免疫学分析方法和免疫学分析试剂盒与流程

1.本发明涉及用于检测被检测物质的免疫学分析方法和免疫学分析试剂盒。本发明还涉及用于检测被检测物质的免疫学分析方法中的测定误差降低方法。本发明还涉及聚乙二醇修饰抗体及钌络合物的缀合物的制备方法。


背景技术：

2.分析生物体样品中的被检测物质的量时，有时使用应用针对被检测物质的抗体进行分析的免疫学分析方法。在免疫学分析方法中，由于简单且高灵敏度的分析是可能的，使用免疫酶标仪等分析装置自动化是可能的，测得发光或荧光而测定样品中的被检测物质的方法在以临床检查为首的许多领域中利用。
3.在测得发光或荧光方法中，在得到被检测物质的量的测定值时，需要减去未添加生物体样品的空白的值。但是，在疏水性高的标记物质与抗体结合时，存在标记抗体已附着于载体、无法正确测定被检测物质的量的情形。此外，还观察到由于标记抗体彼此凝集，无法正确测定被检测物质的量的情形。
4.专利文献1教导了化学发光免疫定量用试剂，其特征在于，将具有解离基或极性基、并且具有可与抗体的氨基反应的取代基的亲水性化合物与抗体的结合物与水溶性高分子化合物和化学发光物质结合而成。在专利文献1中，在应用中性ph条件下溶解性低的标记物质的情形中，通过向抗体添加低等电点的接头降低标记抗体的等电点，使中性ph条件下的溶解性提高。但是，为了提高灵敏度，需要通过应用以更多标记物质标记的抗体进一步使灵敏度提高、正确测定被检测物质的量的技术。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：特开昭58-77662号公报
8.发明概述
9.发明要解决的课题本发明的目的是提供使免疫学分析方法中灵敏度提高、正确分析被检测物质的量和/或存在的技术。
10.用于解决课题的手段本发明人发现，在被检测物质的免疫学分析方法中，在使具有含有被检测物质可能性的生物学样本、固定了捕获抗体的载体、和将标记物质缀合于聚乙二醇修饰抗体的标记抗体接触时，可以防止标记抗体的凝集、标记抗体对载体的非特异性吸附等，正确分析被检测物质，从而完成本发明。
11.具体地，本发明如下。
12.《1》被检测物质的免疫学分析方法，其包括使具有含有被检测物质可能性的生物学样本与缀合物接触，其中所述缀合物为聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物。
13.《2》《1》中记载的免疫学分析方法，其中，具有含有被检测物质可能性的生物学样本是选自由血液、血浆、以及血清和尿组成的组的一种以上。
14.《3》《1》或《2》中记载的免疫学分析方法，其中，聚乙二醇的重量平均分子量(mw)是
250～15000。
15.《4》《1》～《3》的任一项中记载的免疫学分析方法，其中，标记物质是电化学发光物质，免疫学分析方法是电化学发光法(ecl法)。
16.《5》《1》～《4》的任一项中记载的免疫学分析方法，其中，聚乙二醇修饰抗体是聚乙二醇修饰igm抗体或聚乙二醇修饰igg抗体。
17.《6》《1》～《5》的任一项中记载的免疫学分析方法，其中，1分子抗体中标记物质的结合分子数是10～200。
18.《7》被检测物质的免疫学分析用试剂盒，其包含聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物。
19.《8》《7》中记载的免疫学分析用试剂盒，其用于针对选自由血液、血浆、和血清组成的组的一种以上生物学样本使用。
20.《9》《7》或《8》中记载的免疫学分析用试剂盒，其中，聚乙二醇的重量平均分子量(mw)是250～15000。
21.《10》《7》～《9》的任一项中记载的免疫学分析用试剂盒，其中，标记物质是电化学发光物质，免疫学分析是电化学发光法(ecl法)。
22.《11》《7》～《10》的任一项中记载的免疫学分析用试剂盒，其中，聚乙二醇修饰抗体是聚乙二醇修饰igm抗体或聚乙二醇修饰igg抗体。
23.《12》《7》～《11》的任一项中记载的免疫学分析用试剂盒，其中，1分子抗体中标记物质的结合分子数是10～200。
24.《13》被检测物质的免疫学分析中的测定误差降低方法，其包括使具有含有被检测物质可能性的生物学样本与缀合物接触，其中所述缀合物为聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物。
25.《14》《13》中记载的测定误差降低方法，其中，具有含有被检测物质可能性的生物学样本是选自由血液、血浆、和血清组成的组的一种以上。《15》《13》或《14》中记载的测定误差降低方法，其中，聚乙二醇的重量平均分子量(mw)是250～15000。
26.《16》聚乙二醇修饰抗体及钌络合物的缀合物的制备方法，其包括以下的步骤(1)～(3)：
27.(1)使抗体与钉络合物接触、形成第一复合物的第一复合物形成步骤，
28.(2)使聚乙二醇与第一复合物接触、形成聚乙二醇修饰抗体及钉络合物的缀合物的缀合物形成步骤，和
29.(3)除去未与抗体结合的游离钌络合物的游离钌络合物除去步骤。
30.《17》《16》中记载的聚乙二醇修饰抗体及钌络合物的缀合物的制备方法，其中，前述缀合物形成步骤(2)在前述游离钌络合物除去步骤(3)之后进行。
31.本发明还包含以下实施方式。
32.(a)《1》～《6》的任一项中记载的免疫学分析方法，其中，抗体是单克隆抗体。
33.(b)《7》～《12》的任一项中记载的免疫学分析用试剂盒，其中，抗体是单克隆抗体。
34.(c)《13》～《15》的任一项中记载的测定误差降低方法，其中，抗体是单克隆抗体。
35.(d)《16》或《17》中记载的聚乙二醇修饰抗体及钌络合物的缀合物的制备方法，其中，抗体是单克隆抗体。
36.发明效果根据本发明，可以降低空白值的偏差。进一步详细地，根据本发明，即使增加每1分子抗体的标记物质的结合分子数，也可以防止空白值的偏差、标记抗体与载体的非特异性吸附引起的空白值的提高、和经由标记物质的标记抗体彼此的凝集。因此，根据本发明，可以高灵敏度地正确测定被检测物质的量。
37.附图简述
38.[图1]是显示本发明的免疫学分析方法中使用的聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物的一个实例的模式图。
[0039]
[图2]是显示作为本发明的免疫学分析方法的一个实施方式的ecl法的顺序和原理的模式图。
[0040]
用于实施发明的方式(被检测物质)
[0041]
本发明的免疫学分析方法中的被检测物质是可利用抗原抗体反应测定、可成为抗原的物质。本发明的免疫学分析方法中的被检测物质列举例如以下物质。
[0042]
ck-mb、hfabp、肌钙蛋白(肌钙蛋白i、肌钙蛋白t)、肌红蛋白等心肌标记物；纤维蛋白分解产物(例如d二聚体)、可溶性纤维蛋白、tat(凝血酶-抗凝血酶复合物)、pic(纤溶酶-纤溶酶抑制剂复合物)等凝血
·
纤溶标记物；氧化ldl、bnp(脑钠利尿肽)等循环相关标记物；脂联素等代谢相关标记物；cea(癌胚抗原)、afp(甲胎蛋白)、psa(前列腺特异性抗原)、粘蛋白型糖蛋白等肿瘤标记物；crp(c反应蛋白)、lrg(富含亮氨酸的α糖蛋白)等炎症相关标记物；流感、hiv(人免疫缺陷病毒)、hbv(乙型肝炎病毒)、hcv(丙型肝炎病毒)、弓形虫、衣原体、梅毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、降钙素原等感染病相关标记物。
[0043]
(生物学样本)
[0044]
在本发明中，作为具有含有被检测物质可能性的生物学样本，主要列举来自生物体(生物)的物质和从其提取了被检测物质的提取液等。作为来自生物体(生物)的物质，具体地，列举血液(全血)、血清、血浆、淋巴液、尿、粪便、腹水、胸水、脑脊液等。在本发明中，作为生物学样本，优选使用体液，特别是选自血液(全血)、血清、血浆、和尿的一种以上。在具有含有被检测物质可能性的生物学样本中包括从前述全血等通过离心分离、过滤、纯化等手段分离
·
分级的成分、通过有机溶剂等提取的成分、通过表面活性剂等溶解的成分、通过缓冲液等稀释的成分、或通过化学反应等修饰或改变的成分等。
[0045]
(免疫学分析方法)
[0046]
作为本发明的免疫学分析方法，列举电化学发光免疫测定法(ecl法)、酶免疫测定法(elisa法)、乳胶凝集免疫测定法(ltia法)、化学发光免疫测定法、荧光抗体法等，但不限于这些。本发明的免疫学分析方法优选电化学发光免疫测定法(ecl法)。
[0047]
此外，在本说明书中，“分析”包括被检测物质的存在的证明和/或定量。此外，有时将聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物称为peg修饰标记抗体。
[0048]
电化学发光免疫测定法(ecl法)意味着通过经通电使标记物质发光、检测该发光量而测定被检测物质的量的方法。在电化学发光免疫测定法(ecl法)中，作为标记物质，可以应用钌络合物。通过对固相(微板等)设置电极、该电极上发生自由基，使钌络合物为激发状态而发光。然后，可以检测该钌络合物的发光量。
[0049]
将第一抗体用作固相抗体、识别与第一抗体不同的表位的第二抗体用作检测抗体(标记抗体)，可以进行电化学发光免疫测定法(ecl法)。作为标记抗体，使用结合了标记物
质的聚乙二醇修饰抗体(peg修饰标记抗体)。被检测物质上存在多个相同表位的情形可以使用相同抗体作为固相抗体和peg修饰标记抗体。应用磁性粒子作为不溶性载体粒子、钌络合物作为peg修饰标记物质时的测定原理如下。下文显示本发明的一个实施方式中的测定原理，不以任何方式限制本发明的范围。
[0050]
1.使固定了抗体的磁性粒子与生物学样本接触时，生物学样本中的被检测物质与固相抗体结合。
[0051]
2.其后，使peg修饰标记抗体接触时，peg修饰标记抗体与结合于磁性粒子的被检测物质结合。
[0052]
3.除去未结合的peg修饰标记抗体后，通电时相应于与被检测物质结合的peg修饰标记抗体量发光。通过测量该发光量，正确测定样品中的被检测物质的量。
[0053]
在免疫学分析方法中，应用酶标记的酶免疫测定法(elisa法)也可以简单并且迅速地测定目标而是优选的。在夹心elisa的情形中，使用固定了识别被检测物质的第一抗体(固相抗体)的不溶性载体、和用标记物质标记的第二抗体(标记抗体)。作为标记抗体，使用使标记物质结合的聚乙二醇修饰抗体(peg修饰标记抗体)。对于使用的第一抗体识别被检测物质上的多个表位的情形，可以将第一抗体作为固相抗体和标记抗体使用。不溶性载体优选板(免疫板)。
[0054]
固定于不溶性载体的固相抗体捕获生物学样本中的被检测物质，在不溶性载体上形成抗体-被检测物质复合物。peg修饰标记抗体与前述捕获的被检测物质结合，与前述抗体-被检测物质复合物形成夹心。通过按照相应于标记物质的方法测定标记物质的量，可以测定样品中的被检测物质。抗体向不溶性载体的固定方法、抗体与标记物质的结合方法等具体方法可以使用本领域技术人员公知的方法而没有特别限制。
[0055]
在免疫学测定方法中，存在由于标记抗体与抗体结合的磁性粒子(或抗体结合的载体)的非特异性吸附、抗原不存在下也检测到信号的情形。例如，对于ecl法的情形，存在与磁性粒子结合的抗体与电化学发光物质标记抗体的复合物在抗原不存在下也以一定比例产生、抗原不存在下也检测到一定发光的情形。特别地，对于标记物质是疏水度高的钌络合物等情形，由于标记抗体与磁性粒子或载体的非特异性吸附，容易发生错误检测。此外，与一般在免疫测定系统中使用多的igg抗体比较，关于igm抗体，由于igm抗体自身的疏水度高从而抗体对结合的磁性粒子(或抗体结合的载体)的非特异性吸附，在抗原不存在下也检测到信号的可能性变高。为了避免这一点，通过聚乙二醇修饰使标记抗体的亲水性提高。由此，可以抑制标记抗体对磁性粒子或载体的非特异性吸附、抑制空白的值、和实现测定具有相同抗原浓度的溶液时的测定值再现性的改善。
[0056]
此外，通过增加与每1分子抗体结合的标记物质的量，使检测灵敏度提高是可能的。但是，将疏水度高的标记物质标记于抗体时，随着与每1分子抗体结合的标记物质的量增加，标记抗体的疏水度也变高。即，与每1分子抗体结合的标记物质的量增加时，检测灵敏度提高，但可产生空白的值的提高和再现性恶化的缺点。通过将标记抗体通过聚乙二醇修饰，即使增加与每1分子抗体结合的疏水性高的标记物质(例如，钌络合物等)的量，也可以抑制空白的值的提高和再现性恶化，因此，可以实现灵敏度的提高以及空白的值的提高和再现性恶化的抑制。
[0057]
对于本发明的免疫学分析方法中使用的抗体，单克隆抗体和多克隆抗体的任一都
可以按照公知方法制备，优选单克隆抗体。单克隆抗体可以如下得到，例如，从用被检测物质或其片段免疫的非人哺乳动物分离作为抗体产生细胞的脾细胞或淋巴结细胞，将其与具有高增殖能力的骨髓瘤衍生细胞株等融合制备杂交瘤，纯化该杂交瘤产生的抗体。此外，多克隆抗体可以从用被检测物质或其片段免疫的动物的血清得到。片段是被检测物质的部分片段，与片段结合的抗体识别被检测物质。
[0058]
作为抗体，除抗体分子全部之外，还可使用具有抗原抗体反应活性的抗体的片段，除如前述经过向动物的免疫步骤得到的那种之外，还可应用使用基因重组技术得到的那种和嵌合抗体。作为抗体的片段，优选功能性片段，例如，列举f(ab’)2、fab’、scfv等，这些片段可以通过将如前述得到的抗体用蛋白分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)处理、或将该抗体的dna克隆并以应用大肠杆菌或酵母的培养系统表达而制备。
[0059]
本发明的免疫学分析方法中使用的抗体优选与被检测物质特异性反应的抗体。“与被检测物质特异性反应”意味着与被检测物质反应、但与其它物质实质上不反应。“实质上不反应”的含义在后述。
[0060]
在本说明书中，与被检测物质“反应”、“识别”被检测物质、与被检测物质“结合”同义应用，但不限于这些示例，需要最广义地解释。抗体是否与抗原(化合物)“反应”的确认除了可以通过抗原固相化elisa法、竞争elisa法、夹心elisa法等进行外，可以通过利用表面等离子体共振(surface plasmon resonance)的原理的方法(spr法)等进行。spr法可以使用以biacore(注册商标)的名称市售的装置、传感器、试剂类进行。
[0061]
使用的抗体与某化合物“不反应”指本发明中使用的抗体与某化合物实质上不反应，“实质上不反应”指，例如，基于上述spr法，使用biacore(注册商标)t100或t200，将本发明中使用的抗体固定进行测定的情形中，未见到本发明中使用的抗体的反应性的增强。详细地，抗体与化合物的反应性指与对照(化合物非添加)的反应性相比没有显著差异。无需说明，通过上述spr法以外的本领域技术人员公知的方法或手段也可以确认“实质上不反应”。
[0062]
在本说明书中，“载体”指对于被检测物质、固定特异性识别被检测物质的抗体等的物质。例如，列举免疫板、膜、胶乳粒子、磁性粒子等不溶性的那种，但不限于这些。
[0063]
(聚乙二醇)
[0064]
本发明的免疫学分析方法中应用的聚乙二醇(有时将聚乙二醇简称为peg)只要得到本发明的效果则没有特别限定，优选聚合度是2～300的那种，更优选2～200、进一步优选2～150、进一步优选2～100、进一步优选2～50、进一步优选2～20、进一步优选2～10、最优选4～10。另外，聚合度意味着peg的结构式“ho-(ch
2-ch
2-o)n-h”中的“n”。在支链peg的情形中，聚合度表示(ch
2-ch
2-o)的全部重复单位数。即，在支链peg的各支链中包含“(ch
2-ch
2-o)1”、“(ch
2-ch
2-o)m”、和“(ch
2-ch
2-o)n”的情形中，聚合度意味着l+m+n的总计值。
[0065]
本发明的免疫学分析方法中应用的peg换算为重量平均分子量(mw)时，优选250～15000、更优选250～10000、进一步优选250～5000、进一步优选250～2000、进一步优选250～1000。另外，在本说明书中，在记载为“2～200”的情形中，包含其两端的值，该情形中范围内包含2和200。可以是支链型和直链型的任一peg，也可以包括两者。重量平均分子量(mw)可以应用尺寸排除色谱(sec：size exclusion chromatography)测定。
[0066]
(聚乙二醇修饰抗体)
[0067]
本说明书中的“聚乙二醇修饰抗体”意味着通过与peg接触与peg产生化学反应而结合的抗体。只要得到本发明的效果，在抗体的任意位置产生结合都可以，例如，可以是氨基与peg产生反应而产生结合。优选应用一个末端具有nhs基的peg，与抗体的氨基反应而结合。
[0068]
本发明的免疫学分析方法中应用的抗体是聚乙二醇修饰抗体，优选聚乙二醇修饰igm抗体或聚乙二醇修饰igg抗体，进一步优选聚乙二醇修饰igm抗体。igm抗体与igg抗体比较疏水性强，通过由疏水性强的标记物质标记，疏水性进一步变强。通过应用聚乙二醇修饰igm抗体，由于疏水性强，可以有效防止igm抗体彼此的凝集等。通过聚乙二醇的抗体的修饰可以在分析被检测物质前即刻进行，也可以应用预先制备的抗体。通过应用聚乙二醇修饰抗体，可以防止抗体与标记物质的复合物与载体等吸附、或该复合物凝集。
[0069]
(聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物)
[0070]
可以在本发明的免疫学分析方法中应用的聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物、即peg修饰标记抗体只要得到本发明的效果则没有限定，优选聚乙二醇修饰抗体及钌络合物的缀合物。可以在本发明的免疫学分析方法中应用的聚乙二醇修饰抗体及钌络合物的缀合物只要得到本发明的效果则没有限定，例如，可用包括如下顺序(1)～(3)的方法制备。
[0071]
(1)使抗体与钌络合物接触、形成第一复合物的第一复合物形成步骤，
[0072]
(2)使聚乙二醇与第一复合物接触、形成聚乙二醇修饰抗体及钌络合物的缀合物的缀合物形成步骤，和
[0073]
(3)除去未与抗体结合的游离钌络合物的游离钌络合物除去步骤。
[0074]
在前述制备方法中，为了降低空白值，前述缀合物形成步骤(2)优选在前述游离钌络合物除去步骤(3)后进行。在应用其它标记物质的情形中，也可用同样方法制备缀合物。
[0075]
在前述(1)第一复合物形成步骤中，对于钌络合物与抗体的混合比，以钌络合物与抗体的分子数为基准，抗体与钌络合物的比率优选1∶1～1∶200，更优选1∶5～1∶200，进一步优选1∶10～1∶200，进一步优选1∶20～1∶200，进一步优选1∶50～1∶150。
[0076]
在前述(2)缀合物形成步骤中，对于第一复合物与聚乙二醇的混合比，以第一复合物与聚乙二醇的分子数为基准，第一复合物与聚乙二醇的比率可以是1∶1～1∶1000、1∶1～1∶500、1∶5～1∶500、1∶10～1∶500、或1∶30～1∶300。
[0077]
与每1分子抗体结合的钌络合物的数目多则检测灵敏度变高。另一方面，该情形中，在标记物质显示疏水性的情形中，由于抗体与标记物质的复合物与载体等吸附、或该复合物凝集，有时也无法正确测定被检测物质的量。但是，即使在这样的情形中，通过应用聚乙二醇修饰抗体，也可灵敏度良好并且正确地分析被检测物质。
[0078]
在本发明的聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物中，与每1分子抗体结合的标记物质、优选钌络合物的分子数优选1～200，更优选10～200，进一步优选15～200，进一步优选20～100。标记物质向抗体的结合可以是直接结合，也可以经由接头等。
[0079]
(标记物质)
[0080]
本说明书中的“标记物质”意味着与被检测物质直接或间接结合、然后产生用于检测被检测物质的信号的物质。来自标记物质的信号的测定按照公知方法进行即可，例如，可以测定吸光度或反射光的强度。信号可以用目测确认，也可以应用特定的测定器确认。
[0081]
作为用于制备标记抗体的标记物质，例如，列举酶、荧光物质、电化学发光物质、生
物素、抗生物素蛋白、放射性同位素、胶体金粒子或着色乳胶等。本领域技术人员相应于使用的抗体和标记物质可以适当选择免疫学分析方法。电化学发光物质是通过电能激发的发光的物质，列举钌络合物和锇络合物。作为钌络合物，列举钌吡啶络合物。
[0082]
优选应用电化学发光免疫测定法(ecl法)作为免疫学分析方法，应用电化学发光物质、特别是钌络合物作为标记物质。电化学发光物质、特别是钌络合物疏水性强。因此，在ecl法中，可以极大地享受本发明的免疫学分析方法的效果。
[0083]
本发明的免疫学分析方法可以包括测定来自标记物质的信号的步骤。该步骤可以包括减去空白值。
[0084]
(测定误差降低)
[0085]
已知在免疫学的测定方法中，由于如上述空白的值的提高或标记抗体对载体的附着等，产生测定值的正或负的测定误差。在本说明书中，“测定误差降低”指将上述测定值的正或负的测定误差接近于原始的测定值(真值)。
[0086]
(免疫学分析用试剂盒)
[0087]
本发明的被检测物质的免疫学分析用试剂盒只要是包含含有聚乙二醇修饰抗体及标记物质的缀合物(peg修饰标记抗体)的试剂，则可为任意试剂盒。在含有peg修饰标记抗体的试剂(以下有时称为标记试剂)中，peg修饰标记抗体在标记试剂中可以是0.01～1000μg/ml、0.05～200μg/ml、0.1～200μg/ml、0.1～100μg/ml、或0.1～20μg/ml的浓度。在标记试剂中，peg修饰标记抗体优选以在测定系统中应添加的全部试剂和样品的混合状态中调整至0.1～100μg/ml、特别是0.1～20μg/ml的形式包含。
[0088]
本发明的被检测物质的免疫学分析用试剂盒优选进一步包含试剂(下文有时称为捕获试剂)，该试剂包含结合了未用标记物质标记的针对被检测物质的抗体(下文有时称为“捕获抗体”)的载体。结合了捕获抗体的载体在捕获试剂中可以是0.01～1000mg/ml、0.05～200mg/ml、0.1～200mg/ml、0.1～100mg/ml、或0.1～2mg/ml的浓度。在捕获试剂中，结合了捕获抗体的载体优选以在测定系统中应添加的全部试剂和样品的混合状态中调整至0.1～10mg/ml、特别是0.1～2mg/ml的形式包含。
[0089]
本发明的被检测物质的免疫学分析用试剂盒中还可以包含标准抗原物质、精度管理用抗原样品等其它检测试剂、样品稀释液、和/或使用说明书等。
[0090]
在本发明的被检测物质的免疫学分析用试剂盒中，peg修饰标记抗体和捕获抗体可以识别不同的表位，在peg修饰标记抗体识别抗原上的多个表位的情形中，可以应用同一(即识别相同表位的)抗体作为peg修饰标记抗体和捕获抗体。
[0091]
在使用ecl法的情形中，本发明的被检测物质的免疫学分析用试剂盒可以包含以下(a)和(b)。
[0092]
(a)包含聚乙二醇修饰抗体与电化学发光物质(例如，钌络合物等)的缀合物的标记试剂，和
[0093]
(b)固定了与被检测物质结合的捕获抗体的固相。
[0094]
例如，在应用磁性粒子作为固相的试剂盒中，向固定了与被检测物质结合的捕获抗体的磁性粒子添加生物学样本使之反应后，除去样品并洗涤。然后，添加聚乙二醇修饰抗体与电化学发光物质(例如，钌络合物等)的缀合物使之反应。洗涤磁性粒子后，通过施加电能使之发光测定标记物质的发光量，可以分析被检测物质。
[0095]
在使用夹心elisa法的情形中，本发明的被检测物质的免疫学分析用试剂盒可以包含以下(a)和(b)。
[0096]
(a)包含peg修饰标记抗体的标记试剂
[0097]
(b)固定了捕获抗体的不溶性载体。
[0098]
在这样的试剂盒中，首先，向固定了与被检测物质结合的捕获抗体的不溶性载体添加生物学样本后温育，除去样品并洗涤。然后，添加标记试剂后温育，加入底物使之显色。通过应用读板器等测定显色，可以分析被检测物质。
[0099]
随后列举实施例具体地说明本发明，但它们不限制本发明的范围。另外，如果没有特别说明，％意味着质量％。此外，表中的“ru-ab混合比”表示将抗体分子数作为1的情形的钌络合物的分子数的比率。
实施例
[0100]
〔制备例1〔使用的抗体的制备
[0101]
使用抗dupan-2抗体和抗降钙素原抗体作为抗体。抗dupan-2抗体是igm抗体，抗降钙素原抗体是igg抗体。此外，它们都是单克隆抗体。
[0102]
关于抗dupan-2抗体，将克隆编号s19201r细胞培养，将得到的包含抗dupan-2抗体的培养上清用阴离子交换和凝胶过滤色谱纯化，用150mm磷酸钾/150mm nacl(ph7.8)透析后使用。冷藏保存至使用时。
[0103]
对于抗降钙素原抗体，将克隆编号s02211和s02203r细胞分别移植至balb/c小鼠产生腹水。关于各自的包含得到的抗体的腹水，用阴离子交换色谱纯化从s02211克隆得到的腹水。用蛋白g色谱纯化从s02203r克隆得到的腹水。用150mm磷酸钾/150mm nacl(ph7.8)透析纯化的各自的抗体，冷藏保存至使用时。
[0104]
〔制备例2-1〔钌络合物对抗dupan-2抗体的结合
[0105]
将纯化抗体1.73mg/ml(抗dupan-2抗体、溶解于150mm磷酸钾/150mm nacl(ph7.8))加入2.0ml容量eppendorf管。向该eppendorf管加入钌络合物10mg/ml(溶解于dmso)使得抗体分子数与钌络合物分子数的比分别成为1∶5、1∶20、1∶50、或1∶100。其后在室温搅拌混合30分钟。作为钌络合物，应用钌(ii)三(联吡啶)-nhs酯(ruthenium(ii)tris(bipyridyl)-nhs ester)。
[0106]
以用过量的甘氨酸的氨基封闭游离钌络合物的nhs基(n-羟基琥珀酰亚胺基)为目的，向反应后的溶液添加2m甘氨酸(溶解于蒸馏水)使得甘氨酸的终浓度成为100mm。其后在室温混合搅拌20分钟。
[0107]
将反应后的溶液施加于用10mm磷酸钾/150mm nacl(ph6.0)平衡的sephadexg25柱(凝胶体积是20ml)，除去游离钌络合物。
[0108]
测定溶出液的a280nm的吸光度，分离见到作为蛋白的吸收波长的吸光度a280nm的吸收的级分。分离的级分用micro bca protein assay kit(thermo fisher公司)定量蛋白浓度，根据定量值算出抗体分子数。此外，测定具有钌络合物的吸收的a455nm的吸光度，根据a455nm吸光度算出分离级分的钌络合物分子数。根据算出的抗体分子数和钌络合物分子数，针对分离级分中的钌标记抗体，算出1分子抗体中标记的钌络合物分子数(表1)。制备的钌标记抗体冷藏保存至使用时。
[0109]
[表1]
[0110]
(表1)抗dupan-2抗体与钌络合物的结合比
[0111][0112]
〔制备例2-2〔钌络合物对抗降钙素原抗体的结合
[0113]
除了将从应用s02211克隆的腹水纯化的抗体用作标记抗体、抗体分子数与钌络合物分子数的比成为混合比1∶20而加入以外，与抗dupan-2抗体同样进行。每1分子抗体的结合钌络合物分子数是10个。
[0114]
〔制备例3-1〕对钌标记抗体的peg修饰
[0115]
作为一个末端被nhs化的peg，应用聚合度为4的ms(peg)4methyl-peg-nhs-ester regent(thermo fisher公司制，mw：约330)、聚合度为24的ms(peg)24methyl-peg-nhs-ester regent(thermo fisher公司制，mw：约1210)、和聚合度为约170的acrylate-peg7500-nhs(merck公司制，平均mn：约7500)。使用前即刻用蒸馏水溶解各自的peg使得成为0.1mm。关于制备例2-1～制备例2-2中制备的各钌标记抗体，为了使溶液ph成为弱碱性用150mm磷酸钾/150mm nacl(ph7.8)稀释2倍后，关于2倍稀释的钌标记抗体分子与各种peg分子以任意比率混合，在室温搅拌16小时。以用过量的甘氨酸的氨基封闭游离钌络合物的nhs基(n-羟基琥珀酰亚胺基)为目的，向搅拌后的溶液添加2m甘氨酸(溶解于蒸馏水)使得甘氨酸的终浓度成为100mm，在室温混合搅拌20分钟。制备的peg修饰钌标记抗体冷藏保存至使用时。
[0116]
制备的peg修饰钌标记抗体的细节如以下表2。
[0117]
[表2]
[0118]
(表2)制备的peg修饰钌标记抗体的细节
[0119][0120]
〔制备例3-2〔钌络合物对抗体的结合、和对钌标记抗体的peg修饰
[0121]
为了验证对抗体进行peg修饰后进行游离钌络合物的除去的情形的影响，以下列顺序制备peg修饰钌标记抗体。
[0122]
关于纯化抗体1.73mg/ml(抗dupan-2纯化igm抗体、溶解于150mm磷酸钾/
150mmnacl(ph7.8))，分别以每1.84mg份、0.92mg份、1.5mg份加入2.0ml容量eppendorf管(共3个)。其中分别以4.8μl(针对抗体1.84mg)、6.0μl(针对抗体0.92mg)、19.6μl(针对抗体1.5mg)加入钌络合物10mg/ml(m.w1057、溶解于dmso)，使得成为抗体分子数∶钌络合物分子数＝1∶20、1∶50、1∶100的比率，在室温搅拌混合30分钟。
[0123]
随后，将一侧末端被nhs化的peg 4分子连接而成的ms(peg)4methyl-peg-nhs-ester regent(thermo fisher公司制)在使用前即刻用150mm磷酸钾/150mm nacl(ph7.8)溶解使得成为1mm，混合使得钌标记抗体分子数与peg分子数的比率成为1∶30，在室温搅拌1小时。以用过量的甘氨酸的氨基封闭游离钌络合物和游离peg的nhs基为目的，向反应后的溶液添加2m甘氨酸(溶解于蒸馏水)使得甘氨酸终浓度成为100mm，在室温混合搅拌20分钟。
[0124]
将反应后的溶液施加于用10mm磷酸钾/150mm nacl(ph6.0)平衡的sephadexg25柱(凝胶体积是20ml)，除去游离钌络合物和游离的peg。
[0125]
测定溶出液的a280nm的吸光度，分离见到作为蛋白的吸收波长的吸光度a280nm的吸收的级分。分离的级分用micro bca protein assay kit(thermo fisher公司)定量蛋白的浓度，根据定量值算出抗体分子数。此外，测定具有钌络合物的吸收的a455nm的吸光度，根据a455nm吸光度算出分离级分的钌分子数。根据算出的抗体分子数和钌络合物分子数，针对分离级分中的钌标记抗体，算出1分子抗体中标记的钌络合物分子数(表3)。制备的钌标记抗体冷藏保存至使用时。
[0126]
[表3]
[0127]
(表3)制备例3-2中制备的抗dupan-2抗体与钌络合物的结合比
[0128]
制备的peg修饰钌标记抗体的细节如以下表4。
[0129]
[表4]
[0130]
(表4)制备例3-2中制备的peg修饰钌标记抗体的细节
[0131]
〔制备例4〕抗体结合磁性粒子的制备
[0132]
分离表面具有环氧基的3μm直径的30mg/ml磁性粒子1ml，应用磁石收集磁性粒子除去溶剂。以洗涤磁性粒子为目的将1ml的150mm磷酸钾/150mm nacl(ph7.8)与磁性粒子混合搅拌后，再次应用磁石收集除去溶剂。向除去溶剂的磁性粒子加入1ml的0.6mg/ml的各纯化抗体(将抗dupan-2抗体、抗降钙素原抗体溶解于150mm磷酸钾/150mmnacl(ph7.8))，在25℃用倒置搅拌器搅拌17小时使抗体与磁性粒子结合。洗涤抗体结合磁性粒子，冷藏保存至使用时。
[0133]
〔实施例1-1〕通过抗dupan-2抗体的dupan-2的分析
[0134]
(1-1)钌标记抗体液的制备
[0135]
稀释peg未修饰钌标记抗dupan-2抗体和制备例3-1中制备的抗体编号2～11的各自使得成为5μg/ml，在测定中使用。
[0136]
(1-2)抗体结合磁性粒子液的制备
[0137]
稀释制备例4中制备的抗体结合磁性粒子使得成为2mg/ml，在测定中使用。
[0138]
(1-3)测定装置
[0139]
用作为电化学发光免疫测定装置的picolumi iii(积水医疗公司制)实施测定。
[0140]
(1-4)测定
[0141]
在测定装置的预定场所设置放入装置指定的容器的磁性粒子液、和钌标记抗体液或peg修饰钌标记抗体。向测定装置指定的反应用容器分配60μl反应用溶液，随后加入30μl测定样品。将放入测定样品的反应用容器设置在测定装置的预定场所，完成测定准备。启动装置测定时，向放入测定样品的反应用容器加入25μl磁性粒子液，在28℃进行约5分钟抗原抗体反应(第一反应)。其后，用装置指定的bf分离液进行bf分离。随后，加入100μl钌标记抗体或peg修饰钌标记抗体，在28℃进行约3分钟抗原抗体反应(第二反应)。其后，用装置指定的bf分离液进行bf分离，除去未反应的钌标记抗体或peg修饰钌标记抗体。在装置的预定场所在装置指定的发光底物(三丙胺)溶液中施加电，使通过反应生成的抗原抗体夹心复合物化学发光(ecl发光)。
[0142]
ecl发光的强度因通过反应生成的抗原抗体夹心复合物(磁性粒子结合抗体-样品中的抗原物质-钌标记抗体(或peg修饰钌标记抗体))的数目而不同，根据相应于测定样品中的抗原浓度ecl发光强度的差异，可以定量抗原浓度。结果示于以下的表5。
[0143]
[表5]
[0144]
(表5)根据抗dupan-2抗体的空白的测定结果
[0145][0146]
其结果，在应用peg未修饰钌标记抗dupan-2抗体的测定系统中见到，随着对抗体的钌结合数增加，空白的同时再现性(偏差：cv)的显著恶化和空白值的提高。cv为10％以下的是钌为对于1分子抗体仅5分子标记的钌标记抗体。另一方面，在应用各种peg修饰钌标记抗dupan-2抗体的测定系统中，同时再现性大大改善。在钌为对于1分子抗体67分子标记的钌标记抗体(抗体编号8-10)中，cv也被抑制为10％以下。此外，空白的ecl发光强度也对于peg未修饰标记抗体得到抑制结果。另外，因结合的peg的聚合度的差异，空白的同时再现性和ecl发光强度未见明确差异。
[0147]
〔实施例1-2〕因peg结合方法的差异的效果程度的确认试验结果关于因peg结合方法的差异peg修饰钌标记抗dupan-2抗体的性能见到差异进行确认。应用制备例3-1或制备例3-2的方法中制备的peg修饰钌标记抗dupan-2抗体，以n＝10测定空白，进行同时再现性的确认。另外，在任一peg结合方法中，都使钌标记抗体分子与peg分子的混合比为1∶30实施对抗体的peg结合。结果示于表6。
[0148]
[表6]
[0149]
(表6)通过由制备方法3-1或3-2制备的抗dupan-2抗体的空白的测定结果
[0150][0151]
其结果，关于用任一结合方法制备的peg修饰钌标记抗dupan-2抗体，与peg未修饰钌标记抗dupan-2抗体比较，都见到空白的同时再现性(偏差：cv)的改善。但是，用制备方法3-1制备的peg修饰钌标记抗dupan-2抗体与制备方法3-2比较，同时再现性(偏差：cv)更加被改善。
[0152]
〔实施例2-1〔因对钌标记抗dupan-2抗体的peg混合比的差异的效果的确认试验关于因对抗体的peg的混合比的差异peg修饰钌标记抗dupan-2抗体的性能见到差异进行确认。作为peg的混合比，调整为钌标记抗体与peg分子数的比成为1∶30或1∶300。研究中应用制备例3-1中制备的抗体编号2和3。应用各自的抗体，测定空白(n＝10)和应用模拟dupan-2糖链序列的合成糖链制备的dupan-2抗原(表7中的std：0.05、0.1、0.5、1、2μg/ml)，关于各测定系统中的同时再现性和检测灵敏度进行确认。结果示于表7。
[0153]
[表7]
[0154]
(表7)因peg混合比的差异的效果的确认
[0155][0156]
其结果，在应用任一peg修饰钌标记抗dupan-2抗体的测定系统中，关于空白的n＝10同时再现性，相对于应用peg未修饰钌标记抗dupan-2抗体的测定系统(cv19.1％)都见到改善(cv3.7％和7.7％)。另一方面，比较std的ecl发光强度时，钌标记抗体与peg的混合比为1∶30而制备的peg修饰钌标记抗dupan-2抗体相对于混合比1∶300的那种得到强的ecl发光强度。
[0157]
〔实施例2-2〕应用peg修饰钌标记抗dupan-2抗体的dupan-2测定系统的灵敏度试验结果
[0158]
关于应用各种peg修饰钌标记抗dupan-2抗体的dupan-2测定系统、和应用peg未修饰钌标记抗dupan-2抗体的dupan-2测定系统，关于4例胰腺癌患者血清样品和应用模拟dupan-2糖链序列的合成糖链制备的dupan-2抗原(表8和9中的std：0.025、0.05、0.1μg/ml)实施测定，关于各测定系统的检测灵敏度进行确认。结果示于表8和9。
[0159]
[表8]
[0160]
(表8)胰腺癌患者血清样品和合成糖链的测定结果
[0161][0162]
[表9]
[0163]
(表9)胰腺癌患者血清样品和合成糖链的测定结果(ecl发光强度比)
[0164][0165]
其结果，相对于应用空白同时再现性是cv10％以下的钌标记抗体(钌5分子/抗体)的测定系统的发光强度，在应用同时再现性的cv抑制为10％以下、同时针对抗体可以标记更多钌的peg修饰钌标记抗体(钌12、22、67分子/抗体)的测定系统中，可以得到更强的发光强度。此外，得到随着针对抗体的钌标记分子数的增加、ecl发光强度也逐渐增加的结果。在结合的peg种类的差异和ecl发光强度的关系中，见到标记的peg的聚合度越少(短peg)、样本的ecl发光强度越高的倾向。在应用本试验中得到最强发光强度的peg4修饰钌标记抗体
的测定系统中，相对于应用peg未修饰钌标记抗体的测定系统，得到胰腺癌患者血清样品中平均13倍、合成糖链中29倍的发光强度。
[0166]
〔实施例3〕降钙素原的分析
[0167]
(3-1)钌标记抗体液的制备稀释制备例1、2-2和3-1中制备的钌标记抗降钙素原抗体和peg修饰钌标记抗降钙素原抗体使得成为20μg/ml，在测定中使用。
[0168]
(3-2)抗体结合磁性粒子液的制备稀释制备例4中制备的抗体结合磁性粒子使得成为1mg/ml，在测定中使用。
[0169]
(3-3)测定装置用作为电化学发光免疫测定装置的picolumi iii(积水医疗公司制)实施测定。
[0170]
(3-4)测定在测定装置的预定场所设置放入装置指定的容器的磁性粒子液、和钌标记抗体液或peg修饰钌标记抗体。向测定装置指定的反应用容器分配反应用溶液，随后加入20μl测定样本(作为空白的生理盐水)。将放入测定样品的反应用容器设置在测定装置的预定场所，完成测定准备。启动装置测定时，向放入测定样品的反应用容器加入50μl磁性粒子液，在28℃进行约5分钟抗原抗体反应(第一反应)。随后，加入50μl钌标记抗体液或peg修饰钌标记抗体，在28℃进行约3分钟抗原抗体反应(第二反应)。其后，用装置指定的bf分离液进行bf分离，除去未反应的钌标记抗体液或peg修饰钌标记抗体。在装置的预定场所在装置指定的发光底物(三丙胺)溶液中施加电，使通过反应生成的抗原抗体夹心复合物化学发光(ecl发光)。结果示于表10。
[0171]
[表10]
[0172]
(表10)降钙素原的分析结果
[0173][0174]
在peg未修饰钌标记抗降钙素原抗体中，产生认为因钌标记抗体以一定比例对抗体结合磁性粒子的非特异性结合的ecl发光的异常高值(跳跃值)，但应用peg修饰钌标记抗降钙素原抗体时，其被抑制(各自的数据未记载)。其结果，在peg修饰钌标记抗降钙素原抗体中，与peg未修饰钌标记抗降钙素原抗体比较，同时再现性(偏差：cv)被改善(14％)。
[0175]
产业上的可利用性本发明的目的是提供使免疫学分析方法中灵敏度提高并且正确分析被检测物质的技术。