基于受体的生物传感器的制作方法

1.本发明总体上涉及基于受体的生物传感器及其用途。
2.背景
3.吲哚因其双环和芳香结构是其化学类别中最简单和最普遍的代表。它由一个六元苯环与一个五元含氮吡咯环稠合而成，并且正是这一核心支架构成了多种天然化合物诸如激素和具有生物医学意义的合成分子的基础。
4.由于吲哚(和粪臭素)主要为疏水性芳香系，其微溶于水。它在整个动物界表现出广泛的生物活性，并充当一种主要的种间信号传导分子。它由细菌、真菌、酵母和植物从色氨酸合成，并且根据其浓度，对人类有花香、樟脑丸或粪便气味。吲哚及其甲基化类似物粪臭素广泛存在于人类和动物的日常生活中。它们被葡萄酒、肉类、乳制品、咖啡、海鲜和许多其他食物释放。
5.吲哚及其衍生物粪臭素的检测至关重要，并且其诊断价值在农业食物链、环境指标、过程制造部门和临床领域都很明显。
6.食物的感官特性部分取决于吲哚的存在及相应的浓度。这些化合物的强烈吸引力促进了它们作为添加剂在个人护理产品和调味剂(例如巧克力、咖啡、冰淇淋、香烟和糖果)中的应用。吲哚是制造香料、药物和除害剂(pesticide)的常用试剂。检测这些化合物对于生产过程中的安全和质量保证目的至关重要。
7.确保食品安全和质量分别对公众健康和限制食品腐败至关重要。作为分解和微生物污染的指标，吲哚和粪臭素已被提议作为甲壳类动物、鱼类和牡蛎等海洋食品的质量指标。同样，吲哚和粪臭素也可用作食物粪便污染的标志物。
8.猪肉是增长最快的牲畜分部门之一，并且需求急剧上升，特别是在巴西和中国。令人不快的气味(即，猪肉中所谓的公猪异味(boar taint))的存在对猪肉供应链构成了巨大风险，并且消费者的接受程度直接取决于其渗透猪肉的程度。公猪异味被视为一种穿透性的“动物”、“尿液”、“粪便”或“汗液”样令人不快的气味。吲哚、粪臭素和雄甾烯酮是这种恶臭的主要来源。尽管使用了化学分析工具和感官评价小组(sensory panels)来检测其中一些化合物，但目前尚无令人满意的解决方案来检测屠宰线中的公猪异味，以满足行业速度、灵敏度和选择性要求。
9.工业牲畜生产是环境异味的来源，可能对动物、工人和附近的人群有害。粪臭素与多种健康状况有关。在高剂量，粪臭素是一种肺毒素，会在反刍动物中引起急性肺水肿和肺气肿，并会损害动物和人类的肺和肝脏。它也被认为是一种神经毒剂，会诱导大鼠嗅觉上皮退化，导致可逆性嗅觉丧失。因此，粪臭素可用作农业、严重依赖该化合物的行业(诸如香料厂)或污水处理厂的环境指标。
10.在全球范围内，人类、动物和农业用水正在增加。确保供水对于消费和灌溉目的而言保持安全是一个优先事项，这需要对指示生物，诸如大肠菌群细菌、粪便细菌、沙门氏菌或霍乱弧菌进行监测。因此，可以使用吲哚和粪臭素作为生物标志物对这些产吲哚生物体进行监测。
11.吲哚也是食源性致病性大肠杆菌(大肠杆菌o157:h7)的特征性生物标志物，许多报告表明其高产生。致病性食源性大肠杆菌o157:h7可引起出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征，并且儿童是高危人群。
12.吲哚和粪臭素以及挥发性含硫化合物是呼吸气味和口臭的主要成分，并且可用作诊断口臭和潜在病因(包括代谢疾病和口腔炎症)的临床标志物。肠癌患者比健康个体具有更高粪便粪臭素含量，这表明粪臭素在这方面也可能是一种有价值的生物医学标记物。
13.过去二十年见证了昆虫受体的发现，从最初在黑腹果蝇(drosophila melanogaster)中描述的那些开始，随后是来自几个蚊物种的那些受体。从那时起，数百个昆虫基因组和数千个气味受体(or)基因被注释，代表了潜在生物识别元件的无限和未开发的来源。然而，这些受体中的绝大多数仍然是孤儿，在生物感测中没有可预见的用途。来自黑腹果蝇(d.melanogaster)的去孤儿化or对生物感测中有限关注的高浓度化合物表现出不同程度的混交性(promiscuity)。
14.蚊or的第一次大规模去孤儿化努力导致了命名为or2的吲哚受体的鉴定。密切相关的种内同源or10是几个蚊物种中的粪臭素受体。该基因亚组的第三个成员or9也显示出作为粪臭素受体的作用。有趣的是，根据基于细胞的测定，在可达到较高皮摩尔范围的浓度，or2和or9/or10对两种密切相关的化学类似物吲哚和粪臭素表现出反向选择性。这些药理学特征与信息素受体的药理学特征相当或更好，信息素受体是气味受体敏感性和选择性的典型。与信息素受体相反，吲哚or的优势在于其对吲哚和粪臭素(两种在许多研究领域和工业中具有重要意义的化合物)的选择性和有时具有特异性的关系。
15.wo 2018/116186教导了一种传感器设备，其包括与基底电连通的昆虫orx，其中所述设备被配置为检测所述基底的电特性的变化。
16.出版物
17.[1]wo 2018/116186
[0018]
概述
[0019]
高灵敏度和高选择性检测挥发性有机化合物(voc)的能力提供了广泛的应用。本文公开的技术的发明人已经认识到，这种期望的能力可以由肽系统提供，其中哺乳动物或其它受体，如本文公开的，完成任务。
[0020]
在本文公开的示例性系统中，将蚊源性吲哚能(indolergic)受体or9(迄今发现的最敏感的气味受体)与cnt-fet设备结合以产生吲哚和粪臭素特异性生物电子鼻。通过利用成熟的异源表达方案，or9与or共受体(orco)一起表达，或者作为单个跨膜受体表达。通过共价修饰对含or9的小膜片段进行纯化并进一步固定到cnt晶体管通道的侧壁上，得到了本发明主题的基于or9的cnt-fet生物电子鼻。
[0021]
与orco-or9相比，or9的固定化直接影响信号转导机制，并最终影响最终的读出。包括orco作为本文公开的cnt-fet设备的一个组成部分导致整体性能提高。orco是一种专用阳离子通道，并且会有效转导配体结合。当使用小带隙半导体cnt时，配体诱导的阳离子电流增加正栅极电压下的cnt电导(当电子是主要电荷载流子时)。阳离子电荷通常通过为电子创造较低的电阻路径来降低cnt电阻。类似地，在电流-栅极电压扫描(i-v)期间观察到导通的阈值栅极电压偏移。这种偏移反映了由于cnt侧壁附近的电荷引起的局部选通效应。
[0022]
然而，对于生物电子感测来说，并不严格要求存在orco。配体结合诱导的or9构象
变化足以影响cnt侧壁附近的局部电场，从而导致电导改变。这种敏感性归因于cnt 1d通道传输动力学。
[0023]
尽管生物电子感测有许多优点，但迄今为止开发的大多数方法和设备都有固有的噪声，并且由于有机分子在各种换能器表面的非特异性吸附而具有相对较差的选择性。单分子方法可能会缓解这一限制。
[0024]
因此，本文公开的发明在其最广泛的方面设想使用受体，即细胞相关蛋白，用于构建用于检测至少一种挥发性有机化合物(voc)的存在的生物电子传感器，所述传感器包括共价固定单个受体的单个碳纳米管(cnt)，其中voc的缔合/结合/相互作用允许可测量的电场效应。
[0025]
如本文所用，受体可以是任何细胞相关的蛋白质或糖蛋白或蛋白聚糖或其它能够选择性结合生物活性分子的聚糖诸如神经节苷脂。受体可以是包含能够选择性结合voc的识别位点的任何这样的蛋白质或其片段。
[0026]
受体可以是哺乳动物受体、细菌受体、真菌受体、植物受体或昆虫受体。也可以使用其他受体。在一些实施方案中，受体是昆虫受体，例如源自有翅昆虫或无翅昆虫。昆虫的非限制性例子包括蚊和蝇。在一些实施例中，昆虫是蚊。
[0027]
受体可选自膜结合受体、胞质受体、核受体、单体受体或多聚体受体。
[0028]
因此，本发明提供了用于检测至少一种voc的存在的生物电子传感器，该传感器包括共价固定任选为哺乳动物或昆虫受体的单个受体的单个碳纳米管(cnt)，其中voc与所述受体的缔合/结合/相互作用允许可测量的电场效应。
[0029]
在一些实施方案中，voc是具有在标准大气压测得的沸点小于或等于250℃的至少一种有机化合物。voc可根据其结构以及是否存在一种或更多种官能团(functionalities)进行选择。在一些实施方案中，voc选自脂肪族voc、芳香族voc、碳环voc、杂环voc、稠环voc、极性voc、水载voc、空气载voc、甾体voc等。
[0030]
这样的voc的非限制性实例可包括乙醛、乙酸、丙酮、乙腈、丙烯醛、丙烯酰胺、丙烯腈、烯丙醇、烯丙基氯、氨基乙醇、雄甾烯酮、雄甾二烯酮、苯胺、苄基氯、丁烷硫醇、丁醇、丁胺、氯乙醛、氯苯、氯仿、环己醇、二氯苯、二氯甲烷、二甲胺、二羟基甲烷、二噁烷、乙硫醇、乙酸乙酯、乙胺、甲醛、甲酸、土臭素、甲硫醇、乙酸甲酯、丙烯酸甲酯、甲基溴、1-辛烯-3-醇、吲哚、粪臭素、甲乙酮、苯酚、环氧丙烷、四氢呋喃、氯乙烯及其衍生物。
[0031]
在一些实施方案中，voc是吲哚和吲哚衍生物。
[0032]
在一些实施方案中，voc是吲哚和粪臭素。
[0033]
本发明还提供了用于检测至少一种吲哚的存在的生物电子传感器，所述传感器包括共价固定单个受体的单个碳纳米管(cnt)，如所定义和选择的，其中所述至少一种吲哚与所述受体的缔合/结合/相互作用允许可测量的电场效应。
[0034]
在一些实施方案中，所述受体是蚊源性吲哚能气味受体(or)，并因此提供所述生物电子传感器用于检测至少一种吲哚的存在，所述传感器包括共价固定单个蚊源性吲哚能气味受体(or)的单个碳纳米管(cnt)，其中所述至少一种吲哚与所述受体的缔合/结合/相互作用允许可测量的电场效应。
[0035]
本发明的生物电子传感器是单分子场效应晶体管(smfet)，其包括受体形式的生物识别部分和非生物或电子部分，所述受体例如蚊源性吲哚能气味受体orx(选自or2、or9
和or10)，所述生物识别部分在传感器对voc(例如吲哚)分子的选择性中起作用，所述非生物或电子部分的作用是保持或增加传感器的灵敏度。传感器的两个部分通过碳纳米管(cnt)连接在一起，形成晶体管设备。
[0036]
因此，本发明还提供了设置在基底表面上的smfet，所述smfet包括一个cnt和与其共价偶联的捕获探针，其中所述捕获探针包含被配置为结合或缔合至少一个voc(例如吲哚)的至少一个受体(例如蚊源性吲哚能气味受体(orx))，并且其中所述smfet还包括至少一个电极组件，其被设置在所述一个cnt的相对端附近以将所述一个cnt电耦合至所述基底。
[0037]
单分子生物电子学提供了一种基于特异性结合电子的直接电子转导的实验方法。直接电子转导避免使用光学设备和光源，并允许使用低形状因子设备(low-form-factor device)，以及提供比光学检测器所获得的高几个数量级的信号水平。
[0038]
在生物分子相互作用和动力学的非侵入性、无标记研究中，单分子场效应晶体管(smfet)具有达到亚微秒时间尺度的前所未有的能力，克服了现有技术的局限性。
[0039]
本发明的cnt-smfet设备的特征在于电导对在cnt例如swcnt侧壁上产生的点缺陷的几个德拜长度内的局部电荷敏感。该功能化位点可作为研究中的cnt系留or/orco分子的附接点。在100mv的源漏电压偏置下，典型smfet的电流信号水平为几十纳安(na)。
[0040]
在本发明设备的一些实施方案中，受体是orco或or或两者的组合，充当与生物功能化cnt-fet阵列形式的定制开发的生物电子测定平台一起使用的生物识别元件，所述生物功能化cnt-fet阵列被组装到与印刷电路板(pcb)对接的生物芯片中。该阵列被分割成特定的生物感测区域，能够实时询问多个配体结合。该板可以包括几十个或几百个可独立寻址的测量通道，可同时进行实时询问。每个通道的漏极和源极电位完全可调，并由至少一个增益级和高阶(至少二阶)抗混叠滤波器拓扑组成。可以结合fpga模块来对接硬件和软件。pcb还包括多路复用器、解码器和模数转换器。smfet生物芯片可以通过芯片载体封装并安装在电路板上。也可以使用支持实时测量和数据采集的指定软件。或者，也可使用cmos集成生物芯片，其在芯片上包含所有所需的电子器件，并且因此单个芯片上可包含数千至数百万个smfet设备。
[0041]
也可以存在指定的微流体流动通道，其包括用于引入不同试剂的入口和出口。通道可由硅弹性体，诸如聚二甲基硅氧烷(pdms)或任何其他生物相容性聚合物制成。
[0042]
捕获探针或生物识别元件不是dna或核苷酸或任何其他类型的核酸。在本发明的所有设备中，捕获探针是受体，在一些实施方案中是通过共价缔合直接或间接固定到cnt的or或富集有or的膜。当共价缔合是间接的，即通过连接原子或连接体部分时，可选择连接体部分以基本上不改变固定的生物识别部分的结构和功能，且同时提供不可逆的结合。进一步选择连接体以控制or的对齐，从而确保灵敏度、高增益和传感器可重复性。这样的连接体的一个非限制性实例是胺修饰的磷脂，其通过胺基基团与cnt缺陷位点缀合，同时脂质尾部在主体(bulk)中突出。因此，这些脂质尾部可以通过突出的脂质尾部和膜双层的疏水相互作用，在功能上对齐含or-或orco-或orco-or的膜片段(或任何其他人工膜)。
[0043]
连接体部分通过cnt主链上的单个碳原子(通过由重氮化合物或分子量低于1kda的小分子的任何其他有机化合物的物理限制或电化学控制还原产生的cnt部分上的点缺陷)与cnt缔合。在一些实施方案中，连接体部分是以连续链为结构的链状分子，其任选地选
imprimens、aedes inermis、aedes infirmatus、aedes intrudens、日本伊蚊(aedes japonicus)、科氏伊蚊(aedes kochi)、aedes kompi、高丽伊蚊(aedes koreicus)、窄翅伊蚊(aedes lineatopennis)、黄头伊蚊(aedes luteocephalus)、aedes madagascarensis、马来伊蚊(aedes malayensis)、aedes marshallii、aedes masculinus、aedes mediolineatus、中斑伊蚊(aedes mediovittatus)、aedes mefouensis、黑色伊蚊(aedes melanimon)、aedes meronephada、aedes michaelikati、米氏伊蚊(aedes mitchellae)、aedes mohani、aedes monticola、aedes muelleri、aedes nevadensis、aedes ngong、aedes niphadopsis、新雪伊蚊(aedes niveus)、aedes notoscriptus、aedes nummatus、aedes ostentation、aedes palpalis、奔巴伊蚊(aedes pembaensis)、aedes pexus、波里尼西伊蚊(aedes polynesiensis)、aedes pseudoniveus、aedes pseudonummatus、aedes pulchritarsis、黑头伊蚊(aedes pullatus)、aedes pulverulentus、aedes punctodes、aedes punctor、aedes purpureipes、aedes purpureifemur、aedes rempeli、乡村伊蚊(aedes rusticus)、肩胛伊蚊(aedes scapularis)、aedes schizopinax、鳞斑伊蚊(aedes scutellaris)、烦扰伊蚊(aedes sollicitan)s、aedes spilotus、aedes squamiger、aedes stricklandi、aedes sylvaticus、带喙伊蚊(aedes taeniorhynchus)、泰氏伊蚊(aedes taylori)、aedes thelcter、aedes thibaulti、aedes thomsoni、aedes tiptoni、aedes togoi、aedes tormentor、aedes tortilis、aedes turneri、aedes varipalpus、aedes ventrovittis、aedes vexans、警觉伊蚊(aedes vigilax)、条纹伊蚊(aedes vittatus)、aedes washinoi、aedes wauensis和aedes zoosophus。
[0049]
在一些实施方案中，蚊源性吲哚能受体源自埃及伊蚊。
[0050]
在一些实施方案中，所述受体是哺乳动物雄甾烯酮受体。
[0051]
在一些实施方案中，所述受体是蝇土臭素受体。
[0052]
在一些实施方案中，生物识别部分是蚊源性吲哚能受体or2、or9或or10。在一些实施方案中，受体是or9。
[0053]
在一些实施方案中，生物识别部分是蚊源性吲哚能受体or8。
[0054]
在一些实施方案中，or9源自库蚊属和伊蚊属，例如埃及伊蚊和白纹伊蚊。
[0055]
在一些实施方案中，蚊源性吲哚能受体是源自蚊亚科库蚊亚科(culicinae)的or9同源物。
[0056]
在一些实施方案中，源自埃及伊蚊的蚊源性吲哚能气味受体选自具有genbank编号or2:ach69138、or9:ach69140和/或or10:ach69137的受体。
[0057]
其他蚊源性吲哚能受体包括or2、or9和or10同源物，诸如aex65778、adf42901、kfb39839、ach69144、xp_310173、aio10776、ach69149、etn60992、m.10291、kxj75419、xp_001864543、kxj77288、adf42902、ach69146、xp_310172、ach69150、kfb39838、etn65485、m.26775。
[0058]
其他蚊源性1-辛烯-3-醇受体包括or8同源物，诸如np_001345386、daa80358、xp_029725568、alv83717、xp_001864496、kfb40732、xp_321153、m.134618。
[0059]
蝇源性土臭素受体包括or56a同源物，诸如np_523796、xp_001361440、abl73972、alc42765。
[0060]
哺乳动物来源的类固醇受体包括or7d4同源物和变体，诸如np_001005191、np_
001161837、acz52483、xp_002828654、np_001266172、acz52482、ehh59162、xp_011849674、np_001161801、np_001295931、acz52479、xp_011810305。
[0061]
在一些实施方案中，生物识别部分是or-共受体(orco)。在使用orco的情况下，与吲哚的相互作用诱导阳离子离子通道打开，并且随后的阳离子流入将正电荷瞬时定位在cnt附近，从而产生显著的电场效应。
[0062]
cnt可选自任何已知的碳纳米管系统。该术语包括单壁碳纳米管(swcnt)、双壁碳纳米管(dwcnt)、多壁碳纳米管(mwcnt)等。在一些实施例中，cnt是swcnt。
[0063]
在一些实施方案中，在本发明的设备中，单个or9受体或orco与单个swcnt分子共价缔合。
[0064]
使用or或orco激动剂的结合事件的化学-电子转导的各个方面可用于实时监测设备电导。or或orco配体的结合亲和力通常是低的，并且将实现对捕获和释放动态的监测。此外，栅电极施加的电势对受体的构象行为和结合活性有影响，从而允许进一步研究or-吲哚体系的热力学特性。
[0065]
在本发明设备的一些实施方式中，本发明的生物电子传感器以隔离的or-或orco-功能化的cnt-fet阵列的形式提供，所述or-或orco-功能化的cnt-fet阵列被组装为与印刷电路板(pcb)对接的生物芯片。该阵列可以被分割成特定的生物感测区域，能够实时询问多个吲哚结合。pcb包含信号采集所需的所有电子元件，如放大器、模数和数模转换器、多路复用器等。
[0066]
cnt-smfet和or的组合具有更广泛的临床诊断意义。对非侵入性疾病生物标志物的搜寻已经产生了广泛的肺癌、ibd和糖尿病生物标志物以及感染性疾病生物标志物。orx的广泛序列多样性表明，它们可用于通过自然识别、交叉反应或作为靶向进化的结果来鉴定生物标志物。使用orx检测生物标志物在即时(point-of-care)诊断方面具有巨大的潜力。
[0067]
此外，本发明实现了高通量的voc筛选，其与环境监测、无害驱蚊剂的筛选、信息化学物质的鉴定等相关。病媒传播的(vector-borne)感染性疾病的预防主要基于病媒控制，特别是蚊控制。不断寻求新的工具和技术来减少疾病的传播。在不同的方法中，开发无害的驱避剂/引诱剂处于前沿。因此，迫切需要能够经济地提供药物依赖性受体活化或结构重排的快速和准确报告并能够筛选大的化合物库的工具。本文描述的生物电子实验系统同时满足了这两个要求。
[0068]
提出的制造方法可以减轻cnt-fet可制造性的限制。在微电子工业中，cnt设备的大规模扩展仍然受到低可制造性的阻碍。虽然微处理器的制造确实需要跨设备的最大一致性，但cnt-smfet生物电子传感器的生产要求不那么严格。与微处理器相反，cnt-smfet传感器对信息进行时间编码，并且只要系统电导状态之间有足够的信噪比(snr)对比度，信号幅度就可能变化。因此，cnt至cnt的可变性不一定会影响可制造性。
[0069]
本发明的传感器对吲哚具有选择性和敏感性。如上所述，与信息素受体相反，吲哚or的优势在于其对吲哚和粪臭素及其他吲哚衍生物的选择性和有时具有特异性的关系。吲哚和粪臭素以及挥发性含硫化合物是呼吸气味和口臭的主要成分，并且可用作诊断口臭和潜在病因(包括代谢疾病和口腔炎症)的临床标志物。肠癌患者比健康个体具有更高的粪便粪臭素含量，这表明粪臭素在这方面也可能是一种有价值的生物医学标记物。因此，本发明
的传感器可用于检测或感测多种吲哚的存在，所述吲哚可以是指示疾病或紊乱的生物过程的产物，或生物或化学降解过程的产物，或吲哚化合物和其它物质的污染。这些吲哚化合物可以是包含吲哚结构的任何化合物或材料，所述吲哚结构是取代的吲哚、环稠合的吲哚或任何吲哚类似物，例如吲哚(1h-吲哚)、粪臭素、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-甲醇、色氨酸、β-咔啉和各种吲哚生物碱。
[0070]
本发明还提供了一种用于检测或感测存在于样品(例如空气或液体样品)中的至少一种挥发性有机化合物(voc)诸如吲哚的存在的方法，所述方法包括接触包括共价固定任选为哺乳动物或昆虫受体的单个受体的单个碳纳米管(cnt)，所述接触在允许voc与所述受体缔合的条件下进行，其中voc与所述受体的缔合导致可测量的电场效应。
[0071]
在一些实施方案中，受体是蚊源性吲哚能气味受体(or)。
[0072]
在一些实施方案中，所述传感器用于检测至少一种吲哚的存在，所述传感器包括共价固定单个蚊源性吲哚能气味受体(or)的单个碳纳米管(cnt)，其中所述至少一种吲哚与所述受体的缔合允许可测量的电场效应。
[0073]
在一些实施方案中，or选自or2、or9、or10、or共受体(orco)或其组合。在一些实施例中，or是or8。
[0074]
在一些实施方案中，or是or9或or9共受体。
[0075]
在一些实施方案中，cnt选自单壁碳纳米管(swcnt)、双壁碳纳米管(dwcnt)和多壁碳纳米管(mwcnt)。在一些实施例中，cnt是swcnt。
[0076]
在一些实施方案中，受体是与单个swcnt分子共价缔合的单个or9受体或orco。
[0077]
在一些实施方案中，所述传感器是单分子场效应晶体管(smfet)设备，所述设备包括一个cnt和与其共价偶联的捕获探针，其中所述捕获探针包含被配置为与至少一个voc结合或缔合的至少一个受体，其中所述smfet还包括至少一个电极组件，其被设置在所述一个cnt的相对端附近，以将所述一个cnt电耦合于其上设置有所述smfet的基底，其中所述捕获探针不是dna或核苷酸。
[0078]
附图简述
[0079]
为了更好地理解本文公开的主题并举例说明它可以如何在实践中实现，现在将参考附图仅以非限制性实例的方式描述实施方案，在附图中：
[0080]
图1提供了orco-cnt fet的图示。胺封端脂质通过重氮化学与单壁碳纳米管(swcnt)侧壁上产生的缺陷共价偶联。该脂质充当含orco膜片段组装的成核点。cnt充当场效应晶体管中的通道，将生物分子电荷转换为fet中的电导变化。靶的结合和解离产生随机电报信号(rts，插图所示)，对应于离子通道的开放和闭合状态。
[0081]
图2a-图2b描绘了cnt-fet的设计和制造。图2a-金属源电极-漏电极图案的代表性图示，其中各cnt桥接每对电极。图中(右)还显示了一个已制成芯片的显微图像。图2b-cnt-fet工艺流程示例。(a)cnt是cvd生长或纺成的(spun)。(b)源极和漏极电触点(例如，钛)的光刻图案化。金属(例如钛)沉积和光刻胶去除。(d)伪参考(例如铂)栅电极的图案化，然后(e)沉积和光刻胶去除。(f)针对金属(例如金)焊盘(bond pad)的图案化。
[0082]
图3a-图3d提供了cnt fet设备的表征。图3a-sem图像显示了跨越五个电极对的cvd生长的cnt。插图：两个分离的cnt片段。图3b-左图：旋铸cnt产生单纳米管交叉。插图：交叉的放大图。右图：由源钛电极和漏钛电极覆盖的cnt片段的afm图像。图3c-从单个cnt片段
采集的拉曼光谱，展示了可重复的拉曼特征，其中ωg
+
和ωg-分别位于1588cm-1
和1566cm-1
。插图显示了相同纳米管的rbm光谱，位于170cm-1
处，对应于1.45nm的直径。图3d-背栅空气中的cnt设备的i-v曲线，显示了双极传输特性。
[0083]
图4a-图4c展示了辛二烯醛和香芹酚如何抑制vuaa1活化的orco。图4a-测试化合物的化学结构。图4b-表达埃及伊蚊orco的卵母细胞在暴露于单独2.10-4m vuaa1或与等摩尔浓度的拮抗剂辛二烯醛或香芹酚的组合的代表性电流迹线。图4c-aaegorco对单独vuaa1或与辛二烯醛或香芹酚组合的归一化响应。气味影响具有统计学意义(单因素anova，随后tukey事后检验；p《0.0001；平均响应
±
s.e.m；单独vuaa1，n＝7；辛二烯醛&香芹酚n＝6)。
[0084]
图5a-图5e显示了cnt fet的电化学调节功能化。图5a-完全生物功能化方案包括电压偏置诱导的重氮(fbdp)反应，随后通过还原胺化缀合胺封端磷脂(dppe)。图5b-图5d描绘了电化学控制的cnt-fet重氮修饰。图5b-fbdp顺序暴露之前和之后cnt设备的电行为，由每次暴露后测量的i-vlg反映。开态电流的降低是轨道再杂化导致的载流子散射的结果。在0v与铂参考电极对比时，小带隙cnt(表示为“半金属”)表现出明显的指数动力学(圆圈)，而大带隙cnt表现出非常慢的动力学，并且饱和时间更长(正方形)。在足够高的-1.5v过电位，观察到加速动力学，导致在最初几秒钟暴露后反应饱和。当前值被针对最大值归一化。图5c-引入fbdp后设备的代表性i-t迹线。观察到离散的电流下降。添加单个sp3缺陷导致的电阻变化显示跨导从h/4e2降至h/2e2。图5d-在-1.5v反应之前和之后cnt设备的拉曼光谱显示g峰减少和d峰出现。图5e-通过用胺修饰的金纳米颗粒标记来指示fbdp的特定cnt偶联。观察到极小的背景吸收。
[0085]
图6图示了or-cnt fet。胺修饰的脂质通过重氮化学与单壁碳纳米管(swcnt)侧壁上产生的缺陷共价偶联。该脂质充当含or8的支持脂质双层(or8受体用作实例)组装的成核点。cnt充当场效应晶体管中的通道，将生物分子电荷转换为fet中的电导变化。靶的结合和解离产生随机电报信号(rts，插图所示)。
[0086]
图7a-图7d图示了or集成cnt fet设备的制造。图7a-sem(左)和afm(右)图像显示分散在si/sio2基底上的均匀的cnt网络。图7b-显示12个fet设备的阵列和2个伪参考电极的初步芯片设计方案。将cnt网络图案化为50μm x 100μm的fet通道(插图所示)。图7c-通过电子束沉积对铂栅极和钛源电极和漏电极进行图案化和沉积。图7d-通过使用sem和afm、使用拉曼光谱进行电子分析以及最后测量其i-v特性，对每个cnt网络设备进行了广泛的结构表征。
[0087]
图8a-图8c，其中图8a-制造工艺后的芯片，图8b-显微镜图像，显示放大5x中的栅极金属以及源极和漏极金属。图8c-设备的sem图像，显示网络cnt，比例尺对应于100um。
[0088]
图9a-图9b展示了fbdp的合成和表征。图9a-从4-氨基苯甲醛合成fbdp。图9b-合成的fbdp的ft-ir光谱。
[0089]
图10a-图10b展示了产生含or的膜片段的方法。图10a显示了从爪蟾(xenopus)卵母细胞收获的粗膜级分。图10b示出了该过程。
[0090]
图11a-图11b显示了动态光散射分析，展示了生成纳米囊泡的可重复性。图11a展示了按强度的尺寸分布，图11b展示了按体积的尺寸分布。
[0091]
图12a-图12c展示了cnt-fet的含or的膜功能化。图12a-卵母细胞膜分离和片段化后分散在si/sio2基底的纳米囊泡的sem图像。图12b-附着于cnt网络fet设备的纳米囊泡的
afm图像，显示附着的纳米囊泡(用箭头标记)。图12c-胺修饰的荧光探针共价附接到先前通过重氮盐(fbdp)修饰的cnt设备，而当附接到原始未修饰的cnt时，类似的探针很容易通过冲洗去除。
[0092]
图13显示了与fbdp修饰的cnt fet偶联的fitc-nh2(荧光标记)的荧光响应。使用流动系统进行附接，其中将试剂施加到200(w)x 280(h)μm2的受限区域(在左图中用虚线标记。该示图未按比例绘制)。
[0093]
图14a-图14b显示了cy3标记的蛋白与cnt fet的选择性附接。图17a无tmps的cnt fet设备，图14b经tmps预处理的cnt fet设备。将样品在0.1μm蛋白溶液中于4℃孵育90min，并且然后在pbs中于60℃孵育15min。在570nm处采集荧光发射。
[0094]
图15a-图15b展示了cnt fet实验装置和电测量。图15a-通过测量空气(使用si基底作为背栅，并施加-10v至+10v栅极偏置)或液体(芯片上pt栅电极施加-0.8v至+0.8v电解栅极，和100mv源-漏偏置)中的i-v(跨导)来表征每个设备的电学特性。此处显示的是金属电导范围在60-140na的四个设备的背栅i-v图。两个设备“打开”(断开)。图15b-测量设置(setup)包括探针站和源测量单元，其实现对cnt-fet设备进行全面的电表征和其他生物感测测量。芯片上压印有微流体流动池，限定了200μm宽的流动通道。注射泵用于引入不同的溶液和试剂。
[0095]
图16描绘了生物功能化方案。胺封端磷脂(dppe)通过还原胺化作用系留到重氮修饰的cnt的侧壁，起到fet通道的作用。随后，将通过超声处理和超速离心的组合从纳米囊泡中产生的含or的膜片段与共价结合的磷脂附接。
[0096]
图17a-图17d表明蚊气味受体8是高度敏感和选择性的辛烯醇受体。图17a-来自蚊物种埃及伊蚊的or8(aaor8)和安汶巨蚊(toxorhynchites amboinensis)的or8(taor8)对(r)-1-辛烯-3-醇高度敏感(十亿分率(parts per billion)范围，ppb)。图17b-or8是一种区分(r)-对映体和(s)-对映体的对映体选择性辛烯醇受体，(r)-对映体是自然界中丰度最高的形式。图17c-在低浓度(十亿分率范围)，or8不被其他化学类别活化。图17d-在高浓度(千分率(parts per thousand))，or8表现出更宽的化学接受范围。
[0097]
实施方案详述
[0098]
大多数单分子研究方法在过去十年中才成为可及的，基于荧光的技术的发展使共焦或tirf测量荧光共振能量转移(fret)和基于力的方法诸如原子力显微镜(afm)和光镊等成为可能。单分子观察和操作技术的发展彻底改变了对许多生物过程的理解。核糖体翻译延伸和起始阶段的研究；水溶性甚至膜蛋白折叠的构象动力学；dna杂交与复制；酶催化；膜受体寡聚化gpcr相互作用只是单分子方法最近应用的几个实例。
[0099]
已建立的单分子方法仍然受到诸如以下的技术障碍的限制：与荧光标记相关的困难、对向所研究的生物化学系统侵入性地施加外力的需要、可以表征相对快速的生物化学事件的时间分辨率的限制以及可以观察所研究的生物化学反应的总时间的限制。例如，荧光探针从根本上受到光漂白的限制，对于有机染料产生的光子少至10,000个光子，时间分辨率为毫秒。
[0100]
单分子生物电子学提供了一种令人兴奋的新的实验方法，这种方法是基于将特定结合直接电子转导到电子中。直接电子转导避免使用光学设备和光源，并允许使用低形状因子设备，以及提供比光学检测器高几个数量级的信号水平。
[0101]
生物电子检测器包括用生物识别元件功能化的电子换能器。其中，单分子场效应晶体管(smfet)在生物分子相互作用和动力学的非侵入性、无标记研究中具有达到亚微秒时间尺度的前所未有的能力，克服了现有技术的局限性。此外，基于电子平台的设备很有吸引力，因为它们易于小型化，并且可以使用传统的微电子制造技术来制造。
[0102]
特别有前途的是碳纳米管(cnt)场效应设备，因为它们的特殊特性使它们成为用于暴露栅生物传感器的优秀候选者。在场效应晶体管(fet)结构中，cnt很容易形成导电通道，表现出极高的电荷载流子迁移率和极其稳定的晶格。最重要的是，这些1d材料中电荷载流子的密度对环境中的电荷是敏感的，并因此电导可以被吸附的分子调节。除了生物相容性全碳组成外，其尺寸与单个生物分子的尺寸相当，从而解决了生物学与固态界面之间的“形状因子不匹配”这一典型问题。最后，cnt-fet设备很有吸引力，因为它们是使用传统微电子制造技术制造的。如前所述，cnt-fet的转导机制基于分析物-纳米管相互作用诱导的显著电导变化，这意味着该检测方法是无标记的。cnt-fet生物传感器在核酸和各种蛋白质生物标志物检测中的可行性得到了论证。通常与纳米管传感器相关的特异性和灵敏度的缺乏是以下事实的直接结果：整个1d导体一致地对局部电荷密度敏感，使得传感器易受暴露表面上任何地方的非特异性吸附的影响。
[0103]
点功能化单壁碳纳米管(swcnt)设备是一种新兴的全电子、无标记、单分子检测平台。该smfet的特征在于电导对swcnt侧壁上产生的点缺陷的几个德拜长度内的局部电荷敏感。该功能化位点可作为研究中的swcnt系留探针分子的附接点。在数十至数百mv的源极-漏极电压偏置下，典型smfet的电流信号水平为几十纳安(na)。smfet已成功用于dna杂交和解链动力学以及dna和蛋白质构象动力学的研究。
[0104]
所提出的smfet包括如本文所公开的orco或or或or-orco的组合或任何其它源自动物、植物、昆虫、细菌或真菌的非核酸受体分子作为生物识别元件，并应用单分子生物物理方法与定制开发的生物电子测定平台，该平台采用组装到与印刷电路板(pcb)对接的生物芯片中的生物功能化cnt-fet阵列的形式。该阵列将被分割成特定的生物感测区域，能够实时询问多个配体结合。该板可以包括几十个或几百个可独立寻址的测量通道，可同时进行实时询问。每个通道的漏极和源极电位完全可调，并由至少一个增益级和高阶(至少二阶)抗混叠滤波器拓扑组成。可以结合fpga模块来对接硬件和软件。pcb还可包括多路复用器、解码器和模数转换器。smfet生物芯片将通过芯片载体封装并安装在电路板上。可以使用能够进行实时测量和数据采集的指定软件。或者，也可以设计cmos集成生物芯片，其包含所有所需的芯片上电子器件，并且因此可以在单个芯片上包含数千至数百万个smfet设备。
[0105]
设计了指定的微流体流动通道，其包括用于引入不同试剂的入口和出口。通道可由硅弹性体，例如聚二甲基硅氧烷(pdms)或任何其他生物相容性聚合物制成。
[0106]
在本发明设备的一些实施方式中，胺封端磷脂诸如1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)与作为锚定点的cnt侧壁缀合，指导膜片段的附接，如图1所示。通过使用这种新的生物电子测定，可以测量挥发物的相转移和溶解度(及其对信号的影响)、对扩散限制捕获时间的静电学影响以及电场对结合动力学的改变。此外，非特异性吸附和干扰问题也得到缓解。可以直接、实时地监测离子通道的时间开-闭状态分布。这表明将观察到在开放状态下阳离子电流对cnt电导的较强的影响。尽管通道整合在脂质双层中，但还表明其瞬时构象变化会影响电场并调节cnt电导。
[0107]
在另一种实施方式中，纳米级膜片段可以包含受体复合物的两种成分，即orco-or，如图6所示。这种配置将cnt-fet设备的灵敏度和固有信号放大与蚊or的独特选择性进行组合。
[0108]
cnt-fet阵列的设计、制造与表征。包含cnt-fet设备阵列的芯片通过使用常规采用的cvd生长技术或通过使用滴铸或旋涂技术与光或电子束光刻在硅/氧化硅基底上制造。或者，设备可以在诸如以下的任何其他绝缘基底上制造：金属氧化物、聚合物等，所述基底可以具有任何厚度(只要它比沉积的金属电极(即90纳米)厚)和硬度。因此，基底可以是具有各种程度的弹性或塑性的柔性材料。使用旋铸法随机放置稀释的水性单壁cnt悬浮液。优化了纳米管密度、旋铸参数、纳米管长度以及电极宽度和间隙，以最大化单个cnt交叉的频率。电极图案(间隙和几何形状)被设计成与纳米管长度分布相称(如图2a所示)。优化导致每个电极对之间有单个纳米管交叉。随后，源电极、漏电极和栅电极的图案化和金属沉积会导致每个芯片有多个单cnt-fet设备。下一步，使用光学和电学测量对设备进行表征(参见图3)。芯片由sem和afm扫描。还采集了各个cnt的拉曼光谱。最后，通过使用硅背栅在空气中进行i-v探测来测量电子特性。
[0109]
含有多个cnt-fet设备的芯片表现出较高的电导(数十至数百na)，如图3a所示。显示出旋铸法可重复产生高产率的功能性cnt-fet的可行性。图3a和图3b显示了与旋铸芯片相比的cvd生长芯片的实例。
[0110]
还显示了afm图像，这有助于确认cnt直径。cnt共振拉曼光谱分析可测量d带(“无序模式”)与切向g带的比值，该比值可作为固有cnt缺陷数量的指标。此外，通过对g模分量(g mode components)的分析，阐明了电子结构。还采集径向呼吸模式(rbm)，指示cnt直径。在设备结构中仅使用了在d带不表现散射的cnt(明显的“原始”纳米管)。图3c显示了生长在si/sio2上的cnt的典型拉曼光谱。
[0111]
初步研究基于cnt网络fet设备(cntn-fet)。这样的设计能够以非常高的产量生产芯片。我们已优化了用于在si/sio2芯片上生成可重复且均匀分散的cnt层的参数。简言之，纯的、制备好的cnt悬浮液(包含具有窄尺寸分布的预分选swcnt)用于通过短暂的声处理然后通过旋铸法，同时调节浓度、溶剂类型、孵育期、声处理功率和时间，来涂覆si/sio2基底。通过sem、afm和拉曼对层进行了表征，如图7a所示。钛源电极和漏电极以及铂伪参考栅电极被光刻图案化，并沉积在cnt层上方。图7b显示了初步设计的图示。对于每个fet设备，定义了一个cnt导电通道(如图7c所示)，并对剩余的cnt层进行等离子刻蚀。所得设备在整个芯片上表现出均匀的cnt密度(如图7d的sem图像所示)。如前所述，对设备进行了进一步的结构和电表征。
[0112]
图8a-图b呈现了包含90nm厚的钛源电极和漏电极以及铂栅电极的制成的芯片的另外的图像。图8c呈现了另外的sem图像。
[0113]
orco的表达、电生理及纯化。富含orco的膜的供应将取决于使用表达该受体的爪蟾卵母细胞的双电极电压钳进行的功能验证。蚊气味受体复合物(orx-orco)在爪蟾卵母细胞中的表达和药理活性记录已被广泛研究。这种研究orco激动剂(例如vuaa1)和拮抗剂(例如辛二烯醛和香芹酚)(如图4a所示)或与orx相关的激动剂活性的技术已经实现。在某些情况下，使用了orco而不是orx，以减少与or复合物相关的潜在缺陷。在某些情况下，如果没有其共受体伴侣，单独的orx无法发挥作用。使用了两种适于爪蟾卵母细胞表达的表达载体。
使用psp64dv记录暴露于vuaa1的orco达到1μa以上的电流，这指示蛋白水平高(图4b)。考虑到提取长度小于《50nm的富含orco的膜片段的目的，受体密度应足以确保这些短片段包含orco。为了评估orco密度，使用pcmv6-ac-mkate表达载体(origene)或其他加标签版本表达该基因。该质粒在爪蟾卵母细胞中良好地发挥功能，并在感兴趣的蛋白(此处为orco)的c末端添加了组成型荧光mkate2标签，其可通过共焦扫描激光显微镜直接或间接(荧光免疫组织化学)检测。如果对c-末端加标签损害了orco功能，则需要n-末端加mkate2标签的载体(pcmv6-an-mkate，origene)来代替。
[0114]
orco是使用mmessage mmachine
tm t7 ultra转录试剂盒(life technologies)从线性化的psp64dv表达载体合成的。将加帽的orco rna注射到v-vi期卵母细胞中，孵育3-5天，并根据别处公布的方案暴露于激动剂vuaa1。
[0115]
在典型记录会话期间，将单个卵母细胞暴露于10-4
m的单浓度vuaa1，以(i)限制orco暴露于该激动剂，以及(ii)鉴定具有最高orco表达水平的卵母细胞。收集合格的卵母细胞，以分离并评估膜受体复合物的密度。
[0116]
通过裂解、均质化和随后在蔗糖梯度中的差速超速离心进行小卵母细胞膜片的分离。最初开发类似方案作为对爪蟾卵母细胞膜进行共焦显微镜和高分辨率afm分析的样品制备方法。结果显示，产生了横向尺寸《500nm、厚度为3-5nm的增溶平面卵母细胞膜片，并长时间保留。
[0117]
化学修饰和生物功能化。不同版本的cnt-fet传感器试图检测吸附在原始和被涂覆的cnt上的生物分子。使用芘或卟啉，利用这些分子与cnt碳晶格的π-π堆积，实现了短暂的非共价附接。通常与纳米管传感器相关的特异性和灵敏度的缺乏是以下事实的直接结果：整个1d导体对局部电荷密度一致敏感，使得传感器容易受到暴露表面上任何地方的非特异性吸附的影响。在cnt表面引入缺陷会使这种灵敏度局部化，使cnt仅对所研究的分子附近区域的电荷密度敏感。这种缺陷继而可用于在换能器的电荷灵敏度点共价连接生物分子。所得设备可用于测量纳米管电导的时间分辨变化，所述时间分辨变化由生物分子和缺陷之间的库仑相互作用引起的1d通道中的散射变化产生。共价连接策略也为生物分子提供了理想的永久系留。在所有方法中，cnt与重氮盐的反应被广泛研究，成为cnt共价功能化最常用的途径之一。共价修饰通过将碳键从sp2定向转换为sp3定向，在设备中产生可测量的电阻变化。通过施加溶液偏压促进或抑制带电重氮盐和cnt晶格之间的电子转移(据认为，由于添加一个sp3缺陷导致的相关电阻变化约为：h/4e2)，电化学控制反应是可行的。含有正交醛官能团的4-甲酰基苯重氮六氟磷酸盐(fbdp)的偶联(后来用于生物缀合)是电化学调节的。连接体分子(例如，dppe)的后续系留通过还原性胺化进行，如图5a所示。这种共价附接的脂质充当指导含orco的膜片段的附接的锚。这种功能化策略的主要优点是：i)将被询问的生物分子定位在与电荷敏感区紧密接触的位置；ii)将生物分子定位在cnt侧壁周围的德拜球内(具有德拜筛选长度的必要邻近尺度)，从而实现静电调节orco结合和构象变化；iii)确保含orco的膜片段与cnt侧壁的最佳定向，垂直于通道中的阳离子流；iv)实现非瞬时、稳定的orco-cnt混合体以进行长时间测量。对slb(悬浮的脂质双层)-cnt混合体的研究已显示出对靶结合进行电检测的前景。额外电荷导致的晶体管阈值(δve)漂移与其电荷密度有关，具体表现为：σ＝2δveεwε0/λd，其中εw为水的介电常数，并且λd为德拜长度。
[0118]
获得的膜片段与共价结合的磷脂的定向附接很大程度上取决于膜的平面构型。因
此，了解允许双层膜片段在溶液中保持平面构型的条件至关重要。以slb为模型，对脂质双层囊泡的动力学进行了广泛的研究。双层膜的泡化或平坦化取决于每种状态的自由能，而自由能又取决于闭合熵以及膜的弯曲和轮廓(边缘张力)自由能。单位面积的弯曲能量由下式给出：其中κ是弯曲刚度，并且是弯曲模量，表示膜的展性。主曲率c1+c2是描述膜局部形状的曲率张量的本征值。边缘张力的结构原点(γ，单位长度的轮廓能量)来自于占据边缘的脂质的变形。有人提出，平面或球形脂质双层的稳定性可以用下式来描述：其中γ是边缘张力，描述弯曲自由能并且a是膜的面积。使用κb～5-25kbt(kb是玻尔兹曼常数)和γ＝1-2kbt/l(l是长度)的经验值，可以得出平面脂质双层《50nm是足够稳定的。此外，将膜片段与cnt在高于其转变的温度一起孵育可进一步促进其正确定向。因此，含有orco的小平面膜片段将被系留到cnt侧壁上，显示由与cnt结合的脂质尾部的旋转自由度定义(和限制)的角位置。应注意的是，尽管囊泡构型不太可能与cnt-磷脂缀合(因为它依赖于囊泡破裂)，但另一方面，缀合后平面双层的闭合不一定会影响信号转导和设备性能。
[0119]
此外，只要配体诱导的离子电流在德拜球内流动，导致orco离子通道平行于cnt侧壁定位的其他定向(即，由于脂质尾部吸附到cnt晶格上)仍应能够有效地调节设备电导。
[0120]
如前所述，由于1d通道对缺陷附近电荷的敏感性，单个系留orco通道会影响任何给定设备中的可测量电导变化。事实上，已使用类似的设备和系留的核酸证明了cnt-fet解析单个核苷酸的分子电荷(～0.1e)的能力。
[0121]
在一些实施方案中，化学修饰和生物功能化步骤将通过微流体通道(在聚二甲基硅氧烷(pdms)弹性体冲压中图案化)进行。
[0122]
初步结果。之前，我们已经证明了我们能够通过电化学方法控制cnt-fet重氮(fbdp)功能化至解析单个sp3缺陷的程度。通过转移swcnt的费米能(通过施加偏压)实现了对swcnt的fbdp功能化的电化学控制，从而增加了表面附近的电子密度。如图5b所示，在连续暴露于fbdp之后，通过重复i-v
lg
(液体门)测量展示了侧壁改变的程度。此外，可以通过测量fbdp暴露时的电导(i-t迹线)来实时监测反应。在这种情况下，如图5c所示，源自重氮反应的电流下降清晰可见。这些下降被量化，并代表单个sp3缺陷的产生，例如，从图5d和图5e所示的改变的拉曼特征和afm成像中可以明显看出。sp2至sp3的再杂化消除了1d通道中的电流路径，导致观察到的电导下降。
[0123]
如图9a中描绘的，在-10℃的酸性溶液中，由4-氨基苯甲醛合成了重氮化合物甲酰基苯重氮六氟磷酸盐(fbdp)。通过过滤纯化产物，并通过ft-ir表征(图9b)。该光谱以醛基团、对位取代苯基团以及重要的2300cm-1
处形成的重氮基团的ir拉伸带为特征。
[0124]
此外，在一项初步研究中，通过超声处理、超速离心和去污剂处理的组合获得了含or的膜片段，并将其附接到化学修饰的cnt侧壁。简言之，从爪蟾卵母细胞中收获粗膜级分(图10a)。通常，可在rna注射后2-5天收获卵母细胞。将10-15个卵母细胞的批次在1ml hedp缓冲液(100mm hepes，1mm edta，ph 7.6，有naoh)加5ul蛋白酶抑制剂混合物中在4℃进行匀浆。匀浆以5600rpm离心10min。将从步骤获得的上清液用移液管移入两个7ml的冰冷的15％hedo缓冲液中的蔗糖中，以175,000g离心1.5小时。该过程如图10b所示。
[0125]
如图11a-图11b所示，通过如动态光散射分析指示的，证明了本发明人可重复地生成纳米囊泡(其大小约为30nm)的能力。
[0126]
这些生成的纳米囊泡(也通过使用电子显微镜扫描，如图12a所示)随后被附接到cnt设备(如图12b中的afm图像所示)。我们通过将荧光探针与fbdp修饰的cnt设备缀合，进一步证明了我们的共价键合策略的稳健性，如图12c所示。
[0127]
受体与流动系统的附接。我们继续建立用于受体与流动系统附接的条件。通过这种设置，通过使试剂流过200(w)x280(h)μm2通道(该通道限制了整个cnt区域和ti电极的部分区域)来进行cnt与fbdp的顺序修饰以及通过还原胺化的受体偶联(参见图13中的描绘)。如图13所示，除了fitc-nh2(荧光标记)与cnt共价附接之外，与裸露的sio2的直接吸附也很突出。
[0128]
我们之前已经表明，在提高的温度长时间孵育能够从裸露的sio2表面有效清除fitc-nh2。然而，为了在不必然需要严格洗涤和样品加热的情况下实现选择性附接，我们首先用丙基三甲氧基硅烷(tmps)活化sio2表面。我们预计，除了形成物理屏障外，丙基残基形成的疏水表面将排斥进入的极性和/或带电分子，诸如or。图14展示了我们将用cy3荧光团标记的模型蛋白附接于cnt fet设备的方法的实施。图14a显示了在蛋白质溶液中孵育而没有tmps活化的设备，并且图14b显示了在与蛋白质孵育之前用tmps处理的类似设备。虽然显著量的蛋白质被吸附到裸露的sio2表面(未用tmps处理)，但经过tmps处理的设备显示出对cnt的选择性吸附。
[0129]
实验设置、pcb设计及测量平台。通过使用可商购的电子测量设置(探针站)探测单个设备，可以证明所提出的生物电子构造的可行性。然而，生物芯片被设计成与定制设计的pcb对接，实现高效便捷的测量。pcb可以包括几十个或几百个可独立寻址的测量通道，这些通道同时被实时询问。每个通道的漏极和源极电位完全可调，并由至少一个增益级和高阶(至少二阶)抗混叠滤波器拓扑组成。可以结合fpga模块来对接硬件和软件。pcb还包括多路复用器、解码器和模数转换器。生物芯片将通过芯片载体封装并安装在电路板上。
[0130]
也可以使用能够进行实时测量和数据采集的指定软件。或者，也可使用cmos集成生物芯片，其包含所有所需的芯片上电子器件，并且因此可在单个芯片上包含数千至数百万个smfet设备。
[0131]
也可以存在指定的微流体流动通道，其包括用于引入不同试剂的入口和出口。通道可由硅弹性体，诸如聚二甲基硅氧烷(pdms)或任何其他生物相容性聚合物制成。
[0132]
测量基质：通过向流动池中填充电解缓冲液或导电水凝胶或导电聚合物，可以形成测量基质，从而为含orco的膜提供最佳条件，确保更高的活性和灵敏度。在初步数据收集期间可使用增溶的配体。添加少量有机溶剂(例如，dmso)将实现相当疏水的有机小化合物的溶解。与水相比，voc在空气中的扩散系数大几个数量级。voc在空气-水界面上的传质取决于其溶解速率常数(kd)、空气-水界面表面积(a
aw
)、voc的最大溶解度(c
wmax
)和水体积(vw)，因此其中sw＝c
wmax
＝c
amax
/hc，其中c
amax
是空气相中voc的最大浓度，并且hc是henry溶解度常数。因此，可以根据ln(s
w-cw/sw)与t图的斜率估计voc溶解速率常数kd。
[0133]
将安装指定的空气取样装置。将安装简单的空气吸入系统，其包括微型风扇和过
滤器(用于尘埃和空气中的小颗粒)。采样空气将通过导管导入微流体通道，以引入voc分析物。
[0134]
在初步研究中，测量是通过使用电子测量装置单独询问每台设备进行的。这些测量包括i-v和噪声特性以及时间轨迹。生物芯片上印有一个直接放置在设备上方的pdms微流体流动池，其包括用于引入不同试剂的入口和出口。实验装置的图片如图15b所示。
[0135]
化学修饰和生物功能化策略的示意图在图16中呈现：嵌入在纳米级膜片段(“纳米体(nanosome)”)中的天然or共价附接(通过重氮缺陷)至用作锚定点的胺封端磷脂(dppe)。
[0136]
致病霉菌影响全世界数百万人的生活和粮食安全。由于风险如此之高，降低这些病原体的影响至关重要。1-辛烯-3-醇或蘑菇醇是由霉菌释放的微生物挥发性有机化合物(mvoc)，是环境危害、神经退行性疾病、食品污染和水果病害的早期预警信号。它也是在加工制造中有重要用途的食品添加剂或调味剂。1-辛烯-3-醇的(r)对映异构体是真菌(诸如青霉属的种(penicillium spp)和曲霉属的种(aspergillus spp)霉菌)释放的最常见和最丰富的voc之一。
[0137]
在对蚊or的研究中，本发明人的研究表明，被称为or8的蚊气味受体被十亿分率的范围内的(r)-1-辛烯-3-醇活化(图17a)。实际上，对(r)-1-辛烯-3-醇化学结构的双键饱和度、侧链长度、手性中心位置或功能取代的任何修饰都足以防止or8被活化(图17b)。在该浓度范围，or8表现出窄的分子接受范围(图17c)。然而，在较高的气味浓度，or8表现出较宽的气味调节谱(图17d)，被较宽范围的化学结构活化。
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这些研究确立了or8作为敏感的对映选择性气味受体，其窄气味调谐在纳摩尔范围内最佳，其在受体药理学领域表现出色。该受体是报告的最具选择性的气味受体之一，当暴露于(r)-1-辛烯-3-醇的化学结构的任何轻微修饰时，其活化骤降。or8是受体选择性的典型，能够对(r)-1-辛烯-3-醇骨架的任何轻微修饰表示拒绝，表现为完全活化关闭(图17b)。在低浓度，受体对(r)-1-辛烯-3-醇具有特异性(图17c)，对于使用该受体检测微生物污染的早期迹象或存在的目的而言，这是理想的特性。然而，在气味浓度较高时，or8的选择性减低，表现出较宽的分子接受范围(图17d)。