一种通过核桃叶片气孔密度鉴别核桃抗病性的方法与流程

1.本发明涉及植物种植技术领域，具体涉及一种通过核桃叶片气孔密度鉴别核桃抗病性的方法。


背景技术：

2.植物体表的自然空口有气孔、皮孔、水孔等，绝大多数细菌和真菌，都可通过自然空口侵入。在叶的解刨结构中，叶表皮中有许多气孔器分散在表皮细胞之间。气孔器是由二个肾形的保卫细胞围合而成。两个保卫细胞之间的裂生胞间隙称为气孔，他们是叶片与外界环境之间气体交换的通道。气孔在表皮上的数目、位置和分布，随植物的种类各异，且与生态条件有关。大多数植物每平方毫米的下表皮平均有气孔100-300个。
3.植物的抗病性与叶片气孔的密度存在一定的相关性，如，黄瓜叶片上气孔密度低，对霜霉病菌抗性强，反之就弱。研究表明，抗霜霉病的葡萄品种的叶片气孔的密度显著少于抗病性差的品种。富士苹果、南瓜、紫花苜蓿等植物叶片气孔密度与抗病性呈显著负相关，气孔密度越高抗病性越弱。
4.核桃细菌性黑斑病等病害是中国核桃产区危害严重的病害，可以造成30％-50％落果，导致产量降低，影响经济效益。在核桃育种过程中，培育抗病性强的品种是核桃育种的重要目标之一。然而，常规育种是一个比较漫长的过程，在确定杂交亲本的情况下，培育出一个理想的品种，需要16-20年的时间，有时甚至会更长。因此，品种的早期鉴别尤为重要。虽然分子辅助育种技术的发展，为杂种早期选择提供了可能，但因其成本较高，技术不成熟，未能得到普遍应用。
5.品种的早期鉴别是影响育种进程和育种效率的重要因素。培育的杂种幼苗通过早期鉴别和选择，可以保留综合性状优良的单株，淘汰性状差的单株。这将提高育种效率，降低品种培育的成本。
6.实际生产中发现，不同品种对核桃细菌性黑斑病的抗性不同，如
‘
礼品2号’、
‘
辽宁7号’、
‘
寒丰’抗病性强，而
‘
辽宁1号’、
‘
辽宁6号’抗病性差。如何实现品种的早期鉴别呢？观察法是通常采用的早期选择的方法之一，但肉眼观察的局限性会制约判断的准确性。


技术实现要素：

7.本发明通过提供一种通过核桃叶片气孔密度鉴别核桃抗病性的方法，以解决背景技术中的问题。
8.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
9.一种通过核桃叶片气孔密度鉴别核桃抗病性的方法，包括以下步骤：
10.步骤1)采集不同品种核桃叶片；
11.步骤2)将所述不同品种核桃叶片下表皮制备成切片；
12.步骤3)将所述切片进行显微观察气孔个数；
13.步骤4)将所述气孔个数进行记录和分析，得到不同核桃品种的叶片气孔密度；
14.步骤5)对不同核桃品种的气孔密度数据进行相关性分析，获得所述不同核桃品种的气孔密度与抗病能力的相关性；
15.步骤6)根据所述不同核桃品种的气孔密度与抗病能力的相关性和所述不同核桃品种的叶片气孔密度判断不同核桃品种抗病性的强弱。
16.作为本发明进一步方案：所述步骤1)中的核桃叶片采集通过以下方法获得：在核桃生长季，当叶片发育完全时，采集核桃树东西南北四个方向中上部位，外围的叶片，每株树采集不同方向羽状复叶中间部位小叶5片；每次采集的时间相同；将采集到的叶片用清水洗净，并用纸巾吸干叶片表面的水分备用。
17.作为本发明进一步方案：步骤2)所述将采集的核桃叶片下表皮制备成切片，通过采用火棉胶法获得：用火棉胶随机涂抹下表皮的5个部位，待火棉胶干后，再用镊子取下火棉胶薄片，置于载玻片上，用盖玻片压平，待用。
18.作为本发明进一步方案：步骤3)的操作步骤如下：将所得切片在400倍复式显微镜观察并照相；进行显微观察，随机取5个视野，用显微成像系统观察每个视野内的气孔个数n(个)，量出视野面积s(mm2)。
19.作为本发明进一步方案：步骤4)的操作步骤如下：将得到的数据进行记录、汇总，根据式(1)计算出不同核桃品种叶片的单位面积叶片气孔的密度，得到不同核桃品种的叶片气孔密度(表1)；
20.p＝n/s
ꢀꢀꢀ
(1)
21.式(1)中：p—气孔密度(个/mm2)；n—气孔个数(个)；s—视野面积(mm2)。
22.表1不同核桃品种的叶片气孔密度
[0023][0024][0025]
作为本发明进一步方案：步骤5)的操作步骤如下：将得到的数据应用spss软件进行相关性分析，其计算原理式(2)，通过分析得到的结果判断气孔密度与抗病性的相关程
度。
[0026][0027]
式(2)中：r为相关系数；分别是变量x、y的均值，xi、yi分别是变量x、y的第i个观测值。在本发明中x、y分别代表不同品种的气孔密度和病果率，xi、yi分别代表8个核桃品种的气孔密度和病果率。
[0028]
不同品种病果率调查，每个品种随机选5株树，每株树在生理落果后随机挂牌标记50个果实，7月份进行病果数调查，根据式(3)计算病果率。
[0029]
病果率(％)＝病果数/50
×
100
ꢀꢀꢀ
(3)
[0030]
通过不同核桃品种的抗病性与病果率表明(表2)，
‘
礼品2号’、
‘
辽宁5号’、
‘
寒丰’、
‘
辽宁7号
’‘
辽宁4号’5个品种病果率均在10％以下，抗病性较强，叶片气孔密度均小于80个/mm2；
‘
辽宁10号’病果率在10-20％以内，抗病性中等，气孔密度为80.52个/mm2；
‘
辽宁1号’和
‘
辽宁6号’2个品种病果率均在20％以上，不抗病，气孔密度大于125个/mm2。
[0031]
表2不同核桃品种的抗病性与病果率
[0032][0033][0034]
作为本发明进一步方案：步骤6)的操作步骤如下：所述气孔密度p＞125个/mm2为不抗病品种，p在80-125个/mm2之间为中等抗病品种，p＜80个/mm2为抗病品种。
[0035]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种通过核桃叶片气孔密度鉴别核桃抗病性的方法，本发明有效提高了核桃杂种苗的早期选择效率，加速核桃育种进程；本发明可通过气孔密度的多少，淘汰不抗病的单株，降低育种成本；另外，其他植物育种，可参照此方法鉴别植物的抗病性。
附图说明
[0036]
图1为本发明中
‘
辽宁7号’叶片下表皮的微观照片，放大倍数400倍，视野面积0.159mm2。
[0037]
图2为本发明中
‘
辽宁1号’叶片下表皮的微观照片，放大倍数400倍，视野面积0.159mm2。
具体实施方式
[0038]
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
[0039]
对大连市金普新区炮台镇松木岛村的辽宁省经济林研究所的科研基地的核桃品种的叶片气孔密度进行了观察。
[0040]
实施例1
[0041]
不同核桃品种田间病果率调查。
[0042]
(1)调查品种：
‘
辽宁1号’、
‘
辽宁4号’、
‘
辽宁5号’、
‘
辽宁6号’、
‘
辽宁7号’、
‘
辽宁10号’、
‘
寒丰’、
‘
礼品2号’。
[0043]
(2)调查方法，每个品种随机选5株树，每株树在生理落果后随机挂牌标记50个果实。
[0044]
(3)病害调查日期：2020年7月24日。
[0045]
(4)果实病果率计算方法：病果率(％)＝病果数/50
×
100
[0046]
将每个核桃品种的发病率汇总，并通过spss进行显著性分析，结果表明(表3)，不同品种的病果率存在显著差异，表示每个品种的抗病性不同。
‘
礼品2号’表现最抗病，其次为
‘
辽宁5号’和
‘
寒丰’，最不抗病的品种为
‘
辽宁1号’和
‘
辽宁6号’。
[0047]
表3不同核桃品种的病果率
[0048]
序号品种病果率(％)排序1
‘
辽宁1号’31.2a82
‘
辽宁4号’8.6bc53
‘
辽宁5号’5.4c34
‘
辽宁6号’27.6a75
‘
辽宁7号’8.0bc46
‘
辽宁10号’10.4b67
‘
寒丰’5.6c28
‘
礼品2号’0.4d1
[0049]
(注：邓肯测验，同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。只要含有相同的字母，就表明两组之间没有显著性差异。)
[0050]
实施例2
[0051]
不同核桃品种叶片气孔密度测定。
[0052]
(1)采样品种：与实施例1中的品种一致。
[0053]
(2)采样日期：2020年6月15日。采集核桃树东西南北四个方向中上部位，外围的叶片，每株树采集不同方向羽状复叶中间部位小叶5片，将采集到的叶片用清水洗净，并用纸巾吸干叶片表面的水分备用。所述将采集的核桃叶片下表皮制备成切片，通过采用火棉胶
法获得：用火棉胶随机涂抹下表皮的5个部位，待火棉胶干后，再用镊子取下火棉胶薄片，置于载玻片上，用盖玻片压平，待用。
[0054]
(3)显微观察方法：将所得切片在400倍复式显微镜观察并照相；进行显微观察，随机取5个视野，用显微成像系统观察每个视野内的气孔个数n，量出视野面积s，计算气孔密度p，视野面积为0.159mm2。将每个核桃品种的气孔密度汇总，并通过spss进行显著性分析，结果表明，不同品种的叶片气孔密度存在显著差异(表4)，
‘
辽宁1号’(图1)和
‘
辽宁6号’的气孔密度最大，每平方毫米分别为125.8个和130.82个，而
‘
辽宁7号’(图2)的气孔密度最小，为62.9个/mm2。
[0055]
表4不同核桃品种的叶片气孔密度
[0056]
序号品种叶片气孔密度(个/mm2)排序1
‘
辽宁1号’125.80a72
‘
辽宁4号’76.74bc53
‘
辽宁5号’70.46bc34
‘
辽宁6号’130.82a85
‘
辽宁7号’62.90c16
‘
辽宁10号’80.52b67
‘
寒丰’64.16bc28
‘
礼品2号’75.50bc4
[0057]
(注：邓肯测验，同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。只要含有相同的字母，就表明两组之间没有显著性差异。)
[0058]
气孔密度p＞125个/mm2为不抗病品种，p在80-125个/mm2之间为中等抗病品种，p＜80个/mm2为抗病品种。
[0059]
实施例3
[0060]
不同核桃品种果实田间发病率与叶片气孔密度相关性分析。
[0061]
将实施例1与实施例2的数据，即叶片气孔密度和病果率通过spss进行相关性分析，确定气孔密度与病果率的相关性。
[0062]
表5不同核桃品种的叶片气孔密度与病果率相关性
[0063][0064]
(
*
在0.05水平(双侧)上显著相关。)
[0065]
结果表明(表5)，不同核桃果实的田间发病率与其叶片的气孔密度存在显著的正相关，其相关系数为0.938。说明叶片气孔密度越大，核桃果实的病果率越高。
[0066]
综上所述，通过实施例1、实施例2和实施例3，可以得出结论：不同核桃品种间的叶
片气孔密度及病果率均存在显著差异，并且气孔密度与病果率存在显著正相关，存在叶片气孔密度越大病果率越高的规律，抗病品种的单位叶片气孔密度小于不抗病品种的气孔密度。如
‘
辽宁7号’叶片气孔密度明显小于
‘
辽宁1号’叶片气孔密度，其病果率
‘
辽宁7号’低于
‘
辽宁1号’，实验结果表明，通过观测核桃气孔密度的方法可以间接鉴别核桃抗病性的强弱。