一种基于SPE前处理的瓜蒌子特征图谱分析方法

一种基于spe前处理的瓜蒌子特征图谱分析方法
技术领域
1.本发明涉及中药分析及质量鉴别、控制技术领域，特别涉及一种基于spe前处理的瓜蒌子特征图谱分析方法。


背景技术：

2.瓜蒌子，为葫芦科植物栝楼trichosanthes kirilowii maxim.的干燥成熟种子，气微，味淡。瓜蒌子在我国属于种植范围较广的中药植物，其生长于向阳的地方，由于气候条件的限制，主要分布于我国北部至长江流域各地，主产于安徽、山东、河南、湖北等地。其具有清热涤痰，宽胸散结，润燥滑肠的功效，故在中药复方制剂中都有广泛的应用。目前以瓜蒌子入药的中成药很多，诸如小儿止嗽金丹、搜风理肺丸、清肺化痰丸、泻白糖浆等，在临床上用于治疗肺热咳嗽，痰浊黄稠，胸痹心痛，结胸痞满，乳痈，肺痈，肠痈，大便秘结等症。但目前关于瓜蒌子的文献报道多集中于化学成分的鉴定，还未有特征图谱方面的研究。
3.瓜蒌子属于果实种子类部分，富含油脂等亲脂性化合物，在hplc定性过程中，该类成分响应值较低且容易造成谱图分离度低、重复性差、污染柱子及检测器且不易冲洗等问题。采用固相萃取(solid-phase extraction，spe)样品预处理技术对瓜蒌子供试品预处理，其采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程。同时可根据选取不同极性洗脱液对样品进行洗脱，能够有效保留适用于hplc分析的成分，减少亲脂性化合物的干扰，该法具有操作简单、重现性好、节约溶剂等优点。特征图谱是一种体现中药化学成分整体特征的质量评价方法，对中药及其制剂的真实性、质量的一致性和稳定性均可有效地加以检测和控制，目前也已经成为业内人士的共识。在本发明之前，对瓜蒌子进行固相萃取预处理、以瓜蒌子含有的化学成分为指标建立特征图谱的方法未见报道。针对上述情况，本发明对瓜蒌子样品的固相萃取过程进行研究，采用hplc法进行特征图谱研究，严格把控瓜蒌子药材的质量，使其资源更合理的应用，为该药材的深入研究开发提供科学依据。


技术实现要素：

4.本发明目的在于，提供一种瓜蒌子的spe预处理方法及特征图谱检测方法，通过此方法可以较为全面地控制瓜蒌子药材的质量，从而更好地保证瓜蒌子产品的质量稳定性、一致性和可控性。
5.本发明的技术方案如下：一种基于spe前处理的瓜蒌子特征图谱分析方法，包括如下步骤：
6.(1)供试品溶液的制备：
7.取瓜蒌子标准汤剂冻干粉加纯水充分溶解，所述瓜蒌子标准汤剂冻干粉与纯水的质量体积比为0.3:10，超声处理、离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；取瓜蒌子固相萃取填料加入甲醇充分浸泡，所述瓜蒌子固相萃取填料与甲醇的质量体积比为1:10，装柱；用甲醇淋洗活化；再用纯水淋洗平衡；取固相萃取供试品上样；用纯水进行第一次
洗脱；用体积浓度为30～50％的甲醇洗脱液进行第二次洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，复溶，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
8.(2)对照品溶液的制备：
9.称取鸟苷对照品，以体积浓度为10％的甲醇为溶剂，配制成浓度为3.0μg/ml的对照品溶液，过滤，取续滤液作为对照品溶液；
10.(3)液相分析过程：
11.分别取供试品溶液和对照品溶液分别注入至高效液相色谱仪，测定，建立hplc特征图谱，得到瓜蒌子特征图谱。
12.进一步地，所述步骤(1)中优选体积浓度为30％的甲醇洗脱液。
13.进一步地，所述步骤(1)的瓜蒌子固相萃取填料包括sp-120-30/50-ods-rps、ods-a-hg和c8-hg。
14.进一步地，所述步骤(1)的瓜蒌子固相萃取填料优选为粒径为12nm-50μm的sp-120-30/50-ods-rps。
15.进一步地，所述步骤(1)中的瓜蒌子标准汤剂冻干粉制备条件为：取瓜蒌子饮片捣碎，加水充分浸泡，所述瓜蒌子饮片与水的质量比为1:8；加热沸腾后煎煮45min～60min，趁热过筛得到药渣，药渣中再加7质量倍的水，加热沸腾后煎煮30min～60min，趁热过滤，合并两次药液，即得瓜蒌子标准汤剂，取标准汤剂样品，冻干、得冻干粉。
16.进一步地，所述步骤(1)中超声处理的功率为250w，频率40khz；所述离心的转速为4000r/min，时间为10min；所述淋洗速度不超过1ml/min。
17.进一步地，所述步骤(1)中蒸干具体为：采用减压浓缩方式，以真空度为90mbar，转速为100rpm，水浴锅温度为60℃进行蒸干。
18.进一步地，所述步骤(2)中的过滤具体为：过0.22μm的微孔滤膜。
19.进一步地，所述步骤(3)中高效液相色谱条件具体为：色谱柱为agilent zorbax sb-c
18
(4.6mm
×
250mm,5.0μm)；柱温30～40℃；流速0.4～0.8ml
·
min-1
；检测波长230～285nm；进样量10μl；甲醇为流动相a，体积浓度为0.1％的磷酸水为流动相b；进行梯度洗脱。
20.进一步地，所述步骤(3)中高效液相色谱条件优选为：色谱柱为agilent zorbax sb-c
18
(4.6mm
×
250mm,5.0μm)；柱温35℃；流速0.6ml
·
min-1
；检测波长245nm；进样量10μl；甲醇为流动相a，0.1％磷酸水为流动相b；进行梯度洗脱。
21.进一步地，步骤(3)中所述的瓜蒌子特征图谱包括6个特征峰，以鸟苷参照物相应的峰为s2峰，计算峰2与峰1、峰3、峰4、峰5和峰6的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％之内，规定值为0.831(峰1)、2.284(峰3)、2.447(峰4)、3.046(峰5)、3.412(峰6)。
22.与现有技术相比，本发明取得以下有效成果：
23.(1)本发明建立了瓜蒌子hplc特征图谱，标定了6个共有峰，所构建的hplc特征图谱中色谱峰能够实现较好地分离，特征图谱信息丰富，色谱峰型好，检测方法具有良好的稳定性和重复性。
24.(2)本发明固相萃取预处理方法好，可有效分离亲脂性化合物，减少其对谱图的干扰，使得特征图谱的特征峰分离度更佳，辨识度更高。
25.(3)本发明构建的瓜蒌子hplc特征图谱填补了现有技术瓜蒌子质量控制的不足，
为后续瓜蒌子配方颗粒等研究提供了技术支撑。
26.(4)本发明基于高效液相色谱结合spe样品前处理技术建立瓜蒌子特征图谱，并监测其中6个特征峰，能有效保证瓜蒌子整体质量的稳定性，为富含油脂类中药材的质量鉴别提供科学依据。
附图说明
27.图1为实施例1中瓜蒌子特征图谱分析方法流程图；
28.图2为实施例1中瓜蒌子标准汤剂对照特征图谱，其中峰2为鸟苷；
29.图3为实施例2中洗脱溶剂考察结果色谱图；
30.图4为实施例2中固相萃取填料考察结果色谱图；
31.图5为实施例3中波长考察结果色谱图；
32.图6为实施例3中柱温考察结果色谱图；
33.图7为实施例3中流速考察结果色谱图；
34.图8为实施例4中色谱柱耐用性考察结果色谱图。
具体实施方式
35.这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。
36.在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
37.应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在
……
时”或“当
……
时”或“响应于确定”。
38.下面结合附图和具体实施例对本发明提出的基于spe前处理的瓜蒌子特征图谱分析方法作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
39.在以下实施例中，所涉及的仪器包括：agilent1260型高效液相色谱仪，agilent zorbax sb-c
18
色谱柱(4.6mm
×
250mm,5.0μm)，sqp电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，kq-250db超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
40.在以下实施例中，所涉及的试剂包括：甲醇(安徽天地高纯溶剂有限公司，色谱纯)，纯净水(娃哈哈有限公司)，甲醇(国药集团化学试剂有限公司)。
41.在以下实施例中，所涉及的供试品包括：瓜蒌子标准汤剂冻干粉批号：glz-190902、glz-190904、glz-190905、glz-190910。
42.在以下实施例中，所涉及的对照品包括：鸟苷(ps1215-0100成都普思生物科技有
限公司)。
43.实施例1
44.本实施例提供的是瓜蒌子特征图谱分析方法，具体按照以下步骤进行：
45.(1)供试品溶液的制备
46.取0.3g瓜蒌子标准汤剂冻干粉，加纯水10ml，功率250w，频率40khz下进行超声处理(功率为250w，频率40khz)30分钟，离心(转速为4000r/min，时间为10min)，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，瓜蒌子固相萃取柱为：内径为5.5mm，长度为57mm的sbeq-cr0001，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的体积浓度为30％的甲醇进行第二次洗脱，收集体积浓度为30％的甲醇洗脱液，蒸干(采用减压浓缩方式，真空度90mbar，转速100rpm，水浴锅温度60℃)用1ml的体积浓度为30％的甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
47.所述瓜蒌子标准汤剂冻干粉制备条件为：采用煎药壶装置，取瓜蒌子饮片100g，捣碎，加8质量倍的倍水充分浸泡30min，加热沸腾后煎煮45min～60min，趁热过120目筛网，药渣再加7倍水，加热沸腾后煎煮30min～60min，趁热过滤，合并两次药液，即瓜蒌子标准汤剂。取适量标准汤剂，冻干、得冻干粉；
48.(2)对照品溶液的制备
49.精密称取鸟苷对照品适量，精密称定，以体积浓度为10％的甲醇为溶剂，配制成浓度为3μg/ml的对照品溶液，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；
50.(3)液相分析过程
51.分别取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入至高效液相色谱仪，测定，建立hplc特征图谱(流程图如图1所示，液相色谱图如图2所示)；
52.所述高效液相色谱条件为：色谱柱为agilent zorbax sb-c
18
(4.6mm
×
250mm,5.0μm)；柱温35℃；流速0.6ml
·
min-1
；检测波长245nm；进样量10μl；甲醇为流动相a，0.1％磷酸水为流动相b；梯度洗脱程序为：
53.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～105～2095～8010～3520～4580～5535～5345～9555～553～6595～1005～0
54.最终规定：瓜蒌子特征图谱中应呈现6个特征峰，以峰2鸟苷参照物相应的峰为s峰，计算峰1、峰3、峰4、峰5和峰6与峰2(s峰)的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％之内，规定值为0.831(峰1)、2.284(峰3)、2.447(峰4)、3.046(峰5)、3.412(峰6)。
55.实施例2
56.基于实施例1，本实施例对供试品溶液制备中的洗脱溶剂、固相萃取填料进行考察，以本技术方案作进一步的说明。
57.(1)洗脱溶剂考察
58.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水
10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的10％甲醇进行第二次洗脱，收集10％甲醇洗脱液，蒸干，用1ml的10％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图3中的a所示。
59.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的20％甲醇进行第二次洗脱，收集20％甲醇洗脱液，蒸干，用1ml的20％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图3中的b所示。
60.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的30％甲醇进行第二次洗脱，收集30％甲醇洗脱液，蒸干，用1ml的30％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图3中的c所示。
61.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的40％甲醇进行第二次洗脱，收集40％甲醇洗脱液，蒸干，用1ml的40％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图3中的d所示。
62.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的50％甲醇进行第二次洗脱，收集50％甲醇洗脱液，蒸干，用1ml的50％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图3中的e所示。
63.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的80％甲醇进行第二次洗脱，收集
80％甲醇洗脱液，蒸干，用1ml的80％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图3中的f所示。
64.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，淋洗速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，淋洗速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱；用5ml的甲醇进行第二次洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，用1ml的甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图3中的g所示。
65.结果表明：中药标准汤剂中的杂质多为淀粉、多糖类、蛋白质、粘液质、鞣质色素、无机盐等水溶性成分以及小密度的油脂成分，故在spe过程中先采用纯水进行第一次洗脱，减少水溶性杂质对液相谱图的干扰。根据相似相溶原理，随着洗脱溶剂中甲醇比例的增加，大极性成分洗脱能力逐渐降低，小极性的成分洗脱能力逐渐增加。当洗脱溶剂为30％甲醇至50％甲醇时，除糅质、脂肪酸等小极性成分被保留至固相萃取小柱外，其余大极性成分均被洗脱，采用此类比例洗脱溶剂能够有效减少小极性成分对液相谱图干扰。根据液相谱图分析，当第二次洗脱溶剂为30％甲醇时，色谱峰信息较丰富，各色谱峰分离度较好，响应较高，故瓜蒌子标准汤剂spe预处理过程中采用30％甲醇作为第二次洗脱溶剂能够达到最优的色谱分析效果。
66.(2)固相萃取填料考察
67.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，1份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；分别称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱，用5ml的30％甲醇进行第二次洗脱，收集30％甲醇洗脱液，用1ml的30％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图4中的a所示。
68.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，1份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；分别称取0.5g ods-a-hg加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱，用5ml的30％甲醇进行第二次洗脱，收集30％甲醇洗脱液，用1ml的30％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图4b所示。
69.取瓜蒌子冻干粉(批号：glz-190902)0.3g，1份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；分别称取c8-hg加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱，用5ml的30％甲醇进行第二次洗脱，收集30％甲醇洗脱液，用1ml的30％甲醇复溶，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所得结果如图4c所示。结果分析：本研究中使用的三种填料类型及特点如表1所示。
70.表1固相萃取填料详情表
[0071][0072]
瓜蒌子标准汤剂ph平均值为5.4，故本研究中选用三种耐酸性固相萃取填料。根据谱图信息分析，sp-120-30/50-ods-rps及ods-a-hg填料相对c8-hg填料色谱峰信息量大，同时sp-120-30/50-ods-rps填料具有高覆盖率、高重复率、强稳定性等特点，适用于特征图谱分析过程，且该填料价格相对较便宜，从经济角度出发，故固相萃取过程中填料确定为sp-120-30/50-ods-rps。
[0073]
综上所述，瓜蒌子特征图谱供试品溶液的前处理方法为：取瓜蒌子冻干粉0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加纯水10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，离心，取油层和水层混合溶液作为固相萃取供试品；称取0.5g sp-120-30/50-ods-rps加5ml甲醇浸泡30min，装柱，用5ml甲醇淋洗活化，速度不超过1ml/min；再用5ml纯水淋洗平衡，速度不超过1ml/min；取固相萃取供试品250μl上样，用5ml纯水进行第一次洗脱，用5ml的30％甲醇进行第二次洗脱，收集30％甲醇洗脱液，用1ml的30％甲醇复溶，滤过，取续滤液，即得。
[0074]
实施例3
[0075]
基于实施例1-2，本实施例对特征图谱构建中的色谱条件(波长、柱温、流速)进行考察，以本技术方案作进一步的说明。
[0076]
(1)洗脱溶剂考察
[0077]
利用二极管阵列检测器对瓜蒌子供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液在230nm、245nm、265nm、285nm波长下的色谱图，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图5(5a、5b、5c、5d)所示。
[0078]
结果表明：在检测波长为245nm时，色谱峰信息量较大，色谱峰基线较平稳，色谱峰之间分离度较好，故将检测波长确定为245nm。
[0079]
(2)柱温考察
[0080]
分别设置柱温为30℃、35℃、40℃，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图6(6a、6b、6c)所示。
[0081]
结果表明：柱温为35℃时，色谱峰峰型较为对称，分离度适中，故将柱温设定为35℃。
[0082]
(3)流速考察
[0083]
分别设置流速为0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图7(7a、7b、7c)所示。
[0084]
结果表明：流速为0.6ml/min时，各特征峰峰型较好，分离度适中，故将流速确定为0.6ml/min。
[0085]
综上所述，瓜蒌子特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定优选为：色谱柱为agilent zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm,5.0μm)；柱温35℃；流速0.6ml
·
min-1；检测波长245nm；进样量10μl；甲醇为流动相a，0.1％磷酸水为流动相b；梯度洗脱程序为：
[0086]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～105～2095～8010～3520～4580～5535～5345～9555～553～6595～1005～0
[0087]
实施例4
[0088]
基于实施例1，本实施例还进行了如下的方法学考察，具体包括：
[0089]
(1)精密度考察
[0090]
取瓜蒌子供试品溶液，连续进样六次，计算各特征峰的峰面积及相对峰面积，保留时间及相对保留时间，所得结果如下表2-5。
[0091]
表2精密度考察结果(峰面积)
[0092][0093]
表3精密度考察结果(相对峰面积)
[0094][0095]
表4精密度考察结果(保留时间)
[0096][0097]
表5精密度考察结果(相对保留时间)
[0098]
[0099]
结果表明：本法共有峰的相对保留时间rsd及相对峰面积rsd均小于5％，该仪器精密度良好。
[0100]
(2)重复性考察
[0101]
取瓜蒌子冻干粉六份，按前述的瓜蒌子特征图谱的构建方法进行供试品溶液制备及测定，计算各特征峰的峰面积及相对峰面积，保留时间及相对保留时间，所得结果如下表6-9。
[0102]
表6重复性考察结果(峰面积)
[0103][0104][0105]
表7重复性考察结果(相对峰面积)
[0106][0107]
表8重复性考察结果(保留时间)
[0108][0109]
表9重复性考察结果(相对保留时间)
[0110][0111][0112]
结果表明：本法共有峰的相对保留时间rsd及相对峰面积rsd均小于5％，该方法重复性良好。
[0113]
(3)稳定性考察
[0114]
基于前述的瓜蒌子特征图谱的构建方法，取同一瓜蒌子供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h时同时测定，计算各特征峰的峰面积及相对峰面积，保留时间及相对保留时间，所得结果如下表10-13所示。
[0115]
表10稳定性考察结果(峰面积)
[0116][0117]
表11稳定性考察结果(相对峰面积)
[0118][0119]
表12稳定性考察结果(保留时间)
[0120][0121]
表13稳定性考察结果(相对保留时间)
[0122][0123]
结果表明：本法共有峰的相对保留时间rsd及相对峰面积rsd均小于5％，样品溶液在24h内较稳定。
[0124]
(2)色谱柱耐用性考察
[0125]
基于前述的瓜蒌子特征图谱的构建方法，分别对zorbax sb-c18(4.6mm
×
250mm，5.0μm)、ace excel 5c18-ar(4.6mm
×
250mm，5.0μm)、kromasil c18(4.6mm
×
250mm，5.0μm)3根色谱柱进行考察，所得结果如图8(8a、8b、8c)所示。
[0126]
结果表明：不同色谱柱的色谱图差异性较大，其中zorbax sb c18相比其色谱柱，色谱峰信息较多且各个峰分离度较佳，故此液相条件中固定aglient zorbax sb-c18色谱柱作为瓜蒌子特征图谱的分析柱。
[0127]
综上所述：各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值在以上各项考察中均符合要求，该分析方法可适用于瓜蒌子特征图谱分析。
[0128]
(5)特征图谱的确定及对照图谱的建立
[0129]
本发明实施例中利用3批瓜蒌子标准汤剂进行验证结果。
[0130]
基于前述的瓜蒌子特征图谱的构建方法，对三批瓜蒌子供试品进行特征图谱分析，计算各特征峰的峰面积及相对峰面积，保留时间及相对保留时间，所得结果如下表14-17所示。
[0131]
表14三批瓜蒌子标准汤剂考察结果(峰面积)
[0132]
编号峰1峰2(s)峰3峰4峰5峰6190904127.22220.98149.42165.9606.8204.11190905125.51198.54131.08155.15616.89169.12190910132.17190.18115.65125.76610.93178.17
[0133]
表15三批瓜蒌子标准汤剂考察结果(相对峰面积)
[0134]
编号峰1峰2(s)峰3峰4峰5峰61909040.5761.000.6760.7512.750.9241909050.6321.000.6600.7813.110.8521909100.6951.000.6080.6613.210.937
rsd％9.390.005.498.548.005.06
[0135]
表16三批瓜蒌子标准汤剂考察结果(保留时间)
[0136]
编号峰1峰2(s)峰3峰4峰5峰61909048.4910.1823.1124.7330.6534.041909058.3610.0923.1424.8030.9634.631909108.3810.0823.0924.7730.8834.56
[0137]
表17三批瓜蒌子标准汤剂考察结果(相对保留时间)
[0138]
编号峰1峰2(s)峰3峰4峰5峰61909040.8341.002.272.433.013.341909050.8291.002.292.463.073.431909100.8311.002.292.463.063.43rsd％0.300.000.510.711.061.53
[0139]
根据相对保留时间稳定及个批次供试品均能检出且色谱峰相对较高的原则，共选择了6个色谱峰作为特征峰。
[0140]
对照图谱的建立：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批瓜蒌子标准汤剂进行合成，建立了瓜蒌子特征图谱的对照图谱，可较为准确得整体控制瓜蒌子的质量，如图2所示。其中峰2为鸟苷。
[0141]
以上实施例并非仅限于本发明的保护范围，所有基于本发明的基本思想而进行的修改或变动都属于本发明的保护范围。