植物叶片原态快速冷冻取样装置及取样系统

1.本实用新型涉及植物叶片取样领域，特别涉及一种植物叶片原态快速冷冻取样装置及取样系统。


背景技术：

2.代谢是生物体进行生命活动的基础，代谢谱分析(metabolic profilinganalysis)是指采用色谱-质谱联用技术采集样品的代谢谱图，比较不同组样品代谢产物的含量，鉴定差异表达的代谢物，进一步探索差异代谢物之间的代谢通路的一种实验方法。而代谢流分析(metabolic flux analysis)技术是指利用同位素标记(
13
c、
15
n或2h等)手段，定量追踪重同位素在细胞内随时间的动态流向和变化规律，从而阐述细胞内代谢网络的流量分布及与功能相关的生物学问题。
3.目前此两类技术已经被广泛应用于植物基本代谢的研究中。对于植物叶片的光合代谢流分析而言，通常采用
13
co2作为同位素标记气体，按照标记时间长短取多个标记样品，再利用高分辨质谱仪分析
13
c在各个光合相关中间代谢物中的丰度随标记时间的增加的变化模式，最后依靠代谢通路模型拟合出每个代谢反应的反应速率即为代谢流。
4.与动物、微生物不同，植物叶片的基本代谢对环境变化十分敏感。植物叶片的同位素标记实验对环境的稳定和取样的过程有着较高的要求，尤其是对于光合作用的相关中间代谢物。以光照条件为例，在光照强度出现变化的 100ms内，光合作用的能量底物，例如atp、nadph的含量就会出现变化。在光照强度出现变化的2s内，参与卡尔文-本森循环的中间代谢物的浓度就会收到影响(stitt and zhu,2014)。当光照强度变化超过一分钟，叶绿体的光系统就会产生状态转换，卡尔文-本森循环中的功能酶的酶活也会出现适应性变化 (eberhard,et al.,2008)。所以对于植物叶片的基本代谢研究来说，无论是代谢谱还是代谢流实验，对于取样都有较高的时间与误差要求。
5.目前该类实验的完成均主要还是依靠一些简易的组装工具人工完成，人工的取样方式主要依靠一些简单的组装工具，人工完成标记实验的各步操作 (heise,et al.,2014；ma,et al.,2014；ma,et al.,2017)，存在取样耗时长、样品之间处理难均一、系统误差大等缺点，不利于精细的植物基本代谢流、尤其是光合代谢流的分析。除此之外，一些现有的取样仪器(arrivault,et al.,2017； badger,et al.,1984；caemmerer and edmondson,1986)存在操作繁琐、取样通量低、取样时冷冻不彻底等问题，难以适应现实的同位素标记实验的要求。
6.现有技术中，植物叶片原态取样装置及取样方法的取样时间还无法达到较佳的短时效果，然而对于植物叶片原态取样来说，取样时间的长与短之间存在质的差别，其主要原因如下：
7.植物叶片的代谢状态对环境的变化响应很快。但是实际操作中，取样所需要的时间不可能是无穷小，对于在多么短的时间内完成取样就不会对植物的代谢状态造成显著影响，我们需要确定出这个时间的上确界。利用线性时不变系统的分析方法，我们可以计算出
这个技术指标(取样时间，τs)的理论上限值。根据我们的实验结果，水稻叶片对于光强变化的响应特征时间(τ
p
)约为10秒。而根据奈奎斯特-香农采样定理，为了获得系统携带的全部信息，采样时间的间隔(τi)应该不超过系统的特征时间的1/2。
[0008][0009]
也就是说，对于一个代谢处于动态变化的叶片，取样的间隔需要小于5 秒，其取样结果才能真实反映叶片代谢这个系统的变化。同样根据采样定理，在满足要求的取样间隔之内的系统变化过程可以被合理近似成若干个线性过程。在这个线性过程中，取样过程(τs)本身占取样间隔(τi)的比例即应是最后测得的代谢总变化中，取样过程造成的系统误差占叶片响应实验条件的真实代谢变化的比例。我们要求系统误差的影响不应影响实验结果的统计显著性，故取样过程(τs)应该至多是取样间隔(τi)的5％。
[0010][0011]
由此可以计算出取样时间(τs)的可接受上限是0.25秒。以上分析虽然是建立在系统的动态变化的基础上的，对于稳态的情况也同样适用。
[0012]
以往的文献报道中，代谢谱的取样通常都是手工完成(arrivault,et al., 2019；mallmann,et al.,2014；sommer,et al.,2012；turner,et al.,2016；wang,etal.,2014)，根据上述分析可知手工取样消耗的时间远大于可接受的时间上限 (0.25秒)，这意味着手工取样得到的实验数据不可避免地会带入系统误差而使实验结果或多或少地偏移真实的情况。而以往代谢流的实验都是通过一些较为简单的自制叶室完成同位素标记与取样的(heise,et al.,2014；ma,et al., 2017；szecowka,et al.,2013；xu,et al.,2021)，对于取样过程有的采用手工取样，有的采用了一些机械辅助取样(其取样时间均在0.1～0.5秒左右)。对于简单叶室来说，每次均只能标记与取样一个叶片，对于需要大量标记时间点以及生物学样本的代谢流实验来说会严重影响实验进度与实验的可重复性。本装置第一次在保证取样时间的前提下，可以多机扩展实现高通量标记与取样。
[0013]
有鉴于此，本领域技术人员设计了一种植物叶片原态快速冷冻取样装置及取样系统，以期克服上述技术问题。


技术实现要素：

[0014]
本实用新型要解决的技术问题是为了克服现有技术中植物叶片的取样具有较高的时间和误差要求，存在操作繁琐、取样通量低、取样时冷冻不彻底等缺陷，提供一种植物叶片原态快速冷冻取样装置及取样系统。
[0015]
本实用新型是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：
[0016]
一种植物叶片原态快速冷冻取样装置，其特点在于，所述植物叶片原态快速冷冻取样装置包括至少一个装置主体、控制系统和装置外围气路，所述装置主体相互串联在所述装置外围气路内，所述装置外围气路与所述控制系统连接；
[0017]
每一所述装置主体包括装置支架，以及安装在所述装置支架上的半开放叶室组件、冷冻锤、冷冻盒和气动驱动结构，所述冷冻锤位于所述半开放叶室组件的正上方，所述冷冻盒安装在所述半开放叶室组件的下方，所述气动驱动结构与所述冷冻锤连接，驱动所
述冷冻锤向所述半开放叶室组件内取样获得试样，所述试样向下落入所述冷冻盒进行快速冷冻。
[0018]
根据本实用新型的一个实施例，所述半开放叶室组件包括中间具有贯通孔的上叶室、中间具有贯通孔的下叶室和密封圈，所述上叶室和所述下叶室上下叠加，所述密封圈夹设在所述上叶室和所述下叶室之间，植物叶片夹设在所述贯通孔内，所述上叶室的上表面和所述下叶室的下表面均覆盖有一层透明薄膜；
[0019]
所述上叶室和所述下叶室的同一侧的侧部设置有进气孔，气流由所述进气孔进入叶室，所述下叶室的另一侧的侧部开设有第一出气孔，且所述上叶室的另一侧的侧部开设有第二出气孔，所述第一出气孔与所述第二出气孔之间相互连通。
[0020]
根据本实用新型的一个实施例，所述装置支架上设置有安装台，所述半开放叶室组件固定在所述安装台上，所述气动驱动结构包括高速气缸和连接杆，所述高速气缸安装在所述装置支架的下部，所述半开放叶室组件和所述冷冻锤之间通过精密导柱连接；
[0021]
所述连接杆穿过所述半开放叶室组件，一端与所述冷冻锤连接，另一端与所述高速气缸连接，通过所述高速气缸驱动所述冷冻锤上下运动。
[0022]
根据本实用新型的一个实施例，所述高速气缸的设计行程为10cm，单向行程的耗时小于等于0.05秒。
[0023]
根据本实用新型的一个实施例，所述冷冻锤呈中空的圆柱型，所述冷冻锤的下部外缘与所述贯通孔的大小一致，且所述冷冻锤的下部外缘呈切刃状。
[0024]
根据本实用新型的一个实施例，所述植物叶片原态快速冷冻取样装置还包括led光源，所述led光源设置在所述半开放叶室组件的斜上方对称的两侧。
[0025]
根据本实用新型的一个实施例，所述透明薄膜的透光率大于90％，弹性强度小于1kg
·
mm-2
。
[0026]
根据本实用新型的一个实施例，所述装置外围气路包括依次连接的载气气源、质量流量控制器和加湿器，以及依次连接的正常气源、第一气路切换阀和第二质量流量控制器，所述二氧化碳传感器和所述第二质量流量控制器分别连接至一气体混合器；
[0027]
所述气体混合器与第二气路切换阀连接，所述第二气路切换阀连接至所述装置主体，再由所述装置主体出来与第二质量流量测量器连接，并排出废气，所述装置主体和所述第二质量流量测量器之间设置一第一止回阀。
[0028]
根据本实用新型的一个实施例，所述加湿器和所述气体混合器之间还设置有温湿度传感器和二氧化碳传感器。
[0029]
根据本实用新型的一个实施例，所述加湿器与一节流阀并联。
[0030]
根据本实用新型的一个实施例，所述气体混合器和所述第二气路切换阀之间还设置有第一质量流量测量器。
[0031]
根据本实用新型的一个实施例，所述第二气路切换阀和所述第二质量流量测量器之间还设置有一旁通支路，所述旁通支路里设置有一第二止回阀。
[0032]
根据本实用新型的一个实施例，所述装置外围气路还包括同位素气源和第三质量流量测量器，所述同位素气源和所述第三质量流量测量器依次连接至所述第一气路切换阀。
[0033]
根据本实用新型的一个实施例，所述控制系统采用可编程逻辑控制器直接控制，
所述可编程逻辑控制器根据上位机发出的指令工作。
[0034]
本实用新型还提供了一种植物叶片原态快速冷冻取样系统，其特点在于，所述植物叶片原态快速冷冻取样系统包括至少一个如上所述的植物叶片原态快速冷冻取样装置。
[0035]
本实用新型的积极进步效果在于：
[0036]
本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置及取样系统，将植物叶片的同位素标记与取样过程高度自动化的同时，还大幅减少了取样耗时、提高了取样准确度和冷冻可靠性，并且装置结构设计紧凑，可扩展性强(可多个单元按要求连接)，可以多机根据实验需要进行并联、串联，从而实现高通量标记取样。
附图说明
[0037]
本实用新型上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显，在附图中相同的附图标记始终表示相同的特征，其中：
[0038]
图1为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中装置主体的结构示意图。
[0039]
图2为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中半开放叶室的结构示意图。
[0040]
图3为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中半开放叶室的侧视图。
[0041]
图4为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中外围气路结构示意图。
[0042]
图5为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置为装置四单元串联工作示意图。
[0043]
【附图标记】
[0044]
装置主体10
[0045]
装置外围气路20
[0046]
装置支架11
[0047]
半开放叶室组件12
[0048]
冷冻锤13
[0049]
冷冻盒14
[0050]
上叶室121
[0051]
下叶室122
[0052]
密封圈123
[0053]
透明薄膜15
[0054]
进气孔a
[0055]
第一出气孔b
[0056]
第二出气孔c
[0057]
安装台111
[0058]
高速气缸16
[0059]
连接杆17
[0060]
精密导柱18
[0061]
led光源19
[0062]
载气气源21
[0063]
第一质量流量控制器22
[0064]
加湿器23
[0065]
正常气源24
[0066]
第一气路切换阀25
[0067]
第二质量流量控制器26
[0068]
气体混合器27
[0069]
第二气路切换阀28
[0070]
第二质量流量测量器30
[0071]
第一止回阀31
[0072]
温湿度传感器32
[0073]
二氧化碳传感器33
[0074]
节流阀34
[0075]
第一质量流量测量器35
[0076]
旁通支路a
[0077]
控制电磁阀b
[0078]
第二止回阀36
[0079]
同位素气源40
[0080]
第三质量流量测量器41
[0081]
控制主机50
[0082]
植物叶片100
具体实施方式
[0083]
为让本实用新型的上述目的、特征和优点能更明显易懂，以下结合附图对本实用新型的具体实施方式作详细说明。
[0084]
现在将详细参考附图描述本实用新型的实施例。现在将详细参考本实用新型的优选实施例，其示例在附图中示出。在任何可能的情况下，在所有附图中将使用相同的标记来表示相同或相似的部分。
[0085]
此外，尽管本实用新型中所使用的术语是从公知公用的术语中选择的，但是本实用新型说明书中所提及的一些术语可能是申请人按他或她的判断来选择的，其详细含义在本文的描述的相关部分中说明。
[0086]
此外，要求不仅仅通过所使用的实际术语，而是还要通过每个术语所蕴含的意义来理解本实用新型。
[0087]
图1为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中装置主体的结构示意图。图2为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中半开放叶室的结构示意图。图3为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中半开放叶室的侧视图。图4为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置中外围气路结构示意图。图5为本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置为装置四单元串联工作示意图。
[0088]
如图1至图5所示，本实用新型公开了一种植物叶片原态快速冷冻取样装置，其包括至少一个装置主体10、控制系统和装置外围气路20，装置主体10 相互串联在装置外围气路20内，装置外围气路20与所述控制系统连接。每一装置主体10包括装置支架11，以及安装
在装置支架11上的半开放叶室组件12、冷冻锤13、冷冻盒14和气动驱动结构，冷冻锤13位于半开放叶室组件12的正上方，冷冻盒14安装在半开放叶室组件12的下方，所述气动驱动结构与冷冻锤13连接，驱动冷冻锤13向半开放叶室组件12内取样获得试样，所述试样向下落入冷冻盒14进行快速冷冻。装置支架11上设置有控制电磁阀b，连接所述控制系统和所述气动驱动结构。
[0089]
优选地，半开放叶室组件12包括中间具有贯通孔的上叶室121、中间具有贯通孔的下叶室122和密封圈123，上叶室121和下叶室122上下叠加，密封圈123夹设在上叶室121和下叶室122之间，植物叶片100夹设在所述贯通孔内，上叶室121的上表面和下叶室122的下表面均覆盖有一层透明薄膜 15。上叶室121和下叶室122的同一侧的侧部设置有进气孔a，气流由进气孔 a进入叶室，下叶室122的另一侧的侧部开设有第一出气孔b，且上叶室121 的另一侧的侧部开设有第二出气孔c，第一出气孔b与第二出气孔c之间相互连通。
[0090]
进一步地，装置支架11上设置有安装台111，将半开放叶室组件12固定在安装台111上，所述气动驱动结构包括高速气缸16和连接杆17，高速气缸 16安装在装置支架11的下部，半开放叶室组件12和所示冷冻锤13之间通过精密导柱18连接。连接杆17穿过半开放叶室组件12，一端与冷冻锤13连接，另一端与高速气缸16连接，通过高速气缸16驱动冷冻锤13上下运动。
[0091]
更进一步地，冷冻锤13呈中空的圆柱型，冷冻锤13的下部外缘与所述贯通孔的大小一致，且冷冻锤13的下部外缘呈切刃状。高速气缸16的设计行程为10cm，单向行程的耗时小于等于0.05秒。
[0092]
在取样之前，将干冰置于冷冻锤13中空部分起到冷冻锤13预冷效果。在到达程序预设的时间点时，冷冻锤13由高速气缸16驱动快速加速下坠，下端切刃将快速切割叶室薄膜以及叶片，并将切割下的薄膜与叶片迅速推入位于叶室下方的冷冻盒14中。
[0093]
优选地，所述植物叶片原态快速冷冻取样装置还包括led光源19，led 光源19设置在半开放叶室组件12的斜上方对称的两侧。透明薄膜15的透光率大于90％，弹性强度小于1kg
·
mm-2
。此处led灯源19可由上位机程序控制光强变化，在经过透明薄膜之后最大光强(par)需超过1200mmol
·
m-2
s-1
，并且附有风扇主动降温。
[0094]
此处，密封圈123优选为泡沫密封圈。在半开放叶室组件12夹入叶片并固定后，叶室相对密封，叶室内气流由外围气路控制、叶室内光照由led光源19提供，使得叶室内叶片处于一个人为设定的可控稳定光、湿、二氧化碳环境中。
[0095]
优选地，冷冻盒14在非取样时间段可以取出预冷，在取样前有一层可移除的泡沫隔热层防止低温影响叶室中的叶片，在取样完成后可以从装置中取出，另行对已经冷冻完毕的叶片进行分装。
[0096]
进一步地，装置外围气路20包括依次连接的载气气源21、质量流量控制器22和加湿器23，以及依次连接的正常气源24、第一气路切换阀25和第二质量流量控制器26和第二质量流量控制器26分别连接至一气体混合器27。气体混合器27与第二气路切换阀28连接，第二气路切换阀28连接至装置主体10，再由装置主体10出来与第二质量流量测量器30连接，并排出废气，装置主体10和第二质量流量测量器30之间设置一第一止回阀31。
[0097]
优选地，加湿器23和气体混合器27之间还设置有温湿度传感器32和二氧化碳传感器33。加湿器23与一节流阀34并联。气体混合器27和第二气路切换阀28之间还设置有第一
质量流量测量器35。第二气路切换阀28和第二质量流量测量器30之间还设置有一旁通支路a，旁通支路a里设置有一第二止回阀36。
[0098]
此外，装置外围气路20还包括同位素气源40和第三质量流量测量器 41，同位素气源40和第三质量流量测量器41依次连接至第一气路切换阀 25。
[0099]
所述控制系统采用可编程逻辑控制器直接控制，所述可编程逻辑控制器根据上位机发出的指令工作。
[0100]
根据上述描述，所述装置外围气路可以实现如下功能：
[0101]
一、对于半开放叶室的输入气流控制及检测：2～40l/min(精度＜ 1％)；
[0102]
二、对二氧化碳(或其他气体)的在线配比及检测：浓度0～2500ppm (精度＜1％)；
[0103]
三、对半开放叶室的输入气流的湿度控制及检测：0～85％r.h.(不结露，精度＜5％)；
[0104]
四、对于同位素气源的流量检测；
[0105]
五、对于半开放叶室的输出气流的流量检测。
[0106]
所述装置外围气路可以根据实验需要使用多种稳定同位素标记气体。如
13
co2，
18
o2以及
15
nh3。
[0107]
如图5所示，本实用新型还提供了一种植物叶片原态快速冷冻取样系统，其包括至少一个如上所述的植物叶片原态快速冷冻取样装置。这种结构可以实现非常强的可扩展性(可多个单元按要求连接)
[0108]
具体地说，本实用新型所述植物叶片原态快速冷冻取样装置可以根据实验需要实现多机任意串联、并联，组成植物叶片的同位素标记与冷冻取样阵列。阵列共享同一套外围气路20，由同一组控制主机50和上位机进行统一协调与控制。
[0109]
本实用新型还提供了一种植物叶片原态快速冷冻取样方法，其特点在于，所述植物叶片原态快速冷冻取样方法采用如上所述的植物叶片原态快速冷冻取样装置，其包括以下步骤：
[0110]
s1、装配透明薄膜至所述半开放叶室组件上。
[0111]
所述半开放叶室组件的上叶室和下叶室各由一层透明薄膜覆盖，属一次性的消耗部件，需要在每次取样前装配固定在叶室上下方，装配完成后叶室应保证气密性。
[0112]
s2、对所述植物叶片原态快速冷冻取样装置进行配置气源。
[0113]
所述半开放叶室组件中叶室的气体环境完全由人工设置，故需要提前连接叶室气源。以需要控制叶室中的二氧化碳浓度的实验情况为例，需要连接载气气源(71％氮气，余氧气的混合气)和高纯二氧化碳气源。如果是代谢流实验，即需要使用
13
co2的同位素标记实验，还需要同时连接
13
co2气源。另外，还需要连接驱动高速气缸工作的高压气源。
[0114]
s3、在所述半开放叶室组件内放置叶片。
[0115]
优选地，所述步骤s3中具体包括：抬起所述半开放叶室组件的上叶室，将待取样的叶片放入叶室中后放下所述上叶室，并通过螺丝旋钮调整所述半开放叶室组件夹压的松紧程度，保证叶室气密的前提下尽可能松弛，以免影响叶片状态。
[0116]
s4、设置各个仪器的参数。
[0117]
首先需要在控制界面设置叶室的环境参数，包括光强、气体流速和二氧化碳浓度等，其次还需要调节湿度控制阀调整气流湿度。对于同位素标记实验，还需要设置标记时间
等实验参数。
[0118]
s5、在所述半开放叶室组件内环境参数稳定后，通过一段适应时间以使得叶片的代谢保持稳态。
[0119]
这个适应时间根据实验材料的不同有所差异，一般适应20～30分钟。
[0120]
s6、对冷冻盒和冷冻锤进行预冷。
[0121]
所述冷冻盒可以优选为液氮盒。在取样前，需要先对液氮盒以及冷冻锤预冷。液氮盒可以取出单独预冷，冷冻锤不可拆卸需要将干冰(或其他冷冻介质)置入冷冻锤的中空凹槽内进行预冷。
[0122]
在临近取样时，将预冷好的液氮盒装入足量液氮后，置回装置内部，等待取样。
[0123]
对于同位素标记实验，在适应结束后，即可通过控制界面开始同位素标记，标记时间根据先前设定值进行，仪器将在到达设置的标记时间点后自动取样。
[0124]
s7、所述冷冻盒放置到位后进行冷冻取样。
[0125]
装置在控制主机50的控制下驱动冷冻锤高速下冲，将叶片分段连同叶室薄膜一同切断砸入冷冻盒中。若干秒后，冷冻锤将自动复位，取样完成。
[0126]
s8、取出所述冷冻盒，提取样品。
[0127]
将冷冻盒抽出，可使用镊子、滤网等工具将冷冻完成的叶片从冷冻盒中取出进行后续代谢物提取、上机等实验操作。
[0128]
s9、取样结束。
[0129]
关闭并断开全部气源。清理冷冻盒以及叶室中的残留叶片和薄膜碎片。断开装置电源，确认冷冻锤复位正确。
[0130]
整个取样过程可以分为三阶段，取样准备阶段、取样进行阶段和取样收尾阶段，其中步骤s1至步骤s4为取样准备阶段，步骤s5至步骤s7为取样进行阶段，以及步骤s8和步骤s9为取样收尾阶段。
[0131]
综上所述，本实用新型植物叶片原态快速冷冻取样装置及取样方法，将植物叶片的同位素标记与取样过程高度自动化的同时，还大幅减少了取样耗时、提高了取样准确度和冷冻可靠性，并且装置结构设计紧凑，可扩展性强 (可多个单元按要求连接)，可以多机根据实验需要进行并联、串联，从而实现高通量标记取样。
[0132]
虽然以上描述了本实用新型的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本实用新型的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本实用新型的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本实用新型的保护范围。