一种用于病毒和生物标志物检测的方法

一种用于病毒和生物标志物检测的方法
1.相关申请的引用
2.本技术要求于2020年5月12日提交的新加坡申请号10202004395t的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明一般涉及病毒和生物标志物检测领域。特别地，本发明涉及纳米至微米颗粒用于在力(例如机械力，其继而可以通过例如但不限于磁场等方式施加)的作用下进行分析物检测的用途。


背景技术：

4.对于微生物和病毒检测，目前可采用基于病毒rna或dna的技术，例如基于rt-pcr的测定(ian m.mackay等人,核酸研究(nucleic acids res),2002,30(6):1292
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1305)。目前可采用基于抗体的检测，例如1)酶联免疫吸附测定(elisa,eva engvall和peter perlmann,免疫学杂志(j immunol),1972,109(1):129-135)，2)基于免疫金标记的测定，和3)化学发光微粒免疫测定(abbott laboratories inc.)。其他诊断方法，例如基于表面等离子共振(spr)的测定，依赖于表面等离子共振信号。基于spr的测定中的表面非特异性相互作用的干扰可能导致假阳性信号。这些方法通常昂贵、耗时，并且主要是基于中心实验室的测定。除了上述技术之外，基于侧向流的测定提供了方便、快速和低成本的诊断方法。然而，此类方法通常遇到灵敏度或特异性不足的问题。
5.需要开发具有不同检测原理的用于病毒和生物标志物检测的方法，以克服或改善现有技术的一个或多个限制。


技术实现要素：

6.此处我们描述了用于在广泛的环境条件下检测病毒的通用无荧光标记的方法，其基于特异性相互作用的机械选择而具有单颗粒灵敏度和增强的特异性。这种新方法能够对怀疑的人样本中的特定病毒和病毒感染诱导的抗体进行快速、低成本的即时(point-of-care)诊断和家庭自我诊断。它还可以作为用于开发病毒进入抑制剂的新平台。
7.此处描述的方法原理也适用于快速、准确和灵敏地检测任何其他多价靶标，例如生物标志物、外泌体、抗体、病原体相关分子、污染物等。该方法可作为疾病诊断、生物药物开发和环境监测的新平台。
8.在第一方面，本公开涉及一种检测测试样本中存在或不存在分析物的方法，该方法包括以下步骤：
9.a)将多个运动抵抗颗粒和多个力驱动颗粒与所述测试样本孵育以形成测试混合物，其中所述运动抵抗颗粒包被有第一感测元件并且所述力驱动颗粒包被有第二感测元件，第一感测元件和第二感测元件均能够与分析物特异性结合，其中当测试样本中存在分析物时，所述分析物分别与所述运动抵抗颗粒和所述力驱动颗粒上的所述第一感测元件和
所述第二感测元件结合，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物；
10.b)将步骤a)的测试混合物添加到黏性介质中并向力驱动颗粒施加力，以在存在所述结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物时，将其与未结合的运动抵抗颗粒和未结合的力驱动颗粒分离。
11.有利地，该方法是通用的并且不需要使用荧光标记，以在广泛的环境条件下检测一系列分析物(包括病毒)。通过施加力(例如机械力)实现的机械选择进一步增强了检测的特异性，因为在施加机械力的情况下，特异性连接的颗粒-颗粒缀合物比非特异性缀合物解离的速度慢。对特异性连接的颗粒-颗粒缀合物的数量进行计数使得检测具有单颗粒灵敏度和检测精度。该方法能够快速诊断病毒感染，并可作为开发病毒进入抑制剂的平台。这对于需要进行快速诊断的临床环境非常有利。此外，由于该方法易于使用，该方法可用于病毒感染的家庭自我诊断。
12.进一步有利地，当应用于病毒检测时，该方法不需要从病毒中提取核酸、进行rna病毒的逆转录(rt)或pcr扩增，因此避免了在多步骤过程中样本量的显著损失。该方法还可用于富集低浓度样本中的分析物以进行下游分析，例如测序。该方法可以在小样本量上进行，例如刺破手指的血滴。由于其以机械方式增强的特异性和单颗粒灵敏度，它可以检测低浓度的分析物，例如皮摩尔至飞摩尔浓度的样本。
13.在第二方面，本公开涉及一种感测试剂盒，该感测试剂盒包括：
14.多个运动抵抗颗粒；和
15.多个力驱动颗粒，
16.其中所述运动抵抗颗粒和力驱动颗粒分别包被有能够与测试样本中的靶分析物特异性结合的第一感测元件和第二感测元件。
17.在第三方面，本公开涉及一种用于检测测试样本中存在或不存在分析物的系统，该系统包括：
18.a)多个运动抵抗颗粒和多个力驱动颗粒，其中所述运动抵抗颗粒包被有第一感测元件并且所述力驱动颗粒包被有第二感测元件，其中在存在分析物时，第一感测元件和第二感测元件均能够与分析物特异性结合，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物；和
19.b)包括黏性介质和力的分离装置，在存在所述结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物时，所述分离装置能够将所述结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物与未结合的运动抵抗颗粒和未结合的力驱动颗粒分离。
20.在第四方面，本公开涉及如本文所述的感测试剂盒或系统用于病毒和生物标志物检测的用途。
21.有利地，感测试剂盒或系统的用途可以被设计用于，例如，用于使用人样本的实际临床试验的病毒检测。使用力，(其可以是机械力，例如磁场产生的磁力)，通过黏性介质进行选择和分选，这可以最大限度地减少假阳性和假阴性信号的可能性。该检测方法稳健、无荧光标记、快速且可用于家庭自我诊断。
22.定义
23.本文使用的以下词语和术语应具有所示含义：
24.如本文所用，术语“缀合物”是指与运动抵抗颗粒连接的分析物颗粒，并且该分析
物颗粒还与力驱动颗粒连接，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒。
25.如本文所用，术语“二聚化(dimerization)”或“二聚化的”或“二聚化(dimerize)”是指在两个颗粒之间形成键。
26.如本文所用，术语“非特异性结合”或“非特异性相互作用”是指不由靶分析物形成的二聚化颗粒，其通常由可通过施加力破坏的弱相互作用引起。
27.术语“力驱动颗粒”是指这样的颗粒：当向该颗粒施加力时，该颗粒能够被吸引(或排斥)，导致其在介质(例如黏性介质)中移动。
28.术语“运动抵抗颗粒”是指不移动的颗粒(处于未结合状态)，因为未向这种颗粒施加力。在运动抵抗颗粒与分析物和力驱动颗粒形成缀合物的情况下，鉴于存在力驱动颗粒，这种缀合物可以响应于力而移动，但由于从黏性介质施加到运动抵抗颗粒上的阻力而以较慢的速度移动，从而缀合物的移动速度比未结合的力驱动颗粒的移动速度慢(因为运动抵抗颗粒阻碍或减慢了移动)。施加到运动抵抗颗粒上的阻力还为在一个位点与力驱动颗粒结合并且在另一个位点与运动抵抗颗粒结合的分析物提供了张力。
29.除非另有说明，否则术语“包括”、“包含”、“含有”及其语法变体旨在表示“开放性”或“包括性”语言，使得它们包括列举的要素但也允许包括另外的、未列举的要素。
30.如本文所用，在制剂的组分浓度的上下文中，术语“约”通常意指所述值的+/-5％，更通常所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常所述值的+/-1％，并且甚至更通常所述值的+/-0.5％。
31.在整个本公开中，某些实施方案可以以范围形式公开。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，不应理解为对所公开范围之范围的硬性限制。因此，范围描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对例如1至6的范围描述应被认为已经具体公开了例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这均适用。
具体实施方式
32.现在将公开检测测试样本中存在或不存在分析物的方法的示例性、非限制性的实施方案。
33.检测测试样本中存在或不存在分析物的方法包括以下步骤：
34.a)将多个运动抵抗颗粒和多个力驱动颗粒与测试样本孵育以形成测试混合物，其中运动抵抗颗粒包被有第一感测元件并且力驱动颗粒包被有第二感测元件，第一感测元件和第二感测元件均能够与分析物特异性结合，其中当测试样本中存在分析物时，所述分析物分别与所述运动抵抗颗粒和所述力驱动颗粒上的所述第一和第二感测元件结合，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物；
35.b)将步骤a)的测试混合物添加到黏性介质中并向力驱动颗粒施加力，以在存在所述结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物时，将其与未结合的运动抵抗颗粒和未结合的力驱动颗粒分离。
36.在一实施方案中，提供了一种检测测试样本中存在或不存在分析物的方法，该方法包括以下步骤：
37.a)将多个非磁性颗粒和多个磁性颗粒与测试样本孵育以形成测试混合物，其中非
磁性颗粒包被有第一感测元件并且磁性颗粒包被有第二感测元件，第一感测元件和第二感测元件均能够与分析物特异性结合，其中当测试样本中存在分析物时，所述分析物分别与所述非磁性颗粒和所述磁性颗粒上的所述第一感测元件和第二感测元件结合，以形成结合的非磁性/分析物/磁性颗粒缀合物；
38.b)将测试混合物添加到黏性介质中并向磁性颗粒施加磁场，以在存在结合的非磁性/分析物/磁性颗粒缀合物时，将其与未结合的非磁性颗粒和未结合的磁性颗粒分离。
39.在上述实施方案中，运动抵抗颗粒是指非磁性颗粒，力驱动颗粒是指磁性颗粒，力是指由外部磁场产生的磁力，而运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物是指非磁性/分析物/磁性颗粒缀合物。
40.测试样本可以是液体样本。测试样本可以源自或获自人、动物、微生物或环境。测试样本可以包括血液、尿液、唾液、痰、血清、细胞来源的液体或组织。
41.分析物可以选自由以下构成的组：病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、藻类、脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、蛋白质、抗体、抗原、细胞、外泌体、病原体相关分子、污染物、生物标志物、靶受体、细胞内物质、细胞外物质、微生物来源的产物或改性生物材料。分析物可以是多价的。分析物可以是病毒。分析物可以是covid-19病毒。靶受体可以是sars-cov-2受体结合结构域蛋白。
42.该方法可以进一步包括步骤c)：在将结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物与未结合的运动抵抗颗粒和未结合的力驱动颗粒分离之后，对结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物进行定量。可以通过显微镜或任何合适的可视化装置观察结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物并对结合的缀合物的数量计数来进行定量。
43.运动抵抗颗粒的尺寸可以在以下范围内：约1μm至约100μm、约1μm至约90μm、约1μm至约80μm、约1μm至约70μm、约1μm至约60μm、约1μm至约50μm、约1μm至约40μm、约1μm至约30μm、约1μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1μm至约5μm、约5μm至约100μm、约10μm至约100μm、约20μm至约100μm、约30μm至约100μm、约40μm至约100μm、约50μm至约100μm、约60μm至约100μm、约70μm至约100μm、约80μm至约100μm或约90μm至约100μm。运动抵抗颗粒可以是非磁性颗粒。
44.运动抵抗颗粒可以选自由以下组成的组：聚苯乙烯(ps)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚(ε-己内酯)(pcl)、聚丙烯酸酯(pa)、聚乳酸(pla)、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(pgma)、三聚氰胺树脂、二氧化硅、水凝胶和脂质膜囊泡。水凝胶可以是聚乙烯醇的球形网络、丙烯酸酯聚合物和具有丰富亲水基团的共聚物、琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸、弹性蛋白样多肽。运动抵抗颗粒可以是分析测定中常用的任何珠粒。
45.力驱动颗粒的尺寸可以在以下范围内：约10nm至约50μm、约10nm至约10μm、约10nm至约1μm、约10nm至约500nm、约10nm至约100nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1μm、约100nm至约10μm、约100nm至约50μm、约500nm至约1μm、约500nm至约10μm、约500nm至约50μm、约1μm至约10μm、约1μm至约50μm或约10μm至约50μm。力驱动颗粒可以是磁性颗粒。
46.当力驱动颗粒是磁性颗粒时，磁性颗粒可以是顺磁性的、超顺磁性的或磁性的。磁性颗粒可以选自由以下组成的组：铁、钴、镍、其合金、其氧化物及其组合。
47.运动抵抗颗粒的尺寸可以优选地大于力驱动颗粒的尺寸。较大尺寸的运动抵抗颗粒可以具有更大的移动抵抗能力。
48.黏性介质可以是透明的或半透明的。黏性介质可以具有以下范围内的黏度：约0.01pa
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s至约10pa
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s、约0.03pa
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s、约0.5pa
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s至约10pa
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s、约0.8pa
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s、约8pa
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s至约10pa
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s、约0.01pa
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s至约8pa
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s至约1pa
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s至约0.8pa
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s、约0.01pa
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s至约0.03pa
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49.黏性介质可以是甘油、橄榄油、亚麻籽油、机油、糖浆、铁磁流体或其混合物。黏性介质可以是血清或稀释的血清。黏性介质可以是甘油和水的混合物。混合物中甘油的重量百分比可以在以下范围内：约10wt％至约100wt％、约20wt％至约100wt％、约30wt％至约100wt％、约40wt％至约100wt％、约50wt％至约100wt％、约60wt％至约100wt％、约70wt％至约100wt％、约80wt％至约100wt％、约90wt％至约100wt％、约10wt％至约90wt％、约10wt％至约80wt％、约10wt％至约70wt％、约10wt％至约60wt％、约10wt％至约50wt％、约10wt％至约40wt％、约10wt％至约30wt％或约10wt％至约20wt％。
50.黏性介质可以是拥挤剂溶液。拥挤剂可以是葡聚糖、聚乙二醇化蛋白、聚乙二醇(peg)、溶菌酶、牛血清白蛋白(bsa)、聚(4-苯乙烯磺酸钠)(pss)、亲水性多糖或其混合物。溶液中拥挤剂的重量百分比可以在以下范围内：约1wt％至约80wt％、约5wt％至约80wt％、约10wt％至约80wt％、约20wt％至约80wt％、约30wt％至约80wt％、约40wt％至约80wt％、约50wt％至约80wt％、约60wt％至约80wt％、约70wt％至约80wt％、约1wt％至约70wt％、约1wt％至约60wt％、约1wt％至约50wt％、约1wt％至约40wt％、约1wt％至约30wt％、约1wt％至约20wt％、约1wt％至约10wt％或约1wt％至约5wt％。该溶液可以是水性溶液。
51.黏性介质可以是具有不同类型增稠剂的基液。基液可以是基础油。增稠剂可以选自聚氨酯、丙烯酸聚合物、胶乳、苯乙烯/丁二烯、聚乙烯醇、天然黏土、合成黏土、纤维素制品、磺酸盐、树胶、糖类、蛋白质、有机硅化合物(organosilicones)、聚乙二醇、淀粉、藻酸或藻酸盐。
52.包被在运动抵抗颗粒上的第一感测元件可以与包被在力驱动颗粒上的第二感测元件相同。分析物可以具有多个等效的用于与第一感测元件和第二感测元件结合的结合位点。包被在运动抵抗颗粒上的第一感测元件可以与包被在力驱动颗粒上的第二感测元件不同。分析物可以优选地针对第一感测元件和第二感测元件具有不同的结合位点，以减少运动抵抗颗粒的自偶联或力驱动颗粒的自偶联并提高检测的灵敏度。对于含有用于一种类型的感测元件的一个结合位点和用于另一种类型的感测元件的一个结合位点的靶分析物，当运动抵抗颗粒和力驱动颗粒包被的是靶向靶分析物上的不同结合位点的不同感测分子时，只能在运动抵抗颗粒和力驱动颗粒之间形成二聚体，从而形成特异性缀合物。
53.步骤a)的方法可以包括以下步骤：a1)首先将运动抵抗颗粒或力驱动颗粒与测试样本孵育以形成第一孵育溶液，和a2)进一步将所述第一孵育溶液与其他的力驱动颗粒或其他的运动抵抗颗粒孵育，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物。
54.步骤a1)的孵育时间可以在以下范围内：约10分钟至约18小时、约10分钟至约12小时、约10分钟至约8小时、约10分钟至约4小时、约10分钟至约1小时、约10分钟至约40分钟、
约10分钟至约30分钟、约10分钟至约20分钟、约20分钟至约18小时、约30分钟至约18小时、约40分钟至约18小时、约1小时至约18小时、约4小时至约18小时、约8小时至约18小时或约12小时至约18小时。
55.步骤a2)的孵育时间可以为约10分钟至约2小时、约10分钟至约1.5小时、约10分钟至约1小时、约10分钟至约50分钟、约10分钟至约40分钟、约10分钟至约30分钟、约10分钟至约20分钟、约20分钟至约2小时、约30分钟至约2小时、约40分钟至约2小时、约50分钟至约2小时、约1小时至约2小时或约1.5小时至约2小时。
56.有利地，通过使孵育步骤a1)和a2)分开，可以使运动抵抗颗粒之间的自偶联或力驱动颗粒之间的自偶联最小化。步骤a1)的孵育时间优选地比步骤a2)的孵育时间长，以使步骤a1)的运动抵抗或力驱动颗粒能够与分析物彻底混合。
57.该方法可以进一步包括：在步骤a1)之后且在步骤a2)之前，涡旋所述第一孵育溶液的步骤，以去除可能的运动抵抗颗粒或力驱动颗粒的自偶联。该方法的结果是当运动抵抗颗粒由于以结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物形式存在的中间分析物的原因而连接至一个或多个力驱动颗粒时，运动抵抗颗粒沿施加到力驱动颗粒的力的方向迁移。
58.在将测试混合物添加到黏性介质后，测试混合物可在测试混合物和黏性介质之间形成瞬时界面。由于黏性介质的高黏度，运动抵抗和力驱动颗粒将均保持在界面附近。
59.当使用的力驱动颗粒是磁性颗粒时，可以将一个或多个磁体适当地置于黏性介质的外部或内部以产生磁场，从而将磁力(作为机械力)以期望方向施加到力驱动颗粒上，这可驱使不同的颗粒种类(未结合的运动抵抗颗粒、未结合的力驱动颗粒和结合的缀合物)分离。根据检测系统的布置，可以将一或多个磁体置于黏性介质下方，以在垂直方向或重力方向上施加磁力。在这样的磁力作用下，未结合的力驱动颗粒可以最快地移动通过黏性介质，而未结合的运动抵抗颗粒可能不移动，因为它不受磁力(远远强于重力)的诱导。特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物可以沿磁力方向移动，但由于缀合物中结合的运动抵抗颗粒所贡献的较大的惯性且还由于黏性介质的存在，因而特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物与未结合的力驱动颗粒相比可移动得显著更慢。因此，这些种类可在空间上分离，使其可易于被检测。
60.可以将一或多个磁体跨黏性介质放置，以在水平方向或垂直于重力的方向上施加磁力。未结合的运动抵抗颗粒可以保持在其原始位置，因为它们不受所施加的磁力影响。未结合的力驱动颗粒可以朝向施加磁力的方向移动。与在垂直方向、水平方向或垂直于重力方向施加磁力的情况类似，未结合的力驱动珠粒可移动得最快，未结合的运动抵抗珠粒可能不移动，而由于缀合物中结合的运动抵抗颗粒所贡献的较大的惯性且还由于黏性介质的存在，特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物与未结合的力驱动颗粒相比可以显著更慢的速度移动。因此，可以通过低档光学显微镜选择观察区域来分离不同种类的颗粒，并观察特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物。
61.该力可以是机械力。该力可以是外力并且因此可以是外部机械力。机械力可以是通过施加磁场产生的磁力。有利地，通过例如磁场的方式产生的机械力可以用作区分非特异性结合和特异性结合的选择工具，因此减少假阳性信号的可能性。特异性相互作用是指分析物与运动抵抗颗粒和力驱动颗粒由于第一感测元件和第二感测元件的存在结合，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物。另一方面，非特异性相互作用包括所有其
他类型的相互作用，例如氢键、疏水相互作用、静电相互作用等。由于非特异性结合通常比特异性相互作用弱得多，基于非特异性结合的结合颗粒将在结合颗粒移到远处之前解离。只有通过特异性相互作用结合的颗粒缀合物可实现分离，因为其不太可能因力而解离。
62.当施加在特异性结合的缀合物(即运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物)和非特异性结合的缀合物(例如，运动抵抗/力驱动颗粒缀合物)中的力驱动颗粒上的力使这些缀合物在黏性介质中移动时，黏性介质中的摩擦可同时对这些缀合物中的运动抵抗颗粒施加阻力。与未结合的力驱动颗粒相比，这可减慢特异性结合的缀合物和非特异性结合的缀合物的移动。此外，这对于以机械方式增强的特异性来说可能很重要，因为施加在特异性结合的缀合物中的运动抵抗颗粒上的阻力对分析物产生张力，这使得鉴于分析物在一个位点上与力驱动颗粒特异性结合并且在另一位点上与运动抵抗颗粒特异性结合，特异性结合的缀合物与非特异性结合的缀合物相比不太可能解离。
63.当机械力是磁力时，产生磁力的磁场可以施加以下的时间段：约10秒至约60分钟、约10秒至约30分钟、约10秒至约10分钟、约10秒至约1分钟、约10秒至约30秒、约30秒至约1分钟、约30秒至约10分钟、约30秒至约30分钟、约30秒至约60分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约60分钟、约10分钟至约30分钟、约10分钟至约60分钟、约30分钟至约60分钟，或根据各种颗粒的分离和另外地对结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物的量进行定量的需要而进行。
64.黏性介质的深度可以在以下范围内：约0.1mm至约10mm、约0.5mm至约10mm、约1mm至约10mm、约3mm至约10mm、约5mm至约10mm、约8mm至约10mm、约0.1mm至约8mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约1mm或约0.1mm至约0.5mm，或者可以根据需要调整到更宽的深度，以更好地分离各种未结合的力驱动颗粒、未结合的运动抵抗颗粒和结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物。
65.可以将特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物的观察结果与作为定量对照的具有非特异性结合的运动抵抗颗粒和力驱动颗粒对的参考样本进行比较。样本组和对照组之间的差异可以用于与参考尺度进行比较，以确定分析物的存在、量和浓度。
66.该方法可以进一步包括在步骤b)或步骤c)之后，从黏性介质中收集特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物的步骤。收集步骤还可以用作分析物的浓缩步骤。收集的样本可用于进一步的下游处理，例如测序。
67.收集步骤可以通过使黏性介质在与磁场方向不同的方向上流动来实现。黏性介质流动所产生的力(例如机械力)可用于进一步区分非特异性结合和特异性结合，以实现二维分选和选择。黏性介质的流动可以通过微流通道实现，这有利于检测和收集特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物。
68.现在将公开感测试剂盒、系统以及感测试剂盒或系统的用途的示例性、非限制性实施方案。
69.感测试剂盒包括：
70.多个运动抵抗颗粒；和
71.多个力驱动颗粒。
72.其中运动抵抗颗粒和力驱动颗粒分别包被有能够与测试样本中的靶分析物特异性结合的第一感测元件和第二感测元件。
73.在一个实施方案中，提供了一种感测试剂盒，该感测试剂盒包括：
74.多个非磁性颗粒；和
75.多个磁性颗粒。
76.其中非磁性颗粒和磁性颗粒分别包被有能够与测试样本中的靶分析物特异性结合的第一感测元件和第二感测元件。
77.在上述实施方案中，运动抵抗颗粒是指非磁性颗粒，并且力驱动颗粒是指磁性颗粒。
78.试剂盒可以进一步包括黏性介质。黏性介质可以是透明的或半透明的。黏性介质可以具有以下范围内的黏度：约0.1pa
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·
s。
79.黏性介质可以是甘油、橄榄油、亚麻籽油、机油、糖浆、铁磁流体或其混合物。黏性介质可以是血清或稀释的血清。黏性介质可以是甘油和水的混合物。混合物中甘油的重量百分比可以在以下范围内：约10wt％至约100wt％、约20wt％至约100wt％、约30wt％至约100wt％、约40wt％至约100wt％、约50wt％至约100wt％、约60wt％至约100wt％、约70wt％至约100wt％、约80wt％至约100wt％、约90wt％至约100wt％、约10wt％至约90wt％、约10wt％至约80wt％、约10wt％至约70wt％、约10wt％至约60wt％、约10wt％至约50wt％、约10wt％至约40wt％、约10wt％至约30wt％或约10wt％至约20wt％。
80.运动抵抗颗粒的尺寸可以在以下范围内：约1μm至约100μm、约1μm至约90μm、约1μm至约80μm、约1μm至约70μm、约1μm至约60μm、约1μm至约50μm、约1μm至约40μm、约1μm至约30μm、约1μm至约20μm、约1μm至约10μm、约1μm至约5μm、约5μm至约100μm、约10μm至约100μm、约20μm至约100μm、约30μm至约100μm、约40μm至约100μm、约50μm至约100μm、约60μm至约100μm、约70μm至约100μm、约80μm至约100μm或约90μm至约100μm。
81.力驱动颗粒的尺寸可以在以下范围内：约10nm至约50μm、约10nm至约10μm、约10nm至约1μm、约10nm至约500nm、约10nm至约100nm、约100nm至约500nm、约100nm至约1μm、约100nm至约10μm、约100nm至约50μm、约500nm至约1μm、约500nm至约10μm、约500nm至约50μm、约1μm至约10μm、约1μm至约50μm或约10μm至约50μm。
82.当力驱动颗粒是磁性颗粒时，试剂盒可以进一步包括一个或多个磁体以施加磁场，从而产生磁力来分离不同的颗粒种类。
83.用于检测测试样本中存在或不存在分析物的系统包括：
84.a)多个运动抵抗颗粒和多个力驱动颗粒，其中运动抵抗颗粒包被有第一感测元件并且力驱动颗粒包被有第二感测元件，其中在存在分析物时，第一感测元件和第二感测元件均能够与分析物特异性结合，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物；和
85.b)包括黏性介质和力的分离装置，在存在所述结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物时，该分离装置能够将所述结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物与未结合的运动抵抗颗粒和未结合的力驱动颗粒分离。
86.在一个实施方案中，提供了一种用于检测测试样本中存在或不存在分析物的系
统，该系统包括：
87.a)多个非磁性颗粒和多个磁性颗粒，其中非磁性颗粒包被有第一感测元件并且磁性颗粒包被有第二感测元件，其中在存在分析物时，第一感测元件和第二感测元件均能够与分析物特异性结合，以形成结合的非磁性/分析物/磁性颗粒缀合物；和
88.b)包括黏性介质和磁场的分离装置，当存在所述结合的非磁性/分析物/磁性颗粒缀合物时，该分离装置可以将所述结合的非磁性/分析物/磁性颗粒缀合物与未结合的非磁性颗粒和未结合的磁性颗粒分离。
89.在上述实施方案中，运动抵抗颗粒是指非磁性颗粒，力驱动颗粒是指磁性颗粒，力是指产生磁力的磁场，并且运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物是指非磁性/分析物/磁性颗粒缀合物。
90.如本文所述的感测试剂盒或系统用于病毒或生物标志物检测的用途。
91.有利地，感测试剂盒或系统的用途可以被专门设计用于病毒或生物标志物检测，以用于使用人样本的实际临床试验。使用力(例如机械力，其又可以是通过例如磁场的方式产生的磁力)可以最大限度地减少假阳性信号的可能性。该检测方法稳健、无荧光标记、快速且可用于家庭自我诊断。
附图说明
92.附图示出了所公开的实施方案并且用于解释所公开的实施方案的原理。然而，应当理解，这些附图仅是为了说明的目的而设计的，而不是用作定义对本发明的限制。
93.图1a是描述本公开的检测方法的一般概念的示意图，其中(1)表示感测元件，(2)表示分析物，(3)表示包被的力驱动颗粒(在该实例中为包被有感测元件(1)的超顺磁性珠粒)，(4)表示包被的运动抵抗颗粒(在该实例中为包被有感测元件(1)的非磁性珠粒)，(5)表示结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物，(6)表示高黏性介质，并且(7)表示一对磁体。
94.图1b是基于图1a的一般概念、结合速度为v的黏性介质流动所描述的本公开的用于分析物检测和收集的二维检测方法的示意图。部件的标记如下所示：(1)表示感测元件，(2)表示分析物，(3)表示包被的力驱动颗粒(在该实例中为包被有感测元件(1)的磁性珠粒)，(4)表示包被的运动抵抗颗粒(在该实例中为包被有感测元件(1)的非磁性珠粒)，(5)表示结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物，并且(6)表示高黏性介质。
95.图2是使用带有生物素和地高辛标记的双链dna作为分析物的概念验证实验程序的示意图。部件的标记如下所示：(100)表示带有生物素和地高辛标记的双链dna作为分析物，(200)表示包被有链霉亲和素的10μm聚苯乙烯珠粒，(300)表示包被有链霉亲和素的3μm超顺磁性珠粒，(400)表示缓冲溶液，(500)表示甘油黏性介质，(600)表示缓冲溶液和甘油黏性介质之间的界面，(700)表示运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物，(800)表示一对磁体，并且(900)表示显微镜。
96.图3是描述用运动抵抗的抗地高辛包被的大聚苯乙烯珠粒(2000)和力驱动的抗地高辛包被的小超顺磁性珠粒(3000)检测作为分析物(1000)的地高辛包被的200nm模拟(mock)病毒的示意图。因此，分析物(1000)与抗地高辛包被的大聚苯乙烯珠粒(即包被的非磁性珠粒)(2000)和抗地高辛包被的小超顺磁性珠粒(3000)二聚化以形成结合的运动抵
抗/分析物/力驱动颗粒缀合物(4000)。
97.图4是图2的概念验证实验的视频成像结果，其中带有生物素和地高辛标记的双链dna是待检测的分析物。
98.图5是比较使用不同浓度分析物(0.4pm和4fm)用于图3的概念验证实验所检测到的聚苯乙烯珠粒数量的实验结果，其中带有生物素和地高辛标记的双链dna是待检测的分析物。对于0.4pm和4fm分析物浓度，在实验性试验1和2中所计数的聚苯乙烯珠粒数目相比于没有分析物分别显示出121倍和0.9倍的增加。
99.图6是比较了在图3的实验的标准缓冲液中使用不同浓度的分析物(6pm、60fm和600fm)检测到的聚苯乙烯珠粒数目的实验结果，以及在10倍稀释的人血清中使用600fm分析物的另外结果。对于标准缓冲液中60fm、600fm和6pm分析物浓度，聚苯乙烯珠粒计数相比于没有分析物分别显示出3倍、32倍和156倍的增加。当使用10倍人血清代替标准缓冲液时，在600fm分析物浓度下，聚苯乙烯珠粒计数相比于没有分析物示出了39倍的增加。
100.附图详细说明
101.图1a是描述本公开的检测方法的一般概念的示意图。在没有分析物(2)的情况下，珠粒将不会二聚化形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物(5)。在一段时间的孵育后，将混合物置于高黏性介质(6)中，磁体(7)置于侧边。然后，混合物中的所有力驱动颗粒(超顺磁性珠粒)(3)均被吸引并朝向诱导力的方向移动。当在分析物(5)存在下超顺磁性珠粒与运动抵抗颗粒(在该实例中为非磁性珠粒)二聚化时，由于二聚化珠粒的尺寸较大，二聚化珠粒在黏性介质(6)中经历较大阻力并且比未结合的超顺磁性珠粒(3)移动得慢。另一方面，未结合的非磁性珠粒(4)在介质中保持静止。这导致了不同种类的珠粒分离，以易于分析物(2)的定量。二聚化珠粒之间的阻力还提供了筛选非特异性结合的门控机制(gating mechanism)。由于非特异性结合通常比特异性相互作用弱得多，基于非特异性结合而二聚化的珠粒将在二聚体移动远离之前解离。只有基于特异性相互作用的珠粒二聚体(5)才能实现分离。
102.图1b是基于图1a的一般概念、结合速度为v的黏性介质流动所描述的本公开的用于分析物检测和收集的二维检测方法的示意图，其使得分析物(2)与包被有感测元件(1)的运动抵抗(非磁性)珠粒(4)和力驱动(磁性)珠粒(3)预孵育，以使得形成特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物(5)，然后将其加载至含有黏性介质(6)的分选和收集通道中，在该通道中，在垂直方向上施加力f(在该实例中为磁力)以将特异性结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物(5)与各个非结合的珠粒分离。另外的黏性介质流以与诱导力方向(即磁场方向)不同的方向以速度v引入，以促进分析物检测和收集(在该实例中，沿着标记为“正方向”的方向，朝向分离装置的末端)。
103.实施例
104.本发明的非限制性实施例将通过参考具体实施例而被进一步更详细地描述，其不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
105.实施例1：检测双标记双链dna
106.为了证明检测的可行性，如图2所示进行概念验证实验，其中使用在两端标记有生物素和地高辛的双链dna(thermofisher，us)作为分析物(100)来诱导珠粒二聚化。分析物(100)被设计为二聚化抗地高辛抗体(pierce,us)包被的10μm聚苯乙烯珠粒
(polysciences,us)(200)和链霉亲和素(pierce,us)包被的3μm超顺磁性珠粒(invitrogen，us)(300)。此处，运动抵抗颗粒是聚苯乙烯珠粒(其是非磁性的)并且力驱动颗粒是超顺磁性珠粒(其是磁性的)。
107.首先，如图2的“1.孵育”步骤中所示，将0.4皮摩尔(pm)和4飞摩尔(fm)浓度的分析物(100)与运动抵抗聚苯乙烯珠粒(200)分别孵育30分钟和10小时，以使分析物(100)与聚苯乙烯珠粒(200)结合。然后将过量链霉亲和素包被的超顺磁性珠粒(300)添加到缓冲液中并再孵育30分钟以最大限度地增加珠粒二聚化的机会。
108.其次，如图2的“2.沉降”步骤中所示，将来自步骤1的含有结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物(700)的所得混合物添加到在通道中的黏性介质(500)(例如甘油(fisher chemical,us))的顶部，在所得混合物的缓冲溶液(400)和甘油(500)之间形成瞬时界面(600)。此处，结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物是结合的聚苯乙烯/分析物/超顺磁性珠粒缀合物。由于介质具有高黏度和较小重力，两个种类的珠粒均保持在界面附近。
109.随后，将一对磁体(supermagetman,us)(800)置于甘油通道下方约10分钟。如图2的“3.分离”步骤所示，磁力驱动珠粒种类的分离。
110.然后，如图2的“4.检测”步骤所示，将通道置于使用10
×
和50
×
物镜的显微镜(olympus ix41)(900)下。通过调整物镜的聚焦高度，可以观察甘油底部区域的大聚苯乙烯珠粒(其实际上是结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物(700))，并对其进行计数。
111.按照前述程序，生成通过甘油的扫描视频。图4中列出了视频的几帧，以证明成功分离了珠粒种类并因此检测到了缓冲液中的分析物。在未添加任何分析物的对照实验中，在10
×
放大倍率下，可见3μm超顺磁性珠粒散布在甘油底部区域，仅看见一个10μm聚苯乙烯珠粒。向上移动聚焦位置，既不能观察到超顺磁性珠粒，也不能观察到聚苯乙烯珠粒。进一步向上聚焦到甘油顶部区域，可以观察到一层聚苯乙烯珠粒。与没有分析物的对照实验相比，在仅存在0.4pm分析物的情况下，可以在甘油底部和中间区域中观察到超过一百个聚苯乙烯珠粒。在50
×
放大倍率下，总能见到大聚苯乙烯珠粒伴随一个或多个小磁性珠粒，呈二聚或低聚形式。
112.对于在0.4pm分析物(30min孵育时间)和4fm分析物(孵育过夜)存在下的两项实验性试验，甘油底部和中间区域中聚苯乙烯珠粒数目的详细定量在图5中显示。从它们各自的对照实验(其中不存在分析物)可以看出鲜明对比。该实验用作本公开中的方法的初始概念验证并且证明了所述方法中的检测限可以低至飞摩尔浓度水平。
113.实施例2：检测地高辛包被的模拟病毒
114.还测试了本方法在病毒检测中的能力。遵循的程序与实施例1中描述的类似，不同之处在于分析物的类型被地高辛包被的200nm乳胶珠粒(bangs lab，us)取代作为模拟病毒颗粒(1000)，因此，大聚苯乙烯珠粒(2000)和小超顺磁性珠粒(3000)均包被有抗地高辛，如图3所示。因此，分析物(1000)能够二聚化抗地高辛包被的大聚苯乙烯珠粒(2000)和抗地高辛包被的小超顺磁性珠粒(3000)，以形成结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物(4000)。此处，运动抵抗颗粒是聚苯乙烯珠(其是非磁性的)，力驱动颗粒是超顺磁性珠粒(其是磁性的)，并且结合的运动抵抗/分析物/力驱动颗粒缀合物是结合的聚苯乙烯/分析物/超顺磁性珠粒缀合物。
115.与双标记dna分析物检测的结果类似，当样本中包括pbs标准缓冲液中的6pm、600fm和60fm模拟病毒(分析物，(1000))进行检测时，可以观察到信号急剧增加，与来自不存在模拟病毒分析物的对照的信号相比，分别得到了156倍、32倍和3倍的增加，如图6所示。结果进一步增强了检测方法的可靠性。此外，为了模拟实际诊断，还在10倍稀释的人血清中进行检测。很明显，在这种条件下产生的信号与在pbs标准缓冲液中具有相同浓度的模拟病毒，即600fm浓度的样本没有偏差，证明了检测方法在复杂环境(如人血清)中具有稳健性。基于该结果，本发明所公开的方法可以很容易地应用于临床环境，以对人生物样本中的病毒进行准确诊断。
116.工业适用性
117.本文公开的方法、感测试剂盒和系统可用于广泛种类的诊断应用，例如环境监测、临床检测和基于家庭的自我诊断，以检测测试样本中存在或不存在分析物。该方法、感测试剂盒和系统基于特异性相互作用的机械门控选择而提供了单颗粒灵敏度和增强的特异性。进一步地，该方法允许实现收集或浓缩靶分析物用于下游处理。
118.明显的是，本领域的技术人员在阅读了上述公开内容之后，在不背离本发明的精神和范围的情况下，对本发明的多种其他改进和修改将是明显的，并且旨在将所有这些改进和修改均涵盖在所附权利要求的范围内。