一种基于超支化聚乙烯亚胺的夹心电化学免疫分析模式对AFP进行检测的方法

一种基于超支化聚乙烯亚胺的夹心电化学免疫分析模式对afp进行检测的方法
技术领域
1.本发明属于免疫传感器领域，涉及一种基于超支化聚乙烯亚胺的夹心电化学免疫分析模式对afp进行检测的方法。


背景技术：

2.在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者宿主对肿瘤反应性的一类物质，称为肿瘤标志物。这类物质可能是循环物质，可在细胞、组织或体液中出现。肿瘤标志物通常以抗原、酶或激素等代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或宿主的体液中，医学中根据其生化或免疫特性可识别或诊断肿瘤。甲胎蛋白(afp)是一种糖蛋白，它属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。甲胎蛋白在胎儿血液循环中具有较高的浓度，出生后则下降，至生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中较难检出，故在成人血清中含量极低。甲胎蛋白具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、t淋巴细胞诱导凋亡等。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。
3.免疫分析方法是利巧抗体或抗原的特异性结合，以分析测定抗原或抗体及半抗原的分析方法。电化学免疫传感器是将电化学免疫分析与传感技术相结合的一种分析方法。根据电化学免疫传感器检测信号类型，可分为电位型免疫传感器、电容型免疫传感器、阻抗型免疫传感器、电导型免疫传感器和电流型免疫传感器。其中，电流型免疫传感器具有高灵敏度、易于信号放大而被广泛研究应用。通过标记物(酶或纳米催化剂等)作为信号放大指示器来实现高灵敏度。因此，用于构建电化学免疫传感器的纳米材料应具有较高的稳定性，良好的生物兼容性及电化学活性等。如纳米金、纳米银、碳纳米管、导电聚合物等已被广泛研究并取得进展。但是，无机金属纳米颗粒和有机聚合物制备的纳米复合材料用于电化学免疫分析有待进一步提高免疫分析传感器的精准度和电化学性能。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供一种基于超支化聚乙烯亚胺的夹心电化学免疫分析模式对afp进行检测的方法。
5.本发明具体提供了如下的技术方案：
6.一种基于超支化聚乙烯亚胺的夹心电化学免疫分析模式对afp进行检测的方法，步骤为：
7.1)将玻碳电极(gce)放入超支化聚酰亚胺(hpei)的水溶液中，在-2.0v的电位下沉积240秒，取出用水清洗，再浸入硝酸银溶液中，在-1.0v的电位下，以100mv/s的速度循环扫描20圈，沉积纳米银，之后浸入甲胎蛋白抗体(anti-afp)溶液中，在4℃下孵育12小时，制备得到传感器anti-afp/hpei-agnr/gce；
8.2)将聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯(pdm)溶解在去离子水中，加入hagcl4和nabh4，在室温下反应24小时，透析，冻干，得到产物pdm@ag；
9.3)将pdm@ag溶解到tris-hcl溶液中，加入甲胎蛋白抗体(anti-afp)，室温下搅拌，放入冰箱反应12小时，反应结束后，离心，洗涤，得到生物标记物探针bio-pdm@ag；
10.4)将传感器anti-afp/hpei-agnr/gce和系列梯度浓度的甲胎蛋白标准样品和牛血清样品孵育50分钟形成抗原抗体复合物传感器afp/anti-afp/hpei-agnr/gce；
11.5)将步骤4)得到的抗原抗体复合物传感器afp/anti-afp/hpei-agnr/gce和步骤3)得到的探针bio-pdm@ag孵育50分钟形成夹心免疫复合物；
12.6)以含有h2o2的pbs为底液，在－200v～－800v的电位范围内进行dvp扫描，测定系列梯度浓度的甲胎蛋白标准样品的电化学响应信号，得到工作曲线。
13.进一步，步骤1)所述的超支化聚酰亚胺hpei的数均分子量为10000，hpei溶液浓度为1mmol/l，所述的硝酸银溶液的浓度为5mmol/l。
14.进一步，步骤2)具体为将0.2g聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯溶解在50ml去离子水中，加入1.0ml hagcl4，1.0ml nabh4，聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯的数均分子量为2000～5000。
15.进一步，步骤3)所述的甲胎蛋白抗体的浓度为0.5mg/l，加入量为500μl。
16.进一步，步骤6)所述的h2o2溶液的浓度为3mol/l，溶液ph值5.5。
17.本发明的有益效果在于：本发明构建了一种夹心电化学免疫分析方法并用于检测肿瘤标记物甲胎蛋白afp，以anti-afp/hpei-agnr/gce为免疫传感器界面，以anti-afp标记的聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯/纳米金复合物作为生物标记指针，起到增强信号的作用，该方法操作简便，灵敏度髙，材料制备简单。
附图说明
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
19.图1电流响应与afp浓度关系图。
具体实施方式
20.下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
21.实施例1
22.一种基于超支化聚乙烯亚胺的夹心电化学免疫分析模式对afp进行检测的方法，其检测步骤为：
23.1、制备电化学免疫传感器
24.将玻碳电极(gce)分别用0.3μm和0.05μm的al2o3粉抛光至镜面，依次加入乙醇、丙酮和蒸馏水超声清洗，清洗后自然晾干，将电极放入1mmol/l的超支化聚乙烯亚胺hpei(mn＝10000)水溶液中，在-2.0v的电位下沉积240秒，取出用水清洗，再浸入5mmol/l的硝酸银溶液中，沉积纳米银，在-1.0v的电位下，以100mv/s的速度循环扫描20圈，之后浸入anti-afp抗体溶液中，在4℃下孵育12小时，制备得到传感器anti-afp/hpei-agnr/gce。
25.2、制备生物标记物探针
26.1)将0.2g聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯(pdmaema，mn＝2000～5000)溶解在
50ml去离子水中，加入1.0ml hagcl4，1.0ml nabh4，在室温下反应24小时，透析，冻干，得到纳米金修饰的pdmema，记为pdm@ag；
27.2)将pdm@ag溶解到2ml tris-hcl溶液中，加入500μl甲胎蛋白抗体(anti-afp，0.5mg/l),室温下搅拌，放入冰箱反应12小时，反应结束后，离心，洗涤，得到生物标记物探针bio-pdm@ag。
28.3、电化学免疫检测
29.1)将传感器anti-afp/hpei-agnr/gce和不同浓度的afp标准样品和牛血清样品孵育50分钟形成抗原抗体复合物传感器afp/anti-afp/hpei-agnr/gce；
30.2)将步骤1)得到的抗原抗体复合物传感器afp/anti-afp/hpei-agnr/gce和探针bio-pdm@ag孵育50分钟形成夹心免疫复合物；
31.3)以含有3mol/l的h2o2的pbs(ph＝5.5)为底液，在－200v～－800v的电位范围内进行dvp扫描，测定afp标准样品的电化学响应信号，做出标准曲线图。
32.4)将传感器anti-afp/agnr@qds/gce和待测血清样品样品孵育30分钟形成抗原抗体复合物传感器afp待测/anti-afp/agnr@qds/gce，继续和探针bio-pei-ag孵育30分钟形成夹心免疫复合物，按照步骤3)的方法测定待测血清样品中的电化学响应信号，根据步骤3)得到的标准曲线，得到血清中afp的浓度值，即得待测血清样品中afp的浓度。
33.实施例2检测结果分析
34.以bio-pdm@ag作为捕获探针，以anti-afp/hpei-agnr/gce作为信标的免疫传感器对不同浓度的afp的标准样品进行检测，检测方法为微分脉冲伏安法，实验结果如图1所示，从图1中可以看出，该免疫传感器的dpv响应电流随着afp浓度的增加而增加，对甲胎蛋白特异性抗原的检测范围为0.01-40ng/ml，检测限为0.001ng/ml，实验结果表明，制备的免疫传感器灵敏度高，响应速度快，该电化学免疫传感器的响应线性范围能够满足血清样品的检测。
35.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。