脂联素的定量方法以及用于该定量方法的分析用试剂

1.本发明涉及对作为参与血液中的代谢的物质的脂联素进行定量的方法、以及用于该定量方法的分析用试剂。


背景技术：

2.据认为，脂联素是在脂肪细胞中表达的分泌蛋白，参与葡萄糖的调节以及脂肪酸的分解。一般而言，可观察到血中脂联素浓度与体内的脂肪量逆相关，因此脂联素作为有益脂肪细胞因子而为人所知，作为具有抑制近年来被视为问题的代谢异常症状群(所谓的代谢综合征)、与它们相关的动脉硬化等的功能的物质而受到关注。
3.作为脂联素，已知有单体、多个单体聚合而成的三聚体、六聚体以及它们进一步聚合而成的多聚体。上述的脂联素的总量可以通过使用抗脂联素抗体来进行定量，迄今为止作为定量技术使用。另一方面，据认为，主要由多个单体聚合而成的脂联素具有生理性功能。在专利文献1中，公开了对被认为参与上述代谢的多聚体的高分子脂联素进行定量的技术。在该技术中，在对有助于脂联素的分子间键合的s-s键部位或其附近进行识别、且在夹心免疫测定系统中作为第一抗体以及第二抗体使用的情况下，使用将特异性地识别高分子脂联素的抗体用作第一抗体以及第二抗体的夹心免疫测定系统，试图选择性地对高分子脂联素进行测定。现有技术文献专利文献
4.专利文献1：国际公开第2009/078151号


技术实现要素：

发明所要解决的问题
5.但是，据认为，脂联素有助于上述脂肪、糖的代谢，另一方面，若血中脂联素浓度较高，则与这些代谢相关的疾病的风险有时反而变高。例如，若血中脂联素浓度较高，则心血管病的风险反而变高。因此，仅通过总脂联素量、单体、多聚体等的各结构的脂联素的定量，无法正确掌握脂联素的生理活性以及对上述疾病的影响。
6.在此，例如在作为有益胆固醇而已知的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，hdl蛋白质)的情况下，在冠状动脉疾病患者中，反而对向动脉硬化性起作用的、具有病理活性的dysfunctional hdl(失功能高密度脂蛋白)增加。本发明的发明人考察了脂联素也与hdl的情况同样地，在血中脂联素的总量中包含具有生理活性的脂联素和具有病理活性的脂联素，若具有病理活性的脂联素的浓度较高，则不能发挥生理活性。本发明的发明人在考虑到上述情况的基础上，考察了需要正确地对脂联素的生理活性进行测定而进行了深入研究。
7.本发明是鉴于上述那样的情况而完成的，其目的在于提供一种能够正确地掌握脂联素的生理活性、对心血管病风险、生活习惯病风险等的评价有用的脂联素的定量方法、以及用于该定量方法的分析用试剂。用于解决问题的手段
8.为了解决上述问题，本发明具有以下的方式。[1]一种脂联素的定量方法，其中，在体液中的脂联素的定量中，对具有生理活性的脂联素和具有病理活性的脂联素进行识别并进行定量。[2]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，在所述具有生理活性的脂联素的定量中使用t-钙粘蛋白类。[3]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，所述t-钙粘蛋白类为重组t-钙粘蛋白。[4]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，所述具有生理活性的脂联素的定量通过脂联素、t-钙粘蛋白类以及抗脂联素抗体的复合体的免疫分析来进行定量。[5]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，所述具有病理活性的脂联素的定量使用脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体来进行定量。[6]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，在所述具有病理活性的脂联素的定量中使用lox-1蛋白。[7]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，所述lox-1蛋白为重组lox-1蛋白。[8]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，在所述具有病理活性的脂联素的定量中，利用所述重组lox-1蛋白，通过免疫分析对受体结合活性进行定量。[9]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，在所述具有病理活性的脂联素的定量中，利用所述重组lox-1蛋白，通过抗脂联素抗体、脂联素以及改性低密度脂蛋白的复合体的免疫分析对受体结合活性进行定量。[10]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，在所述具有生理活性的脂联素的定量中使用t-钙粘蛋白类，在所述具有病理活性的脂联素的定量中使用重组lox-1蛋白，通过免疫分析对受体结合活性进行定量。[11]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，在所述具有生理活性的脂联素的定量中使用t-钙粘蛋白类，在所述具有病理活性的脂联素的定量中使用脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体以及重组lox-1蛋白，通过抗脂联素的免疫分析对受体结合活性进行定量。[12]所述的脂联素的定量方法，其中，在所述体液中的脂联素的定量中，所述体液为血液或唾液。[13]一种分析用试剂，其是用于体液中的脂联素的定量的分析用试剂，所述体液中的脂联素的定量是为了对心血管系统疾病、糖尿病或糖尿病性疾病、或其进展度进行判定，其中，所述分析用试剂包含用于对具有生理活性的脂联素进行定量的重组t-钙粘蛋白。[14]一种分析用试剂，其是用于体液中的脂联素的定量的分析用试剂，所述体液
中的脂联素的定量是为了对心血管系统疾病、糖尿病或糖尿病性疾病、或其进展度进行判定，其中，所述分析用试剂包含用于对具有病理活性的脂联素进行定量的重组lox-1蛋白，对于脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体，通过抗脂联素的免疫分析，对受体结合活性进行定量。发明效果
[0009]
根据本发明，能够正确地掌握脂联素的生理活性，可得到对心血管病风险、生活习惯病风险等的评价有用的脂联素的定量方法、以及用于该定量方法的分析用试剂。
附图说明
[0010]
图1是表示在本技术实施例中使用的脂联素的定量方法的概要的示意图。图2是表示具有生理活性的脂联素与t-钙粘蛋白的结合试验的结果的曲线图。图3是表示人血清试样的具有生理活性的脂联素的浓度的定量试验的结果的曲线图。图4是表示人血清试样和包含edta的血浆试样的具有生理活性的脂联素的浓度的定量试验的比较结果的曲线图。图5是表示具有病理活性的脂联素与改性ldl的结合试验的结果的曲线图。图6是表示人血清试样的具有病理活性的脂联素的浓度的定量试验的结果的曲线图。图7是表示人血清试样的lox-1结合改性ldl的浓度的定量试验的结果的曲线图。图8是表示本技术参考试验的改性ldl与脂联素的结合试验的图。图9是表示通过抗脂联素抗体对ampk及其磷酸化(pampk)进行检测的试验的图。
具体实施方式
[0011]
以下，示出实施方式对本发明所涉及的脂联素的定量方法以及分析用试剂进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
[0012]
(脂联素的定量方法)在本实施方式的脂联素的定量方法中，在体液中的脂联素的定量中，对具有生理活性的脂联素和具有病理活性的脂联素进行识别并进行定量。
[0013]
在此，具有生理活性(physiological activity)的脂联素是指例如与脂联素受体结合并能够发挥经由脂联素受体的生理作用的脂联素。作为脂联素受体，例如有adipor1、adipor2以及t-钙粘蛋白等。此外，具有生理活性的脂联素有时也称为functional(功能性)脂联素。
[0014]
具有病理活性(pathological activity)的脂联素是指难以发挥脂联素所具有的本来的生理活性的脂联素，包含失去生理活性的脂联素、或生理活性大幅降低的脂联素、获得了非生理活性(dysfunctional activity)的脂联素等。这样的脂联素例如是经由脂联素受体的反应降低的脂联素。作为具有生理活性的脂联素变得不具有生理活性的机理，例如有构成蛋白质的化学修饰、部分或完全分解、遗传缺损及变异、高次结构的异常、变化、或与使其失去活性的分子的结合等主要原因。
具有病理活性的脂联素与引起对生物体不利的反应的受体、例如lox-1(lectin-likeоxidized ldl receptor-1，凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体)等相互作用，例如获得了包括经由其他蛋白质的与lox-1的结合能力。在本实施方式中，以上述的结合能力等的获得为例，将变得难以发挥生理活性的脂联素称为具有病理活性的脂联素，但具有病理活性的脂联素的活性并不限于上述。此外，具有病理活性的脂联素有时也称为dysfunctional(失功能)脂联素。
[0015]
对具有生理活性的脂联素和具有病理活性的脂联素进行识别并进行定量是指，例如，包含使用仅能够对具有生理活性的脂联素进行定量的手段、或者仅能够对具有病理活性的脂联素进行定量的手段，或者并用上述手段进行各自的定量。另外，还包含识别、分离具有生理活性的脂联素和具有病理活性的脂联素并分别进行定量这样的手段。在本实施方式中，能够对具有生理活性的脂联素和具有病理活性的脂联素中的任一单方进行定量。另一方面，还优选对具有生理活性的脂联素和具有病理活性的脂联素这两者进行定量。通过一并分析它们的各自的结果并用于评价，能够更准确地判断疾病的风险等。
[0016]
在上述定量中可以使用用于蛋白质的定量(蛋白质量的测定)的公知的手段。例如，上述定量可以使用免疫学方法。作为使用了免疫学方法的定量、免疫分析，可以适当使用酶(酶免疫分析、eia、elisa)、荧光物质(荧光免疫分析、fia)或放射性物质(放射免疫分析、ria)等。其中，elisa比较廉价、简便且能够分析大量的样本，因此优选。
[0017]
例如，在本实施方式中，在上述定量中，可以使用elisa法。具体而言，将能够与定量的对象结合的化合物固相化于elisa板。向该elisa板添加试样，使试样中所含的定量的对象与受体结合，对板进行清洗而去除未结合物，若使用针对定量的对象的抗体进行检测，则能够对定量的对象和能够与上述对象结合的化合物的结合体进行定量。在本实施方式中，作为能够与定量的对象结合的化合物，特别使用生理作用下的受体。在本实施方式中，分别使用仅能够与具有生理活性的脂联素结合的受体和仅能够与具有病理活性的脂联素结合的受体。另外，以下有时将各脂联素与受体结合的活性称为受体结合活性。换言之，本实施方式的各脂联素的定量是相对于各个受体的受体结合活性的定量。受体的固相化(固定化)可以适当使用已知的方法。例如，可以使受体与公知的载体(支承体)结合。
[0018]
在本实施方式中，进行体液中所含的脂联素的定量。在此，体液例如可以使用血液或唾液。作为血液的样本，可以使用血清或血浆等。在本实施方式中，将这些体液作为试样，供于上述定量。
[0019]
上述体液的试样优选不包含edta。血浆等试样有时为了保存而添加有作为钙离子抑制剂的edta。但是，报告了t-钙粘蛋白与脂联素的结合是钙依赖性的。因此，当在试样中不包含作为钙离子抑制剂的edta的情况下，能够适当地利用上述定量方法。
[0020]
(具有生理活性的脂联素的定量)在体液中的脂联素的定量中，具有生理活性的脂联素的定量优选使用t-钙粘蛋白类。本实施方式的t-钙粘蛋白类包含关于t-钙粘蛋白而已知的家族、修饰蛋白等。
t-钙粘蛋白是具有生理活性的脂联素的受体之一。通过对与t-钙粘蛋白发生了相互作用(例如结合)的脂联素进行定量，能够将具有生理活性的脂联素相对于具有病理活性的脂联素进行识别并进行定量。
[0021]
在体液中的脂联素的定量中，t-钙粘蛋白类例如也优选为重组t-钙粘蛋白。在此，重组t-钙粘蛋白是指通过基因重组表达而得到的t-钙粘蛋白。重组t-钙粘蛋白可以根据需要导入与其他结构的融合、突变。
[0022]
在体液中的脂联素的定量中，具有生理活性的脂联素的定量也优选通过脂联素、t-钙粘蛋白类以及抗脂联素抗体的复合体的免疫分析来进行定量。
[0023]
具体而言，可以使脂联素与t-钙粘蛋白类的结合体与抗脂联素抗体结合，并通过免疫分析对该复合体进行定量。例如，使t-钙粘蛋白类固相化于elisa板。通过向该elisa板注入来自体液的试剂，使具有生理活性的脂联素与elisa板上的t-钙粘蛋白类结合。可以通过抗脂联素抗体对该elisa板上的结合体进行定量。此外，在本实施方式中，抗脂联素抗体可以使用单克隆抗体以及多克隆抗体中的任一种。
[0024]
(具有病理活性的脂联素的定量)在体液中的脂联素的定量中，具有病理活性的脂联素的定量优选使用脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体来进行定量。改性低密度脂蛋白(以下，也称为改性ldl)是由于某些原因而改性的ldl(low density lipoprotein)蛋白。在此，ldl也已知为通称的有害胆固醇，已知其负责从肝脏向末梢的胆固醇输送。作为改性ldl，例如有氧化ldl(oxldl)等。
[0025]
根据本发明的发明人，存在如下验证结果：在改性低密度脂蛋白的组分中，脂联素浓缩，另外，作为改性ldl的氧化ldl阻碍了脂联素的作用。在本发明的发明人的研究中，如后述的图8所示，在人的血液中，在相当于改性ldl的组分中，脂联素被浓缩，在生物体内产生脂联素与改性ldl的相互作用。如后述的图9所示，改性ldl具有阻碍脂联素的ampk(amp激酶)的磷酸化的作用。据认为，若存在改性ldl，则脂联素与改性ldl结合，丧失经由adipor1的本来的作用。因此，预想到，通过改性ldl与脂联素的相互作用，脂联素形成为具有病理活性的状态。本发明的发明人根据这些结果发现，改性低密度脂蛋白与脂联素相互作用而使其失去生理活性，能够在具有病理活性的脂联素的定量中使用改性低密度脂蛋白。
[0026]
在具有病理活性的脂联素的定量中，可以使用如下手段：为了使用脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体进行定量，例如使用与改性低密度脂蛋白特异性结合的蛋白质、以及抗脂联素抗体，对脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体进行检测并进行定量。通过对与改性低密度脂蛋白发生了相互作用(例如结合)的脂联素进行定量，能够对具有病理活性的脂联素相对于具有生理活性的脂联素进行识别并进行定量。
[0027]
在体液中的脂联素的定量中，在具有病理活性的脂联素的定量中优选使用与改性低密度脂蛋白相互作用的蛋白质。作为与改性低密度脂蛋白相互作用的蛋白质，例如也优选为lox-1蛋白。lox-1是本发明的发明人发现的分子(sawamura t et al.nature 386,73-77,1997)，作为凝集素样氧化ldl受体的一种而已知。已知：lox-1的详细的结构也是明确的，是细胞膜一次贯通型的膜蛋白质，具备凝集素样的结构域，该凝集素样结构域为氧化
ldl的识别部位(日本特开平9-98787号等)；血液中也存在可溶性的成分；修饰后的高密度脂蛋白(hdl)作为lox-1的配体而发挥作用等(日本特开2012-100585号、日本特许6231307号等)。
[0028]
在体液中的脂联素的定量中，上述lox-1蛋白例如也优选为重组lox-1蛋白。在此，重组lox-1蛋白是通过基因重组表达而得到的lox-1蛋白。重组lox-1蛋白也可以根据需要导入与其他结构的融合、突变。
[0029]
在体液中的脂联素的定量中，具有病理活性的脂联素的定量也优选利用重组lox-1蛋白，通过免疫分析对受体结合活性进行定量。该定量也优选通过抗脂联素抗体、脂联素以及改性低密度脂蛋白的复合体的免疫分析对受体结合活性进行定量。具体而言，可以使脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体与抗脂联素抗体结合，并通过免疫分析对该复合体进行定量。
[0030]
在上述免疫分析中，可以使用对重组lox-1蛋白、改性低密度脂蛋白以及脂联素的复合体进行定量的手段。该定量可以使用所谓的夹心elisa来进行。作为该定量法，例如，使作为低密度脂蛋白的受体的lox-1固相化于elisa板，使改性低密度脂蛋白与该elisa板上的lox-1结合。通过向该elisa板注入来自体液的试剂，使具有病理活性的脂联素与该lox-1和改性低密度脂蛋白的复合体结合。接着，可以通过抗脂联素抗体对elisa板上的结合体进行定量。
[0031]
在体液中的脂联素的定量中，可以组合使用上述的具有生理活性的脂联素的定量和具有病理活性的脂联素的定量。例如，也可以在具有生理活性的脂联素的定量中使用t-钙粘蛋白类，在具有病理活性的脂联素的定量中使用脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体以及重组lox-1蛋白，并通过抗脂联素的免疫分析对受体结合活性进行定量。
[0032]
(用于脂联素定量的分析用试剂)接着，对用于上述体液中的脂联素定量方法的分析用试剂进行说明。该分析用试剂通过用于体液中的脂联素的定量，能够用于为了对心血管系统疾病、糖尿病或糖尿病性疾病、或其进展度进行判定的体液中的脂联素的定量。分析用试剂包含上述的重组t-钙粘蛋白。通过包含重组t-钙粘蛋白，能够进行具有生理活性的脂联素的定量。
[0033]
另外，分析用试剂也可以包含用于对具有病理活性的脂联素进行定量的重组lox-1蛋白。如上所述，该分析用试剂由于重组lox-1蛋白与改性低密度脂蛋白相互作用，因此通过对脂联素与改性低密度脂蛋白的结合体通过抗脂联素的免疫分析对受体结合活性进行定量，能够进行具有病理活性的脂联素的定量。
[0034]
(其他构成)本实施方式的分析用试剂也可以含有其他免疫分析的试剂中所含的成分。
[0035]
另外，本实施方式的分析用试剂也可以作为具备多个上述构成的试剂盒而提供。例如，该试剂盒也可以具备包含用于对具有生理活性的脂联素进行定量的重组t-钙粘蛋白的分析用试剂和包含用于对具有病理活性的脂联素进行定量的重组lox-1蛋白的分析用试剂。该试剂盒也可以具备用于对具有病理活性的脂联素进行定量的重组低密度脂蛋白。另
外，该试剂盒也可以包含用于上述的定量操作的载体、elisa板、显色底物或抗体等。另外，也可以包含固定化有上述的蛋白质的elisa板。
[0036]
(本实施方式的效果)根据本实施方式的脂联素的定量方法以及分析用试剂，能够正确地掌握脂联素的生理活性，能够用于心血管病风险、生活习惯病风险等的评价。
[0037]
本实施方式的定量方法以及分析用试剂通过区别地测定出具有生理活性的脂联素、具有病理活性的脂联素，对于心血管病风险层级化有用的可能性较高。另外，上述的定量方法以及分析用试剂能够应用于动脉硬化性疾病、尤其是冠状动脉疾病、糖尿病以及糖尿病性疾病的可能性较高。这些疾病包括许多所谓的生活习惯病。因此，生活习惯病风险提高的40岁以上全部成为疾病的风险判断、预防、诊断的对象，社会的应用范围非常广。
[0038]
本实施方式的定量方法能够应用于对心血管病风险进行预测的体外诊断。本实施方式的定量方法的主要目的在于心血管病风险评价，因此能够用于已经引起心血管有害现象的患者的二次风险评价、以及健康者的一次风险评价。另外，本实施方式的分析用试剂以及包含该分析用试剂的试剂盒等能够应用于上述的体外诊断药。
[0039]
(本实施方式的用途)本实施方式的脂联素的定量方法以及分析用试剂例如可以用于如下方法：在体液中的脂联素的定量中，通过对具有生理活性的脂联素进行测定，来诊断心血管系统疾病的罹患，和/或，糖尿病或糖尿病性疾病的罹患。
[0040]
另外，作为上述心血管系统疾病，例如能够适宜地用于针对动脉硬化性疾病、冠状动脉疾病等的诊断方法。
[0041]
作为诊断方法，例如，在上述体液中的脂联素的定量中，通过对具有生理活性的脂联素进行测定，根据具有病理活性的脂联素相对于具有生理活性的脂联素的比率的变化、以及具有生理活性的脂联素相对于具有生理活性的脂联素量和具有病理活性的脂联素量的总和即总脂联素的比率的变化，也能够诊断心血管系统疾病的罹患、糖尿病以及糖尿病性疾病的罹患的风险，和/或，它们的进展程度。在该诊断方法中，还包含使用蛋白质的标准品、健康体液试样等作为标准品使用，并制作标准曲线、对比表等，将诊断对象的检体试样的定量结果与标准曲线、对比表等进行比较而用于诊断的过程等。另外，还能够用于高血压、睡眠呼吸暂停综合征等与肥胖相关的疾病的罹患、罹患风险和/或其进展程度的判定及诊断。【实施例】
[0042]
以下，示出实施例。此外，本发明并不限定于实施例。
[0043]
(脂联素的定量方法的概要)示出在实施例中使用的脂联素的定量方法的概要。图1中的(a)表示具有生理活性的脂联素的检测的示意图。使能够与该脂联素相互作用的t-钙粘蛋白与具有生理活性的脂联素结合。利用抗脂联素通过免疫分析对该具有生理活性的脂联素与t-钙粘蛋白的结合体的脂联素部位进行定量。图1中的(b)表示具有病理活性的脂联素的检测的示意图。使能够与该脂联素相互作用的改性低密度脂蛋白(oxldl)与具有病理活性的脂联素结合。进一步地，使能够与该改
性低密度脂蛋白相互作用的lox-1蛋白与改性低密度脂蛋白结合。利用抗脂联素通过免疫分析对该具有病理活性的脂联素、改性低密度脂蛋白以及lox-1蛋白的复合体的脂联素部位进行定量。
[0044]
(具有生理活性的脂联素的定量)首先，对具有生理活性的脂联素与t-钙粘蛋白的结合进行了试验。对人t-钙粘蛋白基因进行克隆并插入到pseqtag2载体(invitrogen)中，用于蛋白质表达系统。蛋白质的表达使用expi293 expression system(invitrogen)来进行，对在培养基中分泌的融合蛋白，使用ni sepharose excel resin(ge)进行了his纯化。所得到的蛋白质在pbs中进行透析，在过滤器过滤灭菌后，用于实验。将纯化后的t-钙粘蛋白固相化于elisa板，使脂联素重组蛋白与其结合，利用抗脂联素抗体对结合后的脂联素进行检测。
[0045]
将结果示于图2。对于固相化了t-钙粘蛋白的elisa板，结合量依赖于添加的脂联素的浓度而增加。即，示出了使用固相化了t-钙粘蛋白的板而能够对与试样内的t-钙粘蛋白结合的具有生理活性的脂联素的浓度进行定量的情况。
[0046]
接着，进行了人血清试样的具有生理活性的脂联素的浓度的定量。向elisa板的固相化以及检测在以下的条件下进行。固相化：t-钙粘蛋白(139-692aa)0.15μg/孔封闭：1％酪蛋白-na、hepes-nacl中、2hr室温配体：脂联素、hepes-nacl中、2hr室温、血清、hepes-nacl中检测：第一抗体抗脂联素抗体(rabbit polyclonal；biovendor#rd181023100)1μg/ml、1％casein-na/hepes-nacl中、1hr室温第二抗体：anti-rabbit igg-hrp、1：4000、1％酪蛋白-na/hepes-nacl中、1hr室温
[0047]
将结果示于图3。示出了与血清的浓度、即试样中的脂联素的浓度相应地结合量增加而能够对具有生理活性的脂联素的浓度进行定量的情况。
[0048]
另一方面，除了使用包含edta的血浆作为试样以外，也进行了与上述相同的条件下的定量。将血清(serum)与血浆(edta-plasma)的结合量的比较示于图4。在包含edta的血浆中，结合量降低。如已经报道的那样，这是因为t-钙粘蛋白与脂联素的结合是钙依赖性的(hug c，proceedings of the national academy of sciences of the united states of america，2004)。示出了在上述血浆中由于在作为钙阻碍剂的edta的存在下阻碍了结合，因此在上述血清中发生了以往已知的t-钙粘蛋白与脂联素的结合。根据上述结果，能够使用elisa对与t-钙粘蛋白结合的血液试样中的具有生理活性的脂联素进行检测、定量。
[0049]
(具有病理活性的脂联素的定量)接着，对具有病理活性的脂联素与改性ldl的结合进行了试验。使从人血浆分离的ldl在试验管内在铜离子存在下氧化，制成作为改性ldl的氧化ldl。将该氧化ldl与重组脂联素蛋白进行混合，研究两者的复合体是否能够利用改性ldl受体lox-1和抗脂联素抗体的夹心elisa进行检测。lox-1使用了在与上述同样的蛋白质表达系统中使人lox-1表达并纯化后的重组lox-1。
[0050]
在图5中示出了对纯化脂联素与氧化ldl的混合溶液进行了基于抗脂联素抗体的
定量的结果。纯化脂联素的检测不仅依赖于纯化脂联素(adn)的浓度而且还依赖于氧化ldl(oxldl)的浓度而增加。由此表明了能够利用elisa对氧化ldl与脂联素的复合体进行检测。
[0051]
接着，进行了人血清试样的具有病理活性的脂联素的浓度的定量。关于血清试样，从供应商购入并使用了健康血清以及动脉硬化性疾病患者的血液。向elisa板的固相化以及检测在以下的条件下进行。固相化：lox-1 0.15μg/孔封闭：1％酪蛋白-na、hepes-nacl中、2hr室温配体：氧化ldl脂联素复合体、hepes-nacl-2mm edta中、2hr室温检测：第一抗体抗脂联素抗体(rabbit polyclonal)1μg/ml、1％casein-na/hepes-nacl中、1hr室温第二抗体anti-rabbit igg-hrp、1：4000、1％酪蛋白-na/hepes-nacl中、1hr室温
[0052]
将结果示于图6。与健康血清相比，在动脉硬化性疾病患者中，基于抗脂联素抗体的定量、即lox1-氧化ldl-具有病理活性的脂联素的复合体显示了高值。
[0053]
另外，将在检测抗体中使用huc20抗体而对lox-1结合改性ldl进行了检测的情况下的结果示于图7。与图6的情况同样地，与健康血清相比，在动脉硬化性疾病患者中显示出高值。据预测，在图6、图7的结果中显示出高值的患者血清#1的患者与患者血清#2的患者相比，动脉硬化性疾病进一步进展。由上述结果表明，通过该试验能够对动脉硬化性疾病或其进展度进行判定。
[0054]
(参考试验)在图8中示出了利用抗脂联素抗体对从人血浆分离的ldl进行检测的结果。在ldl的各组分中，亚组分l5是电负性的ldl，是相当于改性ldl的组分。在图中，示出了脂联素在亚组分l5中浓缩的情况。即，示出了改性ldl与脂联素进行了结合的可能性。
[0055]
在图9中的(a)中示出了利用抗脂联素抗体对ampk及其磷酸化(pampk)进行检测的结果，在图9中的(b)中示出了检测量。依赖于oxldl的浓度地，pampk的抗脂联素抗体检测量减少，示出了氧化ldl阻碍由脂联素引起的ampk的磷酸化的可能性。该结果表明，氧化ldl作用于脂联素，阻碍脂联素的作用，从具有生理活性的脂联素变成为具有病理活性的脂联素。工业实用性
[0056]
根据本发明，能够正确地掌握脂联素的生理活性，可得到对心血管病风险、生活习惯病风险等的评价有用的脂联素的定量方法、以及用于该定量方法的分析用试剂。该定量方法以及分析用试剂尤其是能够用于对心血管系统疾病的罹患、糖尿病以及糖尿病性疾病的罹患的风险或进展程度的判定等。