一种羧胺三唑有关物质的检测方法与流程

本发明涉及分析化学，具体涉及一种羧胺三唑有关物质的检测方法。

背景技术：

1、羧胺三唑(carboxyamidotriazole，cai)是一种非细胞毒抗肿瘤药物。化学名为5-胺基-1-[3，5-二氯-4(4-氯苯甲酰氯)苄基]-1h-1，2，3-三唑-4-苯甲酰胺，化学结构式为：

2、

3、目前研究表明，cai对多种肿瘤具有较好的效果，cai能够抑制内皮细胞和多种肿瘤细胞系如mda-mb-231、ovcar-3、mcf-7的增殖，另外它也可以抑制前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤等的侵袭。

4、目前cn202110028077.x、cn202110029565.2、pct/us1993/005438、cn202010647119.3等专利中已经公开了杂质a、杂质b、杂质c、杂质e、杂质f等5个杂质，各杂质结构式如下：

5、

6、

7、羧胺三唑的杂质f属于醛类化合物，醛类化合物在酸性条件下易形成醛水合物(aldehyde hydrate)，又称水合醛，具体为在酸性条件下，水作为亲核试剂，与醛发生相应的亲核加成反应所形成的加成产物，该加成产物最大的特点是一个碳原子上有两个羟基，因此把这种结构的产物称为偕二醇。而由于该种因素的存在，醛类化合物在反相色谱分离中易与色谱柱填料中残留的硅羟基通过氢键作用而致使峰型不对称，影响特征峰的专属性以及检测的灵敏度和准确度。同时，羧胺三唑的杂质在羧胺三唑原料药或制备中的限度较低，同样影响检测的灵敏度和准确度。

8、目前，针对上述杂质的检测方法研究尚属空白，有鉴于此，申请人利用高效液相色谱技术建立了一种能够针对羧胺三唑原料药中的多种有关物质进行快速检测的方法，该方法能够实现至少5个杂质的同步检测，分离度好、灵敏度高。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种羧胺三唑原料药有关物质的检测方法，针对羧胺三唑原料药中的至少5个有关物质进行快速检测，分离度好、灵敏度高。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一种羧胺三唑原料药中有关物质的检测方法，包括以下步骤：

4、(1)制备供试品溶液：将乙腈-水混合溶剂和羧胺三唑原料药混合，得供试品溶液；

5、(2)制备对照品溶液：将羧胺三唑对照品、杂质b对照品、杂质c对照品和乙腈-水混合溶剂混合，得对照品溶液；

6、(3)采用高效液相色谱法进行检测，其中，高效液相色谱法的条件是：

7、色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱；

8、检测波长：260-270nm；

9、柱温：22-38℃；

10、流速：0.8-1.2ml/min；

11、进样量：10-20μl；

12、系统适用性：杂质b峰与杂质c峰之间的分离度不低于1.5；

13、洗脱方式：磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液-乙腈混合液、乙酸铵缓冲液中的至少一种为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱。

14、优选地，步骤(1)中，乙腈和水的体积比为60：40。

15、优选地，步骤(1)中，所述供试品溶液中羧胺三唑的含量为0.5-1.5mg/ml，进一步优选为1.0mg/ml。

16、优选地，步骤(2)中，乙腈和水的体积比为60：40。

17、优选地，步骤(2)中，所述对照品溶液中羧胺三唑的含量为1μg/ml，杂质c的含量为0.2μg/ml、杂质b的含量为0.2μg/ml。

18、优选地，步骤(3)中，所述磷酸二氢钾缓冲液按照以下方法制备：取磷酸二氢钾，加水溶解，加磷酸调节ph即得。进一步优选地，磷酸二氢钾浓度为8-12mm，用磷酸调节ph值至3.0-3.4。更进一步优选地，磷酸二氢钾含量为10mm，用磷酸调节ph值至3.2。

19、优选地，步骤(3)中，所述高效液相色谱法的条件是：

20、色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱；

21、检测波长：262-266nm；

22、柱温：25-35℃；

23、流速：0.9-1.1ml/min；

24、进样量：10-20μl；

25、系统适应性：杂质b峰与杂质c峰之间的分离度不低于1.5；

26、洗脱方式：磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相a，其中，磷酸二氢钾缓冲液和乙腈的体积比为62-66：34-38，乙腈为流动相b，梯度洗脱。

27、更优选地，步骤(3)中，所述高效液相色谱法的条件是：

28、色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱；

29、检测波长：264nm；

30、柱温：30℃；

31、流速：1.0ml/min；

32、进样量：20μl；

33、系统适应性：杂质b峰与杂质c峰之间的分离度应不低于1.5；

34、洗脱方式：磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相a，其中，二氢钾缓冲液和乙腈的体积比为62-66：34-38，乙腈为流动相b，梯度洗脱。

35、更优选地，步骤(3)中，所述高效液相色谱法的条件是：

36、色谱柱：waters xterra rp8；

37、检测波长：264nm；

38、柱温：30℃；

39、流速：1.0ml/min；

40、进样量：20μl；

41、系统适应性：杂质b峰与杂质c峰之间的分离度应不低于1.5；

42、洗脱方式：磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相a，其中，磷酸二氢钾缓冲液和乙腈的体积比为64：36，乙腈为流动相b，梯度洗脱。

43、更优选地，步骤(3)中，所述高效液相色谱法的条件是：

44、色谱柱：waters xterra rp8；

45、检测波长：264nm；

46、柱温：30℃；

47、流速：1.0ml/min；

48、进样量：20μl；

49、系统适应性：杂质b峰与杂质c峰之间的分离度应不低于1.5；

50、洗脱方式：磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相a，其中，二氢钾缓冲液和乙腈的体积比为64：36，乙腈为流动相b，梯度洗脱，

51、洗脱条件如下：

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54、供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，按外标法以峰面积计算杂质c和杂质b的量，杂质c和杂质b均不得过0.02％；按外标法以混合对照品溶液中羧胺三唑峰面积计算其他单个杂质，其他单个杂质不得过0.10％，杂质总量不得过0.5％。

55、本发明的有益效果为：

56、(1)本检测方法具有较高的灵敏度、准确度、精密度，耐用型强，可准确反映羧胺三唑原料药有关物质的含量，适合工业上用于羧胺三唑有关物质的检测及质量控制，从而为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保食用和药用的安全性。

57、(2)本发明有利于对羧胺三唑生产的控制，有利于更好地进行产品质量控制，确保药用安全。

58、(3)本发明最突出的特点是解决了羧胺三唑与相关杂质的分离度问题，本发明通过色谱柱的选择、流动相溶剂的选择、流动相比例选择、缓冲盐浓度选择等研究，实现了羧胺三唑与五个已知杂质和多个未知杂质的有效分离，可同步实现羧胺三唑与多个杂质含量的定量检测。