]
采用激光扫描仪例如innoscan 300扫描信号，采用cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)；
[0044]
(10)数据分析：
[0045]
采用qah-cust的数据分析软件来进行数据分析。
[0046]
本发明蛋白芯片所检测的抗体包括ndma1蛋白、iglon5蛋白、ma2蛋白、 caspr2蛋白、mog蛋白、amphiphysin蛋白、gad65蛋白、gad67蛋白、ampar1 蛋白、ampar2蛋白、gababr b1蛋白、zic4蛋白、recoverin蛋白、dner蛋白、 mag蛋白、nova-1蛋白、achr(1-210aa)蛋白、gq1b鞘糖脂、gt1b鞘糖脂、 gd1b鞘糖脂、gd1a鞘糖脂、gm3鞘糖脂、gm2鞘糖脂和gm1鞘糖脂等总计24种抗原。
[0047]
本发明显著效果是：本发明借助于生物芯片技术，将该类已知的 ndma1蛋白、iglon5蛋白、ma2蛋白、caspr2蛋白、mog蛋白、amphiphysin蛋白、gad65蛋白、gad67蛋白、ampar1蛋白、ampar2蛋白、gababr b1蛋白、zic4 蛋白、recoverin蛋白、dner蛋白、mag蛋白、nova-1蛋白、achr(1-210aa) 蛋白、gq1b鞘糖脂、gt1b鞘糖脂、gd1b鞘糖脂、gd1a鞘糖脂、gm3鞘糖脂、gm2 鞘糖脂和gm1鞘糖脂等总计24种抗原，开发蛋白芯片，检测自身免疫性疾病患者血压或脑脊液中的致病抗体，实现检测的高通量、特异性强、敏感性高、平行处理和成本低等优点，优于其他检测技术，对疾病的诊断、治疗及预后具有重要的参考价值。
附图说明
[0048]
图1为本发明芯片检测病人血浆中nmda1抗体表达的roc曲线分析示意图；
[0049]
图2为本发明芯片检测的nmdar组(nmda1抗体阳性病人)和con组(nmda1 抗体阴性病人)病人血浆中nmda1抗体的荧光强度示意图；
[0050]
图3为本发明芯片检测中nmdar组和con组病人血浆的蛋白芯片扫描图片示意图；
[0051]
图4为本发明芯片检测中con组(对照组)、ndma1组(模型组)、glyx-13 组(治疗组)和be组(治疗组)四组小鼠血浆中nmda1抗体的荧光强度示意图；
[0052]
图5为本发明芯片检测中con组(对照组)、ndma1组(模型组)、glyx-13 组(治疗组)和be组(治疗组)小鼠血浆的蛋白芯片扫描图片示意图。
具体实施方式
[0053]
下面将结合实施例对本发明的技术方案具体实施方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0054]
一种检测神经系统自身免疫性疾病致病抗体的蛋白芯片，，所述方法包括如下步骤：
[0055]
1.一种检测神经系统自身免疫性疾病致病抗体的蛋白芯片及其制备工艺和应用方法，该芯片为玻璃基片上分布有不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中分别固定能检测神经系统自身免疫性疾病抗体的特异性抗原探针。
[0056]
2.所述探针能与致病抗体特异性结合，设计24个探针，所设计的探针来源如下：
[0057][0058][0059]
利用上述设计合成的蛋白芯片，分别检测自身免疫性脑炎患者血浆及自身免疫性脑炎小鼠模型脑脊液中抗nmdar抗体表达。采用qah-cust的数据分析软件来进行数据分析。
与临床检验结果比较，检测抗nmdar抗体脑炎病人的血浆的敏感性为100％，特异性为50％(见附图1)。检测抗nmdar小鼠的血浆结果与elisa结果一致(见附图2)。