用于对独特表型进行索引分选的方法及用于其的系统与流程

用于对独特表型进行索引分选的方法及用于其的系统
1.相关申请的交叉引用
2.根据35 u.s.c.
§
119(e)，本技术要求于2020年4月28日提交的美国临时专利申请序列号63/016,702的提交日的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。


背景技术：

3.流式粒子分选系统(例如进行分选的流式细胞仪)被用于基于粒子的至少一个测量的特性来分选流体样本中的粒子。在流式粒子分选系统中，流体悬浮液中的粒子(例如分子、结合分析物的小珠或各个细胞)以流的形式经过传感器检测流中包含的要被分选的类型的粒子的检测区。当检测到要被分选的类型的粒子时，传感器触发选择性地分离感兴趣的粒子的分选机构。例如，经分选的感兴趣的粒子被分离到分区(例如样本容器、试管或多孔板的孔)中。
4.粒子感测通常通过以下步骤来执行：使流体流经过粒子暴露于来自一个或更多个激光器的照射光的检测区；以及测量粒子的光散射和荧光性质。粒子或其成分可以用荧光染料来标记以促进检测，并且可以通过将光谱上不同的荧光染料用于标记不同的粒子或成分来同时检测多种不同的粒子或成分。使用一个或更多个光电传感器执行检测以促进各个不同的荧光染料的荧光的独立的测量。
5.为了分选样本中的粒子，在液流的中断点处，液滴充电机构利用电荷对包含要被分选的类型的粒子的液流的液滴进行充电。液滴经过静电场并且基于液滴上的电荷的极性和幅度而偏转到一个或更多个分区(例如样本采集容器)中。未充电的液滴不被静电场偏转。


技术实现要素：

6.本公开的方面包括用于基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选的方法。根据特定实施例的方法包括：将所述样本引入流式细胞仪；使引入的所述样本在液流中流动；用光源照射所述液流中的所述样本；检测来自在所述液流中流动的所述样本中的细胞的光；基于从检测的光生成的一个或更多个数据信号而标识在所述液流中流动的所述样本中的细胞的表型；以及基于标识的顺序将所述样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到分区中。还提供了用于实践主题方法的系统。还描述了非暂时性计算机可读存储介质。
7.在一些实施例中，在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后，从表型的集合中排除所述第一表型。在其他实施例中，将预定数量的细胞分选到分区中。在每个实例中，所述预定数量的细胞可以是例如1或2或10或100或更多。
8.在一些实施例中，所述分区包括孔。例如，所述孔可以是多孔板的孔。在一些实施例中，在将预定数量的细胞分选到第一孔中之后将所述多孔板向前移动到第二孔。所述预定数量的细胞可以是例如1或2或10或100或更多。
9.在一些实施例中，记录分选到分区中的细胞的表型。分选到分区中的细胞的表型
可以通过例如将细胞表型的表示添加到列表、概率数据结构、关联数组或真值表来记录。在一些实例中，在分选细胞之前，查询以前分选的表型的记录。在实施例中，可以查询表型的列表或概率数据结构或关联数组或真值表以确定是否已经分选第一细胞，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在一些实例中，所述概率数据结构可以是布隆过滤器。在这些实例中，基于样本的分析来选择结合所述布隆过滤器使用的哈希函数以减少所述布隆过滤器中的冲突。在一些实施例中，所述关联数组是内容可寻址的存储器。
10.在一些实施例中，对标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息进行记录。例如，可以维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表。在一些实施例中，基于所述样本中的细胞的子集对由所述样本中的细胞表现出的表型的数量做出估计。
11.在特定实例中，方法包括使细胞偏转到第一分区和第二分区中。在这些实施例中，所述样本中的细胞可以分成表现包括预定数量的表型的第一表型集合的第一组以及不表现所述第一表型集合的第二组。在这样的实施例中，所述第一组可以基于标识的顺序而被分选到所述第一分区或所述第二分区之一中。在一些实例中，确定用于将细胞分成第一组和第二组的所述第一表型集合以使得所述第一组和所述第二组包括基本上相同的细胞数量。在这些实施例中，所述方法还可以包括：基于所述样本中已分选的细胞动态地更新所述第一表型集合，以使得所述第一组和所述第二组包括基本上相同的细胞数量。
12.在实施例中，基于根据从检测的光生成的数据信号而确定的一个或更多个参数值来标识细胞表型。在实例中，细胞的特定参数值指示细胞是否具有表型的不确定状态。在这样的实施例中，当细胞表现出该细胞是否具有表型的不确定状态时，该细胞可以不被分选。
13.在一些实施例中，所述方法包括基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而估计针对单个数据信号测量的荧光溢出(spillover)量。在这些实施例中，所述方法可以包括基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而估计两个萤光团之间的协方差。在这些实施例中，基于所估计的萤光团之间的协方差，可以为用于萤光团的表达定义阈值。在这样的实施例中，所述方法可以包括基于所估计的萤光团之间的协方差而定义关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度(measure)。
14.在特定实例中，感兴趣的样本包括多个萤光团，其中，每个萤光团的荧光谱与所述样本中的至少一个其他萤光团的荧光谱重叠。例如，每个萤光团的荧光谱可以与所述样本中的至少一个其他萤光团的荧光谱重叠10nm或更多，例如25nm或更多以及包括50nm或更多。在一些实例中，所述样本中的一个或更多个萤光团的荧光谱与所述样本中的两个不同的萤光团的荧光谱重叠例如10nm或更多、例如25nm或更多以及包括50nm或更多。在其他实施例中，感兴趣的样本包括具有非重叠的荧光谱的多个萤光团。在这些实施例中，每个萤光团的荧光谱与至少一个其他萤光团在10nm或更近之内相邻，例如9nm或更近、例如8nm或更近、例如7nm或更近、例如6nm或更近、例如5nm或更近、例如4nm或更近、例如3nm或更近、例如2nm或更近以及包括1nm或更近。
15.在实施例中，预定表型的集合包括具有一个或更多个细胞亚型的细胞类型。例如，所述细胞类型可以是t细胞。在这样的实施例中，所述细胞亚型可以包括cd4+t细胞或cd8+t细胞。
16.本公开的方面还包括具有用于表征液流中的样本的粒子(例如生物样本中的细胞)的光检测系统的系统。根据特定实施例的系统包括：光源，被配置为照射在液流中流动
的包括细胞的所述样本；光检测系统，包括用于检测来自所述样本中的所述细胞的光并且从检测的光生成多个数据信号的光电检测器；细胞分选器，被配置为接收在所述液流中流动的包括细胞的所述样本；多个分区，被配置为接收来自所述样本的通过所述细胞分选器分选的细胞；以及处理器，包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器：基于从检测的光生成的所述数据信号中的一个或更多个数据信号而标识所述样本中的细胞的表型；以及指示所述细胞分选器基于标识的顺序而将所述样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到所述分区中。
17.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后停止分选表型的集合中的第一表型。在其他实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器将预定数量的细胞动态地分选到分区中。所述预定数量的细胞可以是例如1、2、10或100或更多。
18.在实例中，所述分区可以包括孔。在一些情况下，所述孔是多孔板的孔。在一些实施例中，系统包括被配置为移动多孔板的可平移的支撑台，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器在将预定数量的细胞分选到第一孔中之后指示所述支撑台将所述多孔板移动到第二孔。
19.在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器存储分选到分区中的细胞的表型。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过将已分选的细胞的表型的表示添加到表型的列表、概率数据结构、关联数组或真值表而存储分选到分区中的细胞的表型。在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器在适用时查询所述表型的列表、所述概率数据结构、所述关联数组或所述真值表，以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在一些实例中，所述概率数据结构是布隆过滤器。在一些实例中，所述关联数组是内容可寻址的存储器。
20.在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器存储标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表。
21.在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器：基于标识的顺序而将样本中的表现包括一个或更多个表型的第一表型集合的细胞动态地分选到第一分区中；以及将样本中的不表现所述第一表型集合的细胞动态地分选到第二分区中。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所述样本中已分选的细胞而动态地更新所述第一表型集合，以使得分选到所述第一分区中的细胞和分选到所述第二分区中的细胞包括基本上相同的细胞数量。
22.在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器不分选表现不确定表型的细胞。
23.在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器：基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算针对单个数据信号测量的荧光溢出量的估计值。在这样的实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器：基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算两个萤光团之间的协方差的估计值。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所估计的萤光团之间的协方差而计算用于用于萤光团的表达的阈值。在这样的实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所估计的萤光团之间的协方差而计算关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度。
24.在一些实施例中，感兴趣的系统可以包括：一个或更多个分选决策模块，被配置为基于粒子的分类而生成用于粒子的分选决策。在实施例中，系统还包括：细胞分选器(例如具有液滴偏转器)，用于基于由所述分选决策模块生成的分选决策而从液流分选粒子(例如细胞)。
25.本公开的方面还包括用于基于标识的顺序而对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选的非暂时性计算机可读存储介质。根据特定实施例的非暂时性计算机可读存储介质包括存储在其上的指令，所述指令具有：用于基于从所检测的来自所述样本的细胞的光生成的一个或更多个数据信号而标识细胞表型的算法；以及用于指示细胞分选器基于标识的顺序而将具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到分区中的算法。所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后指示所述细胞分选器停止分选所述表型的集合中的所述第一表型的算法。所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于指示所述细胞分选器将预定数量的细胞动态地分选到分区中的算法。所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于在将预定数量的细胞分选到第一孔之后指示支撑台将多孔板移动到第二孔的算法。在这些实施例中，所述预定数量可以是1。
26.在一些实施例中，所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于记录分选到分区中的细胞的表型的算法。在这样的实施例中，所述计算机可读存储介质可以包括用于通过将已分选的细胞的表型的表示添加到例如表型的列表、概率数据结构、关联数组或真值表而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。在这些实施例中，所述计算机可读存储介质可以包括用于在适用时查询所述表型的列表、所述概率数据结构、所述关联数组或所述真值表以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在一些情况下，所述概率数据结构是布隆过滤器。在一些情况下，所述关联数组是内容可寻址的存储器。
27.在一些实施例中，所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于记录标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息的算法。在这些实施例中，所述非暂时性计算机可读存储介质可以包括用于维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表的算法。
28.在一些实施例中，所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于指示所述细胞分选器进行以下操作的算法：基于标识的顺序而将所述样本中的表现包括一个或更多个表型的第一表型集合的细胞动态地分选到第一分区中；以及将所述样本中的不表现所述第
一表型集合的细胞动态地分选到第二分区中。在这些实例中，所述非暂时性计算机可读存储介质可以包括用于基于所述样本中已分选的细胞动态地更新所述第一表型集合以使得分选到所述第一分区中的细胞和分选到所述第二分区中的细胞包括基本上相同的细胞数量的算法。在一些实施例中，所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于不分选表现不确定表型的细胞的算法。
29.在一些实施例中，所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算针对单个数据信号测量的荧光溢出量的估计值的算法。在这些实施例中，所述计算机可读存储介质还可以包括用于基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算两个萤光团之间的协方差的估计值的算法。在这些实施例中，所述计算机可读存储介质还可以包括用于基于所估计的萤光团之间的协方差而计算用于萤光团的表达的阈值的算法。在这些实施例中，所述计算机可读存储介质还可以包括用于基于所估计的萤光团之间的协方差而计算关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度的算法。
附图说明
30.当结合附图阅读时，根据以下详细描述可以最好地理解本发明。附图中包括以下各图：
31.图1描绘了用于根据特定实施例的分选控制系统的一个示例的功能框图。
32.图2a描绘了根据特定实施例的粒子分选器系统的示意图。
33.图2b描绘了根据特定实施例的粒子分选器系统的示意图。
34.图3描绘了根据特定实施例的用于基于计算的样本分析和粒子表征的粒子分析系统的功能框图。
35.图4描绘了根据特定实施例的流式细胞仪。
36.图5描绘了根据本公开的特定实施例的由对样本进行分选而产生的分区。
37.图6描绘了包括不确定表型分类的表型标识分类的示图。
38.图7描绘了根据本公开的特定实施例的用于对样本进行分选的流程图。
39.图8描绘了根据特定实施例的计算系统的框图。
具体实施方式
40.本公开的方面包括用于基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选的方法。根据特定实施例的方法包括：将所述样本引入流式细胞仪；使引入的所述样本在液流中流动；用光源照射所述液流中的所述样本；检测来自在所述液流中流动的所述样本中的细胞的光；基于从检测的光生成的一个或更多个数据信号而标识在所述液流中流动的所述样本中的细胞的表型；以及基于标识的顺序将所述样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到分区中。还提供了用于实践主题方法的系统。还描述了非暂时性计算机可读存储介质。
41.在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施例，因此当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由随附权利要求所限定。
42.在提供值的范围的情况，应理解，除非上下文另外清楚地指定，否则该范围的上限值与下限值之间的精确到下限值的单位的十分之一的每个中间值，以及所说明的范围中的任何其他所说明的值或中间值被包括在本发明之中。较小范围的上限值和下限值可以被独立地包括在这些较小的范围中并且也被包括在本发明之中，受到从所说明的范围中明确排除任意限值的制约。在所说明的范围包括限值中的一个或两个的情况，排除那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本发明中。
43.特定范围在本文中以由术语“约”后的数值形式呈现。术语“约”在本文中用于提供对“约”后的准确数字，以及接近或近似该术语后的数字的数字的文字支持。在确定数字是否接近或近似明确列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现其的上下文中与明确列举的数字实质上等同的数字。
44.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的任意方法和材料也可以在本发明的实践或测试中使用，但是目前描述有代表性的说明性的方法和材料。
45.本说明书中引用的所有公开文本和专利通过引用并入本文，如同明确且单独地指示每个单独的公开文本或专利通过引用并入一样，并且将其通过引用并入本文以结合所引用的公开文本来公开和描述方法和/或材料。对任意公开文本的引用是针对其在本提交日之前的公开，并且不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于该公开文本。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要单独确认。
46.要注意，除非上下文另外清楚地指定，否则如本文和随附权利要求中所使用的单数形式的“一”、“一个”和“所述”包括复数引用。还要注意，权利要求可以撰写为排除任意可选要素。因此，这个说明旨在用作结合对权利要求要素的列举而使用诸如“仅”、“只”等的排他性术语、或者使用“否定性”限定的引用基础。
47.本领域技术人员在阅读本公开之后将清楚，本文描述和示出的单独的实施例中的每一个具有可以易于与其他几个实施例中的任意实施例的特征分离或组合的分立的组件和特征而不背离本发明的范围或精神。所列举的任意方法可以用所列举的事件的顺序或逻辑上可能的任意其他顺序执行。
48.尽管已经为了语法流畅及功能说明而描述了或将描述设备和方法，但是要明确理解，除非根据35 u.s.c.
§
112明确表述，否则权利要求不解释为必须通过构建“装置”或“步骤”限制的任意方式进行限制，而应符合由权利要求提供的根据等同权利要求的司法解释的定义的含义和等同含义的整个范围，并且在权利要求根据35 u.s.c.
§
112明确表述的情况下，应符合根据35 u.s.c.
§
112的全部法定的等同含义。
49.综上所述，本公开提供了用于基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选的方法。在本公开的实施例的进一步描述中，首先更详细地描述了用于以下的方法：限制所分选的具有特定表型的细胞的数量；限制分选到每个分区中的细胞的数量；记录已分选的细胞表型；使细胞偏转到两个孔中；以及对光谱溢出进行调整。接着，描述了用于实践主题方法的系统。还描述了非暂时性计算机可读存储介质。
50.用于基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选的方法
51.本公开的方面包括用于基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细
胞)的样本进行分选的方法。具体地，本公开包括用于基于标识的顺序而将样本中的具有预定表型的集合中的表型的粒子(例如细胞)动态地分选到分区中的方法。通过“基于标识的顺序动态地进行分选”来表示以感兴趣的粒子(例如细胞)在例如液流中出现的顺序来分选这些细胞。即，例如，随着并且当在分选期间在液流中标识出感兴趣的粒子时而对其进行分选。如本文更详细地描述的，根据特定实施例的主题方法提供了在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后从表型的集合中排除第一表型。在其他实施例中，根据特定实施例的主题方法提供了将预定数量的细胞分选到分区中。在一些实施例中，主题方法提供了记录分选到分区中的细胞的表型。根据主题方法的对粒子(例如细胞)进行分选导致了更高的分选效率，以使得在对样本进行分选时样本中更少的粒子被浪费(即丢弃粒子(例如细胞)以导致其未被分选)。在一些情况下，分选的效率可以提高，使得在使用主题系统和方法时可以采集和分选变化较大(more variation)的细胞表型。当被用作采用流式细胞术对样本进行分选的一部分时，主题方法可以提高粒子分选的产率。
52.在实践主题方法时，用光源照射具有粒子的样本以及用具有一个或更多个光电检测器的光检测系统检测来自样本的光。在一些实施例中，样本是生物样本。按照其常规含义，术语“生物样本”用于指代可以在某些情况下在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊脐带血、尿液、阴道液和精液中发现的所有的有机体、植物、真菌或动物组织的子集、细胞或组成部分。因此，“生物样本”指代原生有机体或其组织的子集两者，以及指代基于有机体或其组织的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管以及泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官。生物样本可以是任意类型的有机组织，包括健康组织和患病组织两者(例如癌变的、恶性的、坏死的等)。在特定实施例中，生物样本是液体样本，例如血液或其衍生物，例如血浆、眼泪、尿液、精液等，在一些实例中，样本是血液样本，包括所有的血液，例如基于静脉穿刺或指尖采血获得的血液(其中在测定前血液可以或可以不与任何试剂例如防腐剂、抗凝剂等混合)。
53.在特定实施例中，样本源是“哺乳动物”(mammal或mammalian)，其中这样的术语用于广义地描述哺乳动物纲中的有机体，包括食肉动物目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)以及灵长目(例如人类、黑猩猩和猴)。在一些实例中，受试者是人类。所述方法可以应用于从两种性别以及处于任意发育阶段(即新生儿、婴儿、少年、青年、成人)的人类受试者获得的样本，在特定实施例中，人类受试者是少年、青年或成人。虽然本发明可以应用于来自人类受试者的样本，但是应理解，所述方法还可以在来自其他动物受试者(即“非人类受试者”)的样本上进行，例如但不限于鸟、小鼠、大鼠、狗，猫、家畜和马。
54.在实施例中，用来自光源的光照射(例如流式细胞仪的液流中的)样本。在一些实施例中，光源是宽带光源，发射具有宽的波长范围的光，例如跨越50nm或更多、例如100nm或更多、例如150nm或更多、例如200nm或更多、例如250nm或更多、例如300nm或更多、例如350nm或更多、例如400nm或更多，以及包括跨越500nm或更多。例如，一个合适的宽带光源发射具有从200nm至1500nm的波长的光。合适的宽带光源的另一示例包括发射具有从400nm至1000nm的波长的光的光源。其中所述方法包括用宽带光源照射，感兴趣的宽带光源方案可以包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定光纤耦接宽带光源、具有连续谱的宽带led、超辐射发光二极管、半导体发光二极管、宽谱led白光源、多led集成白光源、其他宽带光源
等或其任意组合。
55.在其他实施例中，例如，方法包括用发射特定波长或窄波长范围的窄带光源照射，例如用发射类似于50nm或更小的范围的窄波长范围的光的光源，例如40nm或更小、例如30nm或更小、例如25nm或更小、例如20nm或更小、例如15nm或更小、例如10nm或更小、例如5nm或更小、例如2nm或更小，以及包括发射特定波长的光(即单色光)的光源。其中所述方法包括用窄带光源照射，感兴趣的窄带光源方案可以包括但不限于窄波长led、激光二极管或者耦接到一个或更多个带通滤光片、衍射光栅、单色仪的宽带光源或其任意组合。
56.在特定实施例中，方法包括用一个或更多个激光器照射样本。如上所述，激光器的类型和数量将根据样本以及希望采集的光而变化，并且可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、co2激光器、co激光器、氟化氩(arf)准分子激光器、氟化氪(krf)准分子激光器、氯化氙(xecl)准分子激光器或氟化氙(xef)准分子激光器或其组合。在其他实例中，所述方法包括用染料激光器(例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器)照射液流。在又一实例中，方法包括用金属蒸气激光器(例如氦镉(hecd)激光器、氦汞(hehg)激光器、氦硒(hese)激光器、氦银(heag)激光器、锶激光器、氖铜(necu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合)照射液流。在再一实例中，方法包括用固态激光器(例如，红宝石激光器、nd:yag激光器、ndcryag激光器、er:yag激光器、nd:ylf激光器、nd:yvo4激光器、nd:yca4o(bo3)3激光器、nd:ycob激光器、钛蓝宝石激光器、铥yag激光器、镱yag激光器、yb2o3激光器或掺杂铈的激光器及其组合)照射液流。
57.可以用上述光源中的一个或更多个照射样本，例如2个或更多个光源、例如3个或更多个光源、例如4个或更多个光源、例如5个或更多个光源，以及包括10个或更多个光源。光源可以包括光源类型的任意组合。例如，在一些实施例中，所述方法包括用激光器的阵列照射液流中的样本，例如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器和一个或更多个固态激光器的阵列。
58.可以用范围从200nm至1500nm的波长照射样本，例如从250nm至1250nm、例如从300nm至1000nm、例如从350nm至900nm，以及包括从400nm至800nm。例如，当光源是宽带光源时，可以用从200nm至900nm的波长照射样本。在其他实例中，当光源包括多个窄带光源时，可以用从200nm至900nm的范围中的特定波长照射样本。例如，光源可以是均独立地发射具有从200nm至900nm的波长范围的光的多个窄带led(1nm-25nm)。在其他实施例中，窄带光源包括一个或更多个激光器(例如激光器阵列)，并且用范围从200nm至700nm的特定波长照射样本，例如用具有上述气体激光器、准分子激光器、染料激光器、金属蒸气激光器和固态激光器的激光器阵列。
59.当使用多于一个光源时，可以用光源同时地或顺序地或以两者组合的方式照射样本。例如，可以用每个光源同时照射样本。在其他实施例中，用每个光源顺序地照射液流。当使用多于一个光源顺序地照射样本时，每个光源照射样本的时间可以分别是0.001微秒或更长，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如30微秒或更长，以及包括60微秒或更长。例如，方法可以包括用光源(例如激光器)照射样本范围从0.001微秒至100微秒的持续时间，例如从0.01微秒至75微秒、例如从0.1微秒至50微秒、例如从1微秒至25微秒，以及包括从5微秒至10微秒。在用两个或更多个光源顺序地照射样本的实施例中，由每个光源照射样本的持续时间可以相同或不
同。
60.每个光源的照射之间的时间段还可以根据需要而变化，时间段分别分开0.001微秒或更长的延迟，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如15微秒或更长、例如0微秒或更长，以及包括60微秒或更长。例如，每个光源的照射之间的时间段的范围可以从0.001微秒至60微秒，例如从0.01微秒至50微秒、例如从0.1微秒至35微秒、例如从1微秒至25微秒，以及包括从5微秒至10微秒。在特定实施例中，每个光源的照射之间的时间段是10微秒。在由多于两个(即3个或更多个)光源顺序地照射样本的实施例中，每个光源的照射之间的延迟可以相同或不同。
61.可以连续地或以非连续间隔照射样本。在一些实例中，方法包括用光源连续地照射样本中的样本。在其他实例中，用光源在非连续间隔中照射样本，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或以某个其他间隔进行照射。
62.根据光源，可以从以下变化的距离照射样本：例如0.01mm或更远、例如0.05mm或更远、例如0.1mm或更远、例如0.5mm或更远、例如1mm或更远、例如2.5mm或更远、例如5mm或更远、例如10mm或更远、例如15mm或更远、例如25mm或更远，以及包括50mm或更远。此外，照射的角度还可以从10
°
至90
°
的范围变化，例如从15
°
至85
°
、例如从20
°
至80
°
、例如从25
°
至75
°
以及包括从30
°
至60
°
的范围变化，例如为90
°
角。
63.在特定实施例中，方法包括用两个或更多个频移光束照射样本。可以使用具有激光器和用于将激光频移的声光装置的光束生成器组件。在这些实施例中，方法包括用激光器照射声光装置。根据输出激光束中产生的所需波长的光(例如在照射液流中的样本时使用)，激光器可以具有从200nm至1500nm变化的特定波长，例如从250nm至1250nm、例如从300nm至1000nm、例如从350nm至900nm以及包括从400nm至800nm。可以用一个或更多个激光器照射声光装置，例如2或更多激光器、例如3个或更多个激光器、例如4个或更多个激光器、例如5个或更多个激光器以及包括10个或更多个激光器。激光器可以包括各种类型的激光器的组合。例如，在一些实施例中，所述方法包括用激光器阵列照射声光装置，例如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器和一个或更多个固态激光器的阵列。
64.当使用多于一个激光器时，可以用激光器同时地或顺序地或以两者组合的方式照射声光装置。例如，可以用每个激光器同时照射声光装置。在其他实施例中，用每个激光器顺序地照射声光装置。当使用多于一个激光器顺序地照射声光装置时，每个激光器照射声光装置的时间可以分别是0.001微秒或更长，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如30微秒或更长以及包括60微秒或更长。例如，方法可以包括用激光器以范围从0.001微秒至100微秒的持续时间照射声光装置，例如从0.01微秒至75微秒、例如从0.1微秒至50微秒、例如从1微秒至25微秒以及包括从5微秒至10微秒。在用两个或更多个激光器顺序地照射声光装置的实施例中，由每个激光器照射声光装置的持续时间可以相同或不同。
65.每个激光器的照射之间的时间段还可以根据需要变化，分别分开0.001微秒或更长的延迟，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如15微秒或更长、例如30微秒或更长以及包括60微秒或更长。例如，每个光源的照射之间的时间段的范围可以从0.001微秒至60微秒，例如从0.01微秒至50
微秒、例如从0.1微秒至35微秒、例如从1微秒至25微秒以及包括从5微秒至10微秒。在特定实施例中，每个激光器的照射之间的时间段是10微秒。在由多于两个(即3个或更多个)激光器顺序地照射声光装置的实施例中，每个激光器的照射之间的延迟可以相同或不同。
66.可以连续地或以非连续间隔照射声光装置。在一些实例中，方法包括用激光器连续地照射声光装置。在其他实例中，用激光器在非连续间隔中照射声光装置，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或以某个其他间隔进行照射。
67.根据激光器，可以从以下变化的距离照射声光装置：例如0.01mm或更远、例如0.05mm或更远、例如0.1mm或更远、例如0.5mm或更远、例如1mm或更远、例如2.5mm或更远、例如5mm或更远、例如10mm或更远、例如15mm或更远、例如25mm或更远以及包括50mm或更远。此外，照射的角度还可以在从10
°
至90
°
的范围变化，例如从15
°
至85
°
、例如从20
°
至80
°
、例如从25
°
至75
°
以及包括从30
°
至60
°
的范围变化，例如为90
°
角。
68.在实施例中，方法包括对声光装置应用射频驱动信号以生成角偏移激光束。可以对声光装置应用两个或更多个射频驱动信号以生成具有所需数量的角偏移激光束的输出激光束，例如3个或更多个射频驱动信号、例如4个或更多个射频驱动信号、例如5个或更多个射频驱动信号、例如6个或更多个射频驱动信号、例如7个或更多个射频驱动信号、例如8个或更多个射频驱动信号、例如9个或更多个射频驱动信号、例如10个或更多个射频驱动信号、例如15个或更多个射频驱动信号、例如25个或更多个射频驱动信号、例如50个或更多个射频驱动信号以及包括100个或更多个射频驱动信号。
69.通过射频驱动信号产生的角偏移激光束均具有基于所应用的射频驱动信号的幅度的强度。在一些实施例中，方法包括应用具有足以产生具有所需强度的角偏移激光束的幅度的射频驱动信号。在一些实例中，每个所应用的射频驱动信号分别具有从约0.001v至约500v的幅度，例如从约0.005v至约400v、例如从约0.01v至约300v、例如从约0.05v至约200v、例如从约0.1v至约100v、例如从约0.5v至约75v、例如从约1v至50v、例如从约2v至40v、例如从3v至约30v以及包括从约5v至约25v。在一些实施例中，每个所应用的射频驱动信号具有从约0.001mhz至约500mhz的频率，例如从约0.005mhz至约400mhz、例如从约0.01mhz至约300mhz、例如从约0.05mhz至约200mhz、例如从约0.1mhz至约100mhz、例如从约0.5mhz至约90mhz、例如从约1mhz至约75mhz、例如从约2mhz至约70mhz、例如从约3mhz至约65mhz、例如从约4mhz至约60mhz以及包括从约5mhz至约50mhz。
70.在这些实施例中，输出激光束中的角偏移激光束在空间上分离。根据所应用的射频驱动信号和输出激光束的所需照射分布，角偏移激光束可以分隔0.001μm或更多，例如0.005μm或更多、例如0.01μm或更多、例如0.05μm或更多、例如0.1μm或更多、例如0.5μm或更多、例如1μm或更多、例如5μm或更多、例如10μm或更多、例如100μm或更多、例如500μm或更多、例如1000μm或更多以及包括5000μm或更多。在一些实施例中，角偏移激光束重叠，例如使相邻的角偏移激光束沿着输出激光束的水平轴重叠。相邻的角偏移激光束之间的重叠(例如光束点的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠，例如0.005μm或更多的重叠、例如0.01μm或更多的重叠、例如0.05μm或更多的重叠、例如0.1μm或更多的重叠、例如0.5μm或更多的重叠、例如1μm或更多的重叠、例如5μm或更多的重叠、例如10μm或更多的重叠以及包括100μm或更多的重叠。
71.在特定实例中，使用多个视频光束来照射液流并且使用射频标记发射(fire)通过荧光成像对液流中的细胞进行成像以生成频率编码图像，例如在diebold等，nature photonics(自然-光子学)，第7(10)卷，806-810(2013)中描述的那些内容；以及在美国专利号9,423,353、9,784,661和10,006,852以及美国专利公开号2017/0133857和2017/0350803中描述的那些内容，其公开内容通过引用并入本文。
72.如上所述，在实施例中，如下文更详细地描述的，将来自被照射的样本的光传输至光检测系统并且通过多个光电检测器进行测量。在一些实施例中，方法包括测量在一个波长范围(例如200nm-1000nm)上采集的光。例如，方法可以包括采集200nm-1000nm的范围的一个或更多个波长上的光的光谱。在又一些实施例中，方法包括测量在一个或更多个特定波长处采集的光。例如，所采集的光可以在以下中的一个或更多个处测量：450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任意组合。在特定实施例中，方法包括测量与萤光团的荧光峰波长对应的光的波长。在一些实施例中，方法包括测量在样本中的每个萤光团的整个荧光谱上采集的光。
73.可以连续地或以非连续间隔测量所采集的光。在一些实例中，方法包括连续地对光进行测量。在其他实例中，以非连续间隔对光进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或以某个其他间隔对光进行测量。
74.在主题方法期间，所采集的光的测量可以进行一次或多次，例如2次或更多次、例如3次或更多次、例如5次或更多次以及包括10次或更多次。在特定实施例中，光传播被测量2次或更多次，在特定实例中将数据进行平均。
75.可以在一个或更多个波长处对来自样本的光进行测量，例如在5个或更多个不同的波长处、例如在10个或更多个不同的波长处、例如在25个或更多个不同的波长处、例如在50个或更多个不同的波长处、例如在100个或更多个不同的波长处、例如在200个或更多个不同的波长处、例如在300个或更多个不同的波长处以及包括在400个或更多个不同的波长处对采集的光进行测量。
76.本公开的方法包括基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选。在实施例中，基于根据所检测的来自细胞的光生成的一个或更多个数据信号而标识在液流中流动的样本中的细胞的表型。生成的数据信号可以是模拟数据信号或数字数据信号。在一些实例中，当数据信号是模拟数据信号时，方法包括将模拟数据信号转换成数字数据信号(例如用模数转换器)。在一些实例中，标识细胞表型包括将细胞分配至细胞群簇。在其他实例中，标识细胞表型包括将根据细胞的检测光生成的一个或更多个数据信号绘制到散点图上。在特定实例中，标识样本中的细胞表型包括生成具有感兴趣区(roi)的二维位图(bitmap)并且确定是否应将粒子分配至该位图的roi。
77.在实施例中，基于标识的顺序而动态地分选样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞。在一些实例中，预定表型的集合可以包括一个或更多个不同且可区分的细胞表型，例如1个细胞表型、例如2个细胞表型、例如16个细胞表型、例如256个细胞表型或更多。例如，细胞表型的集合可以是32个不同的细胞表型的集合。在实施例中，在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后，可以从表型的集合中排除第一表型。在一些实例中，具有第一表
型的预定数量的细胞可以是一个或更多个。例如，所述预定数量的细胞可以是1或2或10或100或更多。
78.当“从表型的集合中排除第一表型”时，预定表型的集合不再包括第一表型，使得例如如果在排除第一表型之前表型的集合包括64个表型，那么在排除第一表型之后，表型的集合将包括63个表型。此外，在从表型的集合中排除第一表型之后，在继续对液流中的样本进行分选时，因为从表型的集合中排除了第一表型，所以具有第一表型的细胞将不再具有表型的集合中包括的表型，因此具有第一表型的细胞将不再被分选到分区中。
79.通过“基于标识的顺序进行分选”表示，例如以这些细胞例如在液流中出现的顺序来对细胞进行分选。换言之，在分选期间，随着并且当细胞出现在例如液流中时才可以对其进行分选。即在一些实施例中，当对液流中的细胞的表型进行标识时，可以将该细胞表型与包括在表型的集合的每个表型进行比较，并且当确认表型的集合中包括该细胞表型时将其分选到分区中。在一些情况下，基于标识的顺序动态地进行分选的结果是，标识和分选细胞表型的顺序在开始对样本进行分选以前还未确定，而是代之以“动态地”或与分选同时确定。在一些情况下，基于标识的顺序来标识和分选细胞的顺序可以在一个样本与另一样本之间变化。
80.相反，根据本公开，例如当不基于标识的顺序而动态地分选细胞时，可以将其分选到在开始分选之前预定的哪个细胞表型将被分选到哪个分区中的多个分区中。例如，根据本公开，当不基于标识的顺序而动态地分选细胞时，具有被标识为属于要分选的细胞表型的集合的表型但是却不具有被分配至下一个分区的表型的细胞可以被丢弃而无需分选。根据本公开，当基于标识的顺序而动态地分选细胞时，将为这样的细胞表型动态地分配下一个分区，因此将对已标识的细胞进行分选。因此，将不会浪费已标识的细胞。
81.图5描绘了两个示例分选方法，作为本公开的方法的特定实施例的一个示例501基于标识的顺序而动态地进行分选，而另一示例502不基于标识的顺序而动态地进行分选。
82.根据不基于标识的顺序而动态地进行分选的方法将细胞分选到其中的多孔板510包括通过其行“a”或“b”以及其列“1”、“2”、“3”或“4”标识的八个孔。为每个孔分配包括“+”和
“‑”
的组合的三个字符的字符串。字符串中的每个位置指示细胞表型的构成特性，其中“+”或
“‑”
分别指示存在或不存在细胞表型的这种特性。在开始分选以前为多孔板510的每个孔分配与孔对应的细胞表型。即当实践这种方法时，在开始细胞分选以前进行以下两者：(i)确定细胞表型的集合以及(ii)针对每个孔分配每个表型。在图5中强调在分选以前的这种分配出于按照顺序进行说明的目的，该顺序对应于孔中的细胞表型在每行中从左至右以二进制方式进行计数。当在例如孔a1处开始细胞分选时，对液流中的细胞进行标识并且丢弃，直到细胞的液流中出现被标识为表现对应于为孔a1分配的细胞表型
“‑‑‑”
的表型的第一个实例为止。在分选表现对应于
“‑‑‑”
的表型的预定数量的细胞之后，对液流中的细胞进行标识并且丢弃，直到细胞的液流中出现被标识为表现对应于为孔a2分配的细胞表型
“‑‑
+”的表型的第一个实例为止。分选过程如此继续。
83.根据本公开的实施例的根据基于标识的顺序而动态地进行分选的方法将细胞分选到其中的多孔板520也包括通过其行“a”或“b”以及其列“1”、“2”、“3”或“4”标识的八个孔。在细胞分选(即动态地分选细胞)期间，为每个孔分配被标记为对应于每个孔的细胞表型。即代替预先分配这些表型，在分选正在进行的同时，基于在液流中标识属于预定表型的
集合的细胞的顺序来为多孔板520的每个孔动态地分配细胞表型。当实践这种方法时，在开始细胞分选以前，仅必须进行细胞表型的集合的确定，而不预先为每个孔分配细胞表型。在该示例中，如果分选在孔a1处开始，那么液流中的被标识为属于预定表型的集合的第一个细胞具有
“‑
++”的表型。多孔板520的孔上分布的细胞表型的明显随机的顺序说明在分选期间在液流中标识细胞的不可预测的顺序。
84.在一些实施例中，将预定数量的细胞分选到分区中。例如，预定数量可以是一个或更多个。例如，可以将单个细胞分选到分区中或者可以将2个细胞或10个细胞或100个细胞或更多分选到分区中。在一些情况下，分区包括孔。孔可以是具有容纳粒子(例如细胞)的容量的任意尺寸。例如，孔体积可以是0.001ml或更大，例如0.005ml或0.015ml或0.1ml或2ml或5ml或更大。在一些实施例中，孔可以是多孔板的孔。多孔板可以包括任意数量的孔。在实例中，多孔板可以包括6个或12个或24个或48个或96个或384个或1536个或3456个或9600个或更多个孔。多孔板的孔可以以任意合适的图案布置。在一些实例中，孔以具有近似2比3的长宽比的矩形形状布置。在一些实例中，本公开的多孔板可以符合已接受的标准，例如由分子生物科学学会制定的标准和ansi标准。多孔板可以包括任意合适的材料。在一些情况下，多孔板可以包括聚丙烯、聚苯乙烯或聚碳酸脂。在一些实施例中，在将预定数量的细胞分选到第一孔中之后，将多孔板向前移动到第二孔。
85.特定实施例还包括记录分选到分区中的细胞的表型。在一些情况下，通过在分选细胞具有细胞表型时存储该表型的表示而记录细胞表型的表示。例如，一些实施例可以通过将已分选的细胞的表型添加到表型的列表而记录分选到分区中的细胞的表型。通过表型的表示来表示能够区分该细胞表型与能够被标识的其他细胞表型的细胞表型的任意实际摘要。例如，细胞表型的表示可以包括比特串，其中比特串中的每个位置对应于细胞表型的各个构成特性。这样的比特串的比特将指示细胞表型的构成特性是否存在。例如，比特位置可以在细胞表型的对应特性存在时设置为“1”并且在其不存在时设置为“0”。
86.已分选的细胞表型的列表可以采用任意合适的形式。例如，列表可以包括比特串的数组，其中每个比特串对应于已分选的细胞的表型的表示。数组可以是任意合适的尺寸并且可以变化。例如，在一些实例中，数组的尺寸可以对应于表型的集合中的表型的数量乘以要分选的具有每种表型的细胞的预定数量。在一些情况下，数组的尺寸可以随着分选进行而增大。在其他实例中，列表可以包括链表，其中链表的每个元素包括已分选的细胞的表型的表示以及到链表中的下一条目(如果存在)的链接。
87.在一些实施例中，该方法还可以包括查询表型的列表以确定是否已经分选第一细胞，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。通过查询表型的列表来表示搜索列表以确定列表是否包含已标识的表型。在一些情况下，列表包括这样的表型暗示具有这样的表型的第一细胞已经被分选。已分选的表型的列表可以以任意合适的方式查询。例如，可以以从第一条目至最终条目的顺序遍历列表，将每个已分选的细胞表型与新标识的细胞表型比较。
88.本公开的方法的一些实施例可以通过将已分选的细胞的表型的表示添加到概率数据结构而记录分选到分区中的细胞的表型。通过概率数据结构来表示例如数据结构，在一些情况下，该数据结构仅能够返回该数据结构的关于性质(例如含量)的概率和不确定信息。例如，响应于查询元素是否是由概率数据结构表示的集合的成员，概率数据结构可能够
仅指示元素可能被包含在集合中或肯定不在集合中。在一些实施例中，概率数据结构可以是布隆过滤器。布隆过滤器可以是任意合适的尺寸，并且在一些情况下，布隆过滤器的尺寸可以部分地基于尺寸和准确性约束而确定。在一些实施例中，可以基于样本的分析而选择用于布隆过滤器的哈希函数，以减少布隆过滤器中的冲突。通过布隆过滤器中的冲突来表示将不同的细胞表型映射至布隆过滤器中的同一条目或多个条目。这样的情况可以潜在地导致来自布隆过滤器的不正确的结果(例如假阳性)。通过基于样本的分析选择哈希函数来表示选择哈希函数以减小或最小化将不同的细胞表型映射到布隆过滤器的同一条目或多个条目的可能性。
89.在一些实施例中，该方法还可以包括查询概率数据结构以确定是否已经分选第一细胞，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。通过查询概率数据结构来表示访问数据结构以确定其是否包含已标识的表型。例如，在布隆过滤器的情况下，例如通过对其进行哈希操作而使用已标识的表型的表示，以访问布隆过滤器的内容以确定这样的表型是否已经被分选。在一些实例中，概率数据结构可能仅能够指示该表型是否有可能已经被分选。在一些情况下，指示其包括这样的表型的概率数据结构暗示具有这样的表型的第一细胞已经被分选。
90.本公开的方法的一些实施例可以通过将已分选的细胞的表型的表示添加到关联数组而记录分选到分区中的细胞的表型。通过关联数组来表示包括键值对的集合的数据结构。在一些实例中，关联数组可以包括例如哈希表或搜索树(例如二叉搜索树)或数组。在一些实施例中，关联数组是内容可寻址的存储器。通过内容可寻址的存储器来表示一种硬件技术(例如半导体实现)，其能够将输入的搜索项与内容可寻址的存储器的内容进行比较并且返回搜索项是否被存储在内容可寻址的存储器中的确认。
91.在一些实施例中，该方法还可以包括查询关联数组以确定是否已经分选第一细胞，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。通过查询关联数组来表示通过在关联数组中查找已标识的表型来访问关联数组以确定其是否包含已标识的表型。例如，当关联数组包括搜索树时，可以搜索该搜索树以确定其是否包括已标识的表型。在一些情况下，指示其包括这样的表型的关联数组暗示具有这样的表型的第一细胞已经被分选。
92.本公开的方法的一些实施例可以通过在真值表中与细胞表型对应的位置处设置值而记录分选到分区中的细胞的表型。通过真值表来表示类似数组的结构或者通过细胞表型的表示访问并且具有对应于表的每一行的布尔值的表。例如，当细胞表型被表示为二进制比特串时，这样的比特串可以用于访问真值表中的行。在访问真值表的包含对应于该真值表的该行的布尔值(例如真或假)的行时，返回与该行相关联的布尔值。在一些实例中，在真值表的行处的“真”值可以被定义为表示用于访问该行的细胞表型已经被分选，以及“假”值表示其还未被分选。在一些实例中，在分选具有特定表型的细胞时，可以将真值表中对应的条目设置为“真”以指示具有这样的表型的细胞已经被分选。
93.在一些实施例中，该方法还可以包括查询真值表以确定是否已经分选第一细胞，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。通过查询真值表来表示例如使用细胞表型的表示(例如二进制字符串)来访问真值表中对应的行，以确定真值表中与该行相关联的值是否指示已标识的表型已经被分选。在一些情况下，指示该表型已经被分选的真值表暗示具有这样的表型的第一细胞已经被分选。
94.在一些实施例中，本公开的方法还包括记录标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息。例如，在一些实例中，所述方法可以包括维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表。在实例中，细胞表型可以形成以下形式的摘要：与能够被标识的其他可能的细胞表型的表示不同且可区分的表示，以及类似地，细胞表型被分选到的分区可以形成以下形式的摘要：与细胞被分选到其中的其他分区不同且可区分的表示。例如，在一些情况下，细胞表型可以以比特串的形式表示，其中比特串的每个比特位置表示存在或不存在细胞表型的可测量的特征(即构成特性)，以使得细胞表型的可测量的特征(即构成特性)的集合在一起能够表示可区分的细胞表型。类似地，标识分区的信息可以是分区的位置的摘要。例如，在实例中，当分区包括多孔板的孔时，标识分区的信息可以包括例如孔在多孔板上的位置(例如横坐标和纵坐标)，以及在一些情况下，包括标识若干个多孔板中的一个多孔板的信息。通过维护细胞表型和对应的分区的列表来表示细胞表型的表示和对应的分区标识信息的表示可以被存储在例如数据结构(例如数组、链表或二叉搜索树)中。在以数组的形式维护细胞表型和对应的分区的列表的实例中，每个数组条目可以包括细胞表型和分区的表示。在以链表的形式维护细胞表型和对应的分区的列表的实例中，每个链表节点可以包括细胞表型和分区的表示。在以二叉搜索树的形式维护细胞表型和对应的分区的列表的实例中，每个树节点可以包括细胞表型和分区的表示。
95.在一些实施例中，本公开的方法还包括基于样本中的细胞的子集估计由样本中的细胞表现出的表型的数量。通过样本中的细胞的子集来表示包含用于产生这样的估计可能所需要的细胞的任意合适的样本量。在一些情况下，将尽可能少的样本量用于估计样本中的细胞的表型的数量。通过由样本中的细胞表现出的表型的数量来表示能够标识的样本中存在的不同且有明显变化的细胞表型的数量。在一些实例中，可能有益的是，预先估计由包括样本的细胞表现出的不同细胞表型的数量，以便更高效地对样本进行分选或者确保足够数量的分区可用于存储已分选的细胞或者更高效地记录已分选的细胞表型。
96.可以使用包括例如概率计数算法的任意合适的基数估计算法而估计由样本中的细胞表现出的表型的数量。在一些实施例中，flajolet-martin算法可以用于基于样本中的细胞的子集而估计样本中的不同表型的数量。在其他实施例中，例如可以使用flajolet-martin算法的优化形式，例如hyperloglog或hyperloglog++算法。在一些实例中，可以在聚合从应用一个或更多个基数估计算法所计算的多个结果的基础上计算样本中的不同表型的数量的估计。在这样的情况下，样本中的不同表型的数量的估计可以是例如通过一个或更多个基数估计算法而计算的多个估计结果的平均值。
97.在本发明的一些实施例中，分选细胞包括使细胞偏转到第一分区和第二分区中。通过使细胞偏转来表示例如借助于如本文所述的细胞分选器的静电偏转器而将已分选的细胞指引到第一分区或第二分区之一。在这些方法中，在一些情况下，样本中的细胞可以分成表现包括预定数量的表型的第一表型集合的第一组以及不表现第一表型集合的第二组。此外，这些方法还可以包括基于标识的顺序将第一组分选到第一分区或第二分区之一。在这样的实例中，根据这样的方法对样本进行分选产生了包括表现属于第一表型集合的表型的细胞的第一分区或第二分区之一、以及包括表现不属于第一表型集合的表型的细胞的相对的另一分区。在实例中，第一表型集合可以包括一个或更多个可标识的细胞表型，例如单个细胞表型或2个细胞表型或10个细胞表型或100个细胞表型或更多。通过基于标识的顺序
进行分选来表示根据属于第一组或第二组的细胞在液流中出现的顺序、被分选到第一分区中的细胞可以是细胞表型的第一组或第二组之一的成员。在特定实例中，确定用于将细胞分成第一组和第二组的第一表型集合，以使得第一组和第二组包括基本上相同的细胞数量。通过包括基本上相同的细胞数量来表示当完成分选时第一分区和第二分区两者包含基本上相同的细胞数量，以使得样本中要被分选的细胞在第一分区和第二分区之间基本上相等的分配。在一些实例中，该方法还包括基于样本中已分选的细胞动态地更新第一表型集合，以使得第一组和第二组包括基本上相同的细胞数量。例如，如果在开始分选之后确定将属于第一表型集合的细胞分选到其中的第一分区正在累积实质上多于或少于第二分区的细胞，那么包括第一表型集合的表型可以被调整，以解决第一分区和第二分区中各自不同的细胞数量的问题。
98.在一些实例中，一次分选至单个孔的板不如通过获得两个不同的偏转并且随后分选至成对的孔(例如分选至标记为a1和a2的孔然后分选至孔a3和a4)而一次分选至两个孔高效。在这样的实施例中，可能有利的是，为了分选至两个孔，对偏转概率上进行平衡，以使得两个偏转很可能在类似的时间窗之内实现分选。在这样的实施例中，要被分选到孔中的表型可以被分到两个分区中，其中两个分区都具有被分选的构成表型之一的高的概率。例如，假设样本可以包括具有红
–
30％、蓝
–
25％、绿
–
20％、黄
–
15％和紫
–
10％的分选比。在这样的假设样本中，红加绿将包括50％，蓝加黄加紫将包括50％。在这个示例中，因为红和蓝最可能出现，所以其可以被分配至不同的分区。如果红和蓝被分选到最初的两个孔中，那么很可能接着的两个分区将是绿(20％)和黄加紫(25％)。可以应用对样本进行分区的其他方式。例如，在一些实例中，可以基于有限的决策资源对分区应用优化(例如分区可以基于细胞的某个性质的阳性或阴性而拆分)，其实现了有限资源(例如实现方式中有限的资源)的最佳使用。
99.在特定实施例中，分配分区可以用类似于结合哈夫曼编码使用的方法的方法来完成。在其他实施例中，分配分区可以使用其他方法(例如算术编码)完成。在其他实施例中，例如，可以应用另一些方法，例如考虑潜在的资源限制(例如硬件或软件限制)的方法。
100.在一些实施例中，对于要被分选到的每一对孔，已标识的第一表型被分选到第一孔中，在其之后，排除将该表型分选到第一孔，并且排除将该表型分选到第二孔和后续的孔中。在其他实施例中，可以通过基于出现的频率平衡分区来划分目标表型。
101.另一些实施例可以将分区分成多于两个孔。
102.在一个分区被分选到但是其他分区经历了相当长的时间并且还未被分选到的情况下，一些实施例可以在预定的超时时段之后暂时地暂停分选，移动板，以使得新孔可通过流偏转来访问，并且重新更新频率划分(frequency partitioning)。预定的超时时段可以设置为任意合适的时间量。在一些实例中，预定的超时时段可以基于观测的样本中的表型的频率以及为了分选这样的表型所需要的时间。例如，实施例可以如下进行：首先分选至孔a1，在其之后将分选至孔a2；如果a1经历了相当长的时间并且还未被分选到，则分选可以暂停并且移动板，以使得孔a2和a3作为目标孔，并且此时将在分选中排除被分选到孔a1中的表型。利用多个偏转的另一些实施例可以应用于以下场景：其中孔a1和a2作为当前孔；首先分选至a2，但是因为仍然要分选至孔a1所以分选过程不可以移动，然后可以实现分选至孔a3。
103.在实施例中，方法包括基于从来自检测的光生成的数据信号而确定的一个或更多个参数值来标识细胞表型。在一些实施例中，确定细胞的一个或更多个参数包括分辨来自样本中的多个萤光团的光，例如分辨所检测的来自萤光团的具有重叠的荧光的光。在一些实施例中，确定液流中的细胞的参数包括计算来自样本的荧光的谱的非混合矩阵。在一些实例中，细胞的特定参数值指示细胞是否具有表型的不确定状态。通过细胞是否具有表型的不确定状态来表示其既不可以决定也不可以排除细胞是否表现特定表型或特性。在一些实例中，与区分表现特定表型的细胞和不表现这样的表型的细胞相对应的参数值的分界是模糊的。在这样的实例中，特定参数值可以对应于已分选的细胞是否表现特定表型的不确定状态。这些方法还可以包括当细胞表现细胞是否具有表型的不确定状态时不分选细胞。通过不分选这样的细胞来表示细胞不被指引向分区并且代之以可以被丢弃，诸如例如被指引向细胞分选器的废物容器。
104.图6描绘了基于从所检测的来自样本的细胞的光生成的数据信号的至少两个参数值的图601，其中，例如一个参数的值可以绘制在横轴上并且另一参数的值可以绘制在纵轴上。在确定细胞是否表现表型的情况下，具体地，可以基于点在图上的位置而确定对应于细胞表型的方面的标记，其中该点对应于细胞的参数值。图601上接近区域610的区域对应于细胞中表达了标记以及细胞具有包括感兴趣的标记的表型(即细胞表型的构成特性存在)的肯定的确定。图601上的接近区域620的区域对应于细胞中未表达同一标记并且细胞具有不包括感兴趣的标记的表型(即细胞表型的构成特性不存在)的肯定的确定。图601上的接近区域630的区域对应于细胞中是否表达标记的不确定的确定，即不确定细胞表型的构成特性是否存在。
105.一些实施例还可以包括基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而估计针对单个数据信号测量的荧光溢出量。在一些实例中，这样的方法还可以包括基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而估计两个萤光团之间的协方差。这样的方法的一些实施例还包括基于所估计的萤光团之间的协方差定义用于萤光团的表达的阈值。这样的方法的一些实施例还包括基于所估计的萤光团之间的协方差而定义关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度。
106.在本公开的方法的一些实施例中，预定表型的集合包括具有一个或更多个细胞亚型的细胞类型。通过细胞类型来表示细胞的分类，用于在形态上或表型上区分物种中不同的细胞形式。在实例中，细胞类型可以是t细胞。在这样的方法中，细胞亚型可以包括例如cd4+t细胞或cd8+t细胞。
107.图7描绘了根据本公开的特定实施例的用于对样本进行分选的流程图。在步骤701，选择细胞表型的集合。即将一个或更多个细胞表型指定为属于预定的表型集合，表示如果样本中存在，则样本的具有属于预定的表型集合的表型的细胞将被分选。在步骤702，开始进行分选。当开始进行分选时，可以使样本在流式细胞仪的液流中流动。可以照射样本，并且可以检测来自在液流中流动的样本中的细胞的光。在步骤703，基于所检测的来自液流中的细胞的这些光而标识细胞的表型。在步骤704，确定已标识的细胞表型是否属于在步骤701中选择的预定的表型集合。在已标识的细胞表型属于预定的表型集合的情况下，过程进行到步骤705，并且将细胞分选到分区中。可选择地，如果已标识的细胞表型不属于预定的表型集合，则过程进行到步骤706，并且不将细胞分选到分区中；它被丢弃。
108.在一些实施例中，用于分选样本的成分的方法包括用例如于2017年3月28日提交的美国专利公开号2017/0299493中描述的具有偏转器板的粒子分选模块来分选粒子(例如生物样本中的细胞)，其公开内容通过引用并入本文。在特定实施例中，使用例如于2019年2月8日提交的美国临时专利申请号62/803,264中描述的具有多个分选决策单元的分选决策模块来分选样本的细胞，其公开内容通过引用并入本文。
109.用于基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选的系统
110.综上所述，本公开的方面包括一种系统，其被配置为基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选。具体地，本公开包括系统，其被配置为基于标识的顺序而将样本中的具有预定表型的集合中的表型的粒子(例如细胞)动态地分选到分区中。如上所述，短语“基于标识的顺序动态地进行分选”用于指代以细胞在例如液流中出现的顺序来分选感兴趣的粒子(例如细胞)。即，在分选期间，随着并且当细胞出现在例如液流中时而分选感兴趣的粒子(例如细胞)。根据特定实施例的系统包括：光源，被配置为照射在液流中流动的包括细胞的样本；光检测系统，具有光电检测器，所述光电检测器检测来自样本的细胞的光并且从检测的光生成多个数据信号；细胞分选器，被配置为接收在液流中流动的包括细胞的样本；多个分区，被配置为接收来自样本的通过细胞分选器分选的细胞；处理器，具有可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器：基于从检测的光生成的所述数据信号中的一个或更多个数据信号而标识所述样本中的细胞的表型，以及指示所述细胞分选器基于标识的顺序而将所述样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到所述分区中。
111.在实施例中，光源可以是任意合适的宽带或窄带光源。根据样本中的成分(例如细胞、小珠、非细胞粒子等)，光源可以被配置为发射范围从200nm至1500nm变化的波长的光，例如从250nm至1250nm、例如从300nm至1000nm、例如从350nm至900nm、以及包括从400nm至800nm。例如，光源可以包括发射具有从200nm至900nm的波长的光的宽带光源。在其他实例中，光源包括发射范围从200nm至900nm的波长的窄带光源。例如，光源可以是发射具有范围从200nm至900nm的波长的光的窄带led(1nm-25nm)。在特定实施例中，光源是激光器。在一些实例中，主题系统包括气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、co2激光器、co激光器、氟化氩(arf)准分子激光器、氟化氪(krf)准分子激光器、氯化氙(xecl)准分子激光器或氟化氙(xef)准分子激光器或其组合。在其他实例中，主题系统包括染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器。在又一些实例中，感兴趣的激光器包括金属蒸气激光器，例如氦镉(hecd)激光器、氦汞(hehg)激光器、氦硒(hese)激光器、氦银(heag)激光器、锶激光器、氖铜(necu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在再一些实例中，主题系统包括固态激光器，例如红宝石激光器、nd:yag激光器、ndcryag激光器、er:yag激光器、nd:ylf激光器、nd:yvo4激光器、nd:yca4o(bo3)3激光器、nd:ycob激光器、钛蓝宝石激光器、铥yag激光器、镱yag激光器、yb2o3激光器或掺杂铈的激光器及其组合。
112.在其他实施例中，光源是非激光光源，例如灯，包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、发光二极管(例如具有连续谱的宽带led、超辐射发光二极管、半导体发光二极管、宽谱led白光源、多led集成光源)。在一些实例中，非激光光源是稳定光纤耦接宽带光源、白光
源、其他光源等或其任意组合。
113.光源可以被设置在距样本(例如流式细胞仪中的液流)任意合适的距离，例如在距液流0.001mm或更远的距离，例如0.005mm或更远、例如0.01mm或更远、例如0.05mm或更远、例如0.1mm或更远、例如0.5mm或更远、例如1mm或更远、例如5mm或更远、例如10mm或更远、例如25mm或更远，以及包括在100mm或更远的距离。此外，光源可以(例如相对于液流的纵轴)在任意合适的角度下照射样本，例如在从10
°
至90
°
的范围的角度下，例如从15
°
至85
°
、例如从20
°
至80
°
、例如从25
°
至75
°
以及包括从30
°
至60
°
，例如为90
°
角。
114.光源可以被配置为连续地或以非连续间隔照射样本。在一些实例中，系统包括光源，其被配置为例如用流式细胞仪中的在探查点处连续地照射液流的连续波激光器连续地照射样本。在其他实例中，感兴趣的系统包括光源，其被配置为在非连续间隔照射样本，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或在某个其他间隔。当光源被配置为在非连续间隔照射样本时，系统可以包括一个或更多个附加组件，以用光源提供对样本的断续照射。例如，这些实施例中的主题系统可以包括一个或更多个激光束斩波器，其通过人工或通过计算机控制光束光阑以阻挡/使样本显露到光源。
115.在一些实施例中，光源是激光器。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、co2激光器、co激光器、氟化氩(arf)准分子激光器、氟化氪(krf)准分子激光器、氯化氙(xecl)准分子激光器或氟化氙(xef)准分子激光器或其组合；染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸气激光器，例如氦镉(hecd)激光器、氦汞(hehg)激光器、氦硒(hese)激光器、氦银(heag)激光器、锶激光器、氖铜(necu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合；固态激光器，例如红宝石激光器、nd:yag激光器、ndcryag激光器、er:yag激光器、nd:ylf激光器、nd:yvo4激光器、nd:yca4o(bo3)3激光器、nd:ycob激光器、钛蓝宝石激光器、铥yag激光器、镱yag激光器、yb2o3激光器或掺杂铈的激光器及其组合；半导体二极管激光器，光泵浦的半导体激光器(opsl)或上述激光器中的任意激光器的二倍频或三倍频实现。
116.在特定实施例中，光源是光束生成器，其被配置为生成两个或更多个频移光束。在一些实例中，光束生成器包括：激光器；射频生成器，被配置为对声光装置应用射频驱动信号，以生成两个或更多个角偏移激光束。在这些实施例中，激光器可以是例如上述脉冲激光器或连续波激光器。
117.声光装置可以被配置为使用所应用的声波使激光频移的任意合适的声光方案。在特定实施例中，声光装置是声光偏转器。主题系统中的声光装置被配置为从来自激光器的光和所应用的射频驱动信号生成角偏移激光束。可以用任意合适的射频驱动信号源将射频驱动信号应用于声光装置，例如直接数字合成器(dds)、任意波形生成器(awg)或电脉冲生成器。
118.在实施例中，控制器被配置为对声光装置应用射频驱动信号以在输出激光束中产生所需数量的角偏移激光束，例如被配置为应用3个或更多个射频驱动信号，例如4个或更多个射频驱动信号、例如5个或更多个射频驱动信号、例如6个或更多个射频驱动信号、例如7个或更多个射频驱动信号、例如8个或更多个射频驱动信号、例如9个或更多个射频驱动信
号、例如10个或更多个射频驱动信号、例如15个或更多个射频驱动信号、例如25个或更多个射频驱动信号、例如50个或更多个射频驱动信号以及包括被配置为应用100个或更多个射频驱动信号。
119.在一些实例中，为了在输出激光束中产生角偏移激光束的强度分布，控制器被配置为应用具有如下变化的幅度的射频驱动信号：例如从约0.001v至约500v、例如从约0.005v至约400v、例如从约0.01v至约300v、例如从约0.05v至约200v、例如从约0.1v至约100v、例如从约0.5v至约75v、例如从约1v至50v、例如从约2v至40v、例如从3v至约30v以及包括从约5v至约25v。在一些实施例中，每个所应用的射频驱动信号具有从约0.001mhz至约500mhz的频率，例如从约0.005mhz至约400mhz、例如从约0.01mhz至约300mhz、例如从约0.05mhz至约200mhz、例如从约0.1mhz至约100mhz、例如从约0.5mhz至约90mhz、例如从约1mhz至约75mhz、例如从约2mhz至约70mhz、例如从约3mhz至约65mhz、例如从约4mhz至约60mhz以及包括从约5mhz至约50mhz的频率。
120.在特定实施例中，控制器具有：处理器，具有可操作地耦接至处理器的存储器，以使得所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器产生包括具有所需的强度分布的角偏移激光束的输出激光束。例如，所述存储器可以包括用于以下的指令：产生具有相同强度的两个或更多个角偏移激光束，例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如10个或更多个、例如25个或更多个、例如50或更多个，以及包括可以包括用于以下的指令的存储器：产生具有相同强度的100个或更多个角偏移激光束。在其他实施例中，所述存储器可以包括用于以下的指令：产生具有不同强度的两个或更多个角偏移激光束，例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如10个或更多个、例如25个或更多个、例如50或更多个，以及包括可以包括用于以下的指令的存储器：产生具有不同强度的100个或更多个角偏移激光束。
121.在特定实施例中，控制器具有：处理器，具有可操作地耦接至处理器的存储器，以使得所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器产生具有从输出激光束的沿着水平轴的边缘向中心逐渐增大的强度的输出激光束。在这些实例中，在输出光束的沿着水平轴的中心处的角偏移激光束的强度可以处于在输出激光束的边缘处的角偏移激光束的强度的0.1％至约99％的范围，例如0.5％至约95％、例如1％至约90％、例如约2％至约85％、例如约3％至约80％、例如约4％至约75％、例如约5％至约70％、例如约6％至约65％、例如约7％至约60％、例如约8％至约55％以及包括在输出激光束的沿着水平轴的边缘处的角偏移激光束的强度约10％至约50％。在其他实施例中，控制器具有：处理器，具有可操作地耦接至所述处理器的存储器，以使得所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器产生具有从输出激光束的沿着水平轴的边缘向中心逐渐增大的强度的输出激光束。在这些实例中，在输出光束的沿着水平轴的边缘处的角偏移激光束的强度可以处于在输出激光束的中心处的角偏移激光束的强度的0.1％至约99％的范围，例如0.5％至约95％、例如1％至约90％、例如约2％至约85％、例如约3％至约80％、例如约4％至约75％、例如约5％至约70％、例如约6％至约65％、例如约7％至约60％、例如约8％至约55％以及包括在输出激光束的沿着水平轴的中心处的角偏移激光束的强度的约10％至约50％。在又一些实施例中，控制器具有：处理器，具有可操作地耦接至所述处理器的存储器，以使得所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指
令由所述处理器执行时，致使所述处理器产生具有沿着水平轴具有高斯分布的强度分布的输出激光束。在另一些实施例中，控制器具有：处理器，具有可操作地耦接至所述处理器的存储器，以使得所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器产生沿着水平轴具有礼帽强度分布的输出激光束。
122.在实施例中，感兴趣的光束生成器可以被配置为在输出激光束中产生空间上分离的角偏移激光束。根据所应用的射频驱动信号和输出激光束的所需照射分布，角偏移激光束可以分隔0.001μm或更多，例如0.005μm或更多、例如0.01μm或更多、例如0.05μm或更多、例如0.1μm或更多、例如0.5μm或更多、例如1μm或更多、例如5μm或更多、例如10μm或更多、例如100μm或更多、例如500μm或更多、例如1000μm或更多以及包括5000μm或更多。在一些实施例中，系统被配置为在输出激光束中(例如沿着输出激光束的水平轴与相邻的角偏移激光束)产生重叠的角偏移激光束。相邻的角偏移激光束之间的重叠(例如光束点的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠，例如0.005μm或更多的重叠、例如0.01μm或更多的重叠、例如0.05μm或更多的重叠、例如0.1μm或更多的重叠、例如0.5μm或更多的重叠、例如1μm或更多的重叠、例如5μm或更多的重叠、例如10μm或更多的重叠以及包括100μm或更多的重叠。
123.在特定实例中，被配置为生成两个或更多个频移光束的光束生成器包括美国专利号9,423,353、9,784,661和10,006,852以及美国专利公开号2017/0133857和2017/0350803中所描述的激光激发模块激光器，其公开内容通过引用并入本文。
124.在实施例中，系统包括具有一个或更多个光电检测器的光检测系统。感兴趣的光电检测器可以包括但不限于光传感器，例如有源像素传感器(aps)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(ccd)、增强电荷耦合器件(iccd)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻器、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他光电检测器等。在特定实施例中，用电荷耦合器件(ccd)、半导体电荷耦合器件(ccd)、有源像素传感器(aps)、互补金属氧化物半导体(cmos)图像传感器或n型金属氧化物半导体(nmos)图像传感器测量来自样本的光。
125.在一些实施例中，感兴趣的光检测系统包括多个光电检测器。在一些实例中，光检测系统包括多个固态检测器，例如光电二极管。在特定实例中，光检测系统包括光电检测器阵列，例如光电二极管的阵列。在这些实施例中，光电检测器阵列可以包括4个或更多个光电检测器，例如10个或更多个光电检测器、例如25个或更多个光电检测器、例如50个或更多个光电检测器、例如100个或更多个光电检测器、例如250个或更多个光电检测器、例如500个或更多个光电检测器、例如750个或更多个光电检测器以及包括1000个或更多个光电检测器。例如，检测器可以是具有4个或更多个光电二极管的光电二极管阵列，例如10个或更多个光电二极管、例如25个或更多个光电二极管、例如50个或更多个光电二极管、例如100个或更多个光电二极管、例如250个或更多个光电二极管、例如500个或更多个光电二极管、例如750个或更多个光电二极管以及包括1000个或更多个光电二极管。
126.光电检测器可以根据需要以任意几何构型布置，其中感兴趣的布置包括但不限于方形构型、矩形构型、梯形构型、三角形构型、六边形构型、七边形构型、八边形构型、九边形构型、十边形构型、十二边形构型、圆形构型、椭圆形构型以及不规则图案的构型。光电检测器阵列中的光电检测器可以相对于其他(以x-z平面中作为参考)以范围从10
°
至180
°
的角度定向，例如从15
°
至170
°
、例如从20
°
至160
°
、例如从25
°
至150
°
、例如从30
°
至120
°
以及包
括从45
°
至90
°
。光电检测器阵列可以是任意合适的形状，并且可以是：直线形状，例如方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如抛物线底部耦接至平坦顶部。在特定实施例中，光电检测器阵列具有矩形形状的有效表面。
127.阵列中的每个光电检测器(例如光电二极管)可以具有以下有效表面：具有范围从5μm至250μm的宽度，例如从10μm至225μm、例如从15μm至200μm、例如从20μm至175μm、例如从25μm至150μm、例如从30μm至125μm以及包括从50μm至100μm；以及具有范围从5μm至250μm的长度，例如从10μm至225μm、例如从15μm至200μm、例如从20μm至175μm、例如从25μm至150μm、例如从30μm至125μm以及包括从50μm至100μm，其中，阵列中的每个光电检测器(例如光电二极管)的表面面积的范围从25μm2至10000μm2，例如从50μm2至9000μm2、例如从75μm2至8000μm2、例如从100μm2至7000μm2、例如从150μm2至6000μm2以及包括从200μm2至5000μm2。
128.光电检测器阵列的尺寸可以根据光的量及强度、光电检测器的数量和所需的灵敏度而变化，并且可以具有范围从0.01mm至100mm的长度，例如从0.05mm至90mm、例如从0.1mm至80mm、例如从0.5mm至70mm、例如从1mm至60mm、例如从2mm至50mm、例如从3mm至40mm、例如从4mm至30mm以及包括从5mm至25mm。光电检测器阵列的宽度还可以在从0.01mm至100mm的范围变化，例如从0.05mm至90mm、例如从0.1mm至80mm、例如从0.5mm至70mm、例如从1mm至60mm、例如从2mm至50mm、例如从3mm至40mm、例如从4mm至30mm以及包括从5mm至25mm。因此，光电检测器阵列的有效表面的范围可以从0.1mm2至10000mm2，例如从0.5mm2至5000mm2、例如从1mm2至1000mm2、例如从5mm2至500mm2以及包括从10mm2至100mm2。
129.感兴趣的光电检测器被配置为在一个或更多个波长处对采集的光进行测量，例如在2个或更多个波长处、例如在5个或更多个不同的波长处、例如在10个或更多个不同的波长处、例如在25个或更多个不同的波长处、例如在50个或更多个不同的波长处、例如在100个或更多个不同的波长处、例如在200个或更多个不同的波长处、例如在300个或更多个不同的波长处，以及包括在400个或更多个不同的波长处对由液流中的样本发射的光进行测量。
130.在一些实施例中，光电检测器被配置为在一个波长范围(例如200nm-1000nm)上对采集的光进行测量。在特定实施例中，感兴趣的光电检测器被配置为采集在一个波长范围上的光的光谱。例如，系统可以包括一个或更多个检测器，其被配置为采集200nm-1000nm中的一个或更多个波长范围上的光的光谱。在又一些实施例中，感兴趣的检测器被配置为在一个或更多个特定波长处测量来自液流中的样本的光。例如，系统可以包括一个或更多个检测器，其被配置为在以下中的一个或更多个处对光进行测量：450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任意组合。在特定实施例中，光电检测器可以被配置为与特定萤光团(例如在荧光测定中与样本一起使用的那些)配对。在一些实施例中，光电检测器被配置为在样本中的每个萤光团的整个荧光谱上对采集的光进行测量。
131.光检测系统被配置为连续地或以非连续间隔测量光。在一些实例中，感兴趣的光电检测器被配置为连续地对采集的光进行测量。在其他实例中，光检测系统被配置为以非连续间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒，以及包括每1000毫秒或以某个其他间隔对光进行测量。
132.在实施例中，系统包括细胞分选器，细胞分选器被配置为接收在液流中流动的包
括细胞的样本。通过细胞分选器来表示如下所述的用于从液流分选粒子(例如细胞)的任意合适的模块。如下所述，术语“分选”按照其传统意义在本文中使用，以指代样本中的进行分离的成分(例如细胞、诸如生物大分子的非细胞粒子)、以及在一些实例中将被分离的成分传送至一个或更多个分区(例如样本采集容器)。
133.在实施例中，系统包括多个分区，其被配置为接收来自样本的通过细胞分选器分选的细胞。通过分区来表示任意合适的容器(例如样本采集容器)，其能够接收由细胞分选器分选的一个或更多个粒子(例如细胞)并且使分区的内容与不被分选到该分区中的其他物质保持分离和隔离。实施例包括多于1个分区，例如2个分区、4个分区、96个分区或1536个或更多个分区。分区可以是能够接收和使粒子(例如细胞)保持与液流的样本隔离的任意合适的尺寸。在一些情况下，将分区的尺寸确定为容纳多于一个细胞，例如10个细胞、100个细胞、1000个细胞、10000个细胞或更多。在一些实施例中，分区包括孔。在实例中，孔可以是小试管。孔可以是任意合适的形状。在一些实例中，孔的横截面的形状是圆形；在其他情况下，其为矩形或方形。根据需要，孔可以是具有用于根据需要容纳粒子(例如细胞)的足够容量的任意尺寸。例如，孔的体积可以是0.001ml或更大，例如0.005ml或0.015ml或0.1ml或2ml或5ml或更大。在一些实施例中，孔可以是多孔板的孔。多孔板可以包括任意数量的孔。在实例中，多孔板可以包括6个或12个或24个或48个或96个或384个或1536个或3456个或9600个或更多个孔。多孔板的孔可以以任意合适的图案布置。在一些实例中，孔以具有近似2比3的长宽比的矩形形状布置。在一些实例中，本公开的多孔板可以符合已接受的标准，例如由分子生物科学学会制定的标准和ansi标准。多孔板可以包括任意合适的材料。在一些情况下，多孔板可以包括聚丙烯、聚苯乙烯或聚碳酸脂。在这些实施例中，在将预定数量的细胞分选到第一孔中之后，多孔板可以向前移动到第二孔。所述预定数量的细胞可以是1个细胞、2个细胞、10个细胞或100个细胞或更多。
134.本公开的系统被配置为采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选。在实施例中，系统被配置为基于从检测的光生成的一个或更多个数据信号而标识样本中的细胞的表型。光检测系统被配置为从来自样本中的粒子(例如细胞)检测的光而生成多个数据信号。生成的数据信号可以是模拟数据信号或数字数据信号。当数据信号是模拟数据信号时，在一些实例中，系统还包括模数转换器，其被配置为将模拟数据信号转换为数字数据信号。感兴趣的系统包括处理器，其具有可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于从检测的光生成的所述数据信号中的一个或更多个数据信号而标识样本中的细胞的表型。在一些实例中，标识细胞表型包括将细胞分配至细胞群簇。在其他实例中，标识细胞表型包括将从细胞的检测光生成的一个或更多个数据信号绘制到散点图上。在特定实例中，标识样本中的细胞表型包括生成具有感兴趣区(roi)的二维位图并且确定是否应将粒子分配至位图的roi。在本公开的系统中，所述存储器还包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器：指示所述细胞分选器基于标识的顺序而将所述样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到所述分区中。如上所述，通过“基于标识的顺序进行分选”来表示例如以这样的细胞在液流中出现的顺序来分选细胞。在一些实施例中，通过对具有属于预定的表型集合的表型的细胞进行分选来表示，例如存储在存储器上的指令在由处理器执行时，致使所述处理器将已标识的细胞表型与预定的细胞表型的集合的一
个或更多个预定的细胞表型进行比较，生成指示已标识的细胞表型是否与属于预定的表型集合的一个或更多个表型相同的真或假的结果。通过“指示细胞分选器”来表示处理器导致细胞分选器分选已经标识了其表型的细胞。所述处理器可以通过任意合适的方式指示细胞分选器，例如，在一些实施例中，通过经由所述处理器和所述细胞分选器之间的可操作连接而传输编码分选指令的电信号。这样的可操作连接可以是有线或无线连接。
135.在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后，停止分选所述表型的集合中的所述第一表型。通过停止具有第一表型的分选细胞来表示，在由所述处理器执行这样的指令之后，在一些实施例中，当细胞被标识为具有第一表型时，所述处理器指示所述细胞分选器不分选这样的细胞。在一些实例中，指示所述细胞分选器不分选细胞可以通过省略发出肯定分选指令而完成。在一些实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器将预定数量的细胞动态地分选到分区中。在一些实例中，所述预定数量的细胞可以是1个细胞、2个细胞、10个细胞、100个细胞或更多。例如，所述预定数量的细胞可以是1。
136.在一些实施例中，所述系统还包括被配置为移动多孔板的可平移的支撑台，并且所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器在将预定数量的细胞分选到第一孔中之后指示所述支撑台将所述多孔板移动到第二孔。通过可平移的支撑台来表示能够接收多孔板的任意合适的平台。可以使用任意合适的移位协议以使支撑台平移，例如用(例如使用步进电机、伺服电机、无刷电机、有刷dc电机、微步驱动电机、高分辨率步进电机、其他类型的电机等的那些)电机致动的平移平台、导杆平移组件、啮合平移装置来移动支撑台。
137.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器存储分选到分区中的细胞的表型。通过存储已分选的细胞的表型来表示将采用任意合适的数据格式的细胞表型的摘要表示添加到所述存储器，所述存储器在一些情况下可以是专用硬件存储器。在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过将已分选的细胞的表型的表示添加到表型的列表而存储分选到分区中的细胞的表型。在一些情况下，通过表型的列表来表示例如存储器中分配的能够接收细胞表型的摘要表示的数组。在其他情况下，其表示存储器中的能够接收细胞表型的摘要表示的链表数据结构。在一些实例中，链表可以进行排序。在其他情况下，其表示存储器中分配的能够接收细胞表型的摘要表示的二叉树数据结构。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询表型的列表以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。可以使用任意合适的搜索和比较例程或算法以确定表型的列表中是否已经表示了细胞表型且因此确定其已经被分选。
138.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过将已分选的细胞的表型的表示添加到概率数据结构而存储分选到分区中的细胞的表型。如上所述，概率数据结构是以下数据结构：其在一些情况下可能能够仅返回关于数据结构的性质(例如数据结构是否包括查询项(例如细胞表型的表示))的概
率和不确定信息。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询概率数据结构以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在一些情况下，通过查询概率数据结构，概率数据结构可能能够仅指示概率结果，例如细胞表型很可能但是不确定已被分选。在一些情况下，如上所述，所述概率数据结构是布隆过滤器。
139.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，如上所述，致使所述处理器通过将已分选的细胞的表型的表示添加到关联数组而存储分选到分区中的细胞的表型。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询关联数组以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在一些情况下，所述关联数组是内容可寻址的存储器。可以使用任意合适的硬件或软件搜索和比较例程和算法以查询关联数组以确定是否已经分选第一细胞。
140.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过在真值表中与细胞表型对应的位置处设置值而存储分选到分区中的细胞的表型。在实例中，所述真值表可以包括专用硬件模块。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询所述真值表以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。所述真值表的内容可以是布尔值，均由一个或更多个比特来表示。
141.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器存储标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息。如上所述，可以使用分区的位置的任意合适的摘要标识(例如在一些情况下，多孔板中的孔的横坐标和纵坐标)来标识分区。在实例中，细胞表型可以被表示为比特串，其中该比特串的每个比特对应于存在或不存在细胞表型的构成特性。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表。所述列表可以采用任意合适的形式(例如数组、链表或二叉搜索树)。分区和细胞的表型的表示可以采用例如比特串的形式，并且可以被存储在存储器(包括专用存储器模块)中。
142.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器：基于标识的顺序而将样本中的表现包括一个或更多个表型的第一表型集合的细胞动态地分选到第一分区中；以及将样本中的不表现所述第一表型集合的细胞动态地分选到第二分区中。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于样本中已分选的细胞而动态地更新第一表型集合，以使得分选到第一分区中的细胞和分选到第二分区中的细胞包括基本上相同的细胞数量。
143.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器从生成的数据信号而确定液流中的粒子的一个或更多个参数。在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器不分选表现不确定表型的细胞。在一些实例中，通过不分选细胞来表示所述处理器省略将分选指令发送到所述细胞分选器。如上所述，通过不确定的表型来表示可以既不确定地
决定也不排除细胞中存在表型(其中的特定表型)或(在一些情况下)细胞表型的构成特性。
144.在实施例中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算针对单个数据信号测量的荧光溢出量的估计值。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算两个萤光团之间的协方差的估计值。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所估计的萤光团之间的协方差而计算用于萤光团的表达的阈值。在这些实施例中，所述存储器可以包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所估计的萤光团之间的协方差而计算关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度。
145.在一些实施例中，感兴趣的系统可以包括一个或更多个分选决策模块，其被配置为基于对细胞的表型进行标识以及确定细胞表型是否属于预定表型的集合而生成用于粒子(例如细胞)的分选决策。如上所述，系统还包括粒子分选器，其为细胞分选器(例如具有液滴偏转器)，用于基于由所述分选决策模块生成的分选决策而从液流分选粒子(例如细胞)。如上所述，术语“分选”按照其传统意义在本文中使用，以指代样本中的进行分离的成分(例如细胞、诸如生物大分子的非细胞粒子)、以及在一些实例中将被分离的成分传送至一个或更多个分区(例如样本采集容器)。例如，主题系统可以被配置为对具有2个或更多个成分的样本进行分选，例如3个或更多个成分、例如4个或更多个成分、例如5个或更多个成分、例如10个或更多个成分、例如15个或更多个成分，以及包括对具有25个或更多个成分的样本进行分选。可以从样本分离样本成分中的一个或更多个并且将其传递至样本采集容器，例如2个或更多个样本成分、例如3个或更多个样本成分、例如4个或更多个样本成分、例如5个或更多个样本成分、例如10个或更多个样本成分，以及包括可以从样本分离15个或更多个样本成分并且将其传递至样本采集容器。在一些情况下，短语“样本成分”指具有不同细胞表型的细胞。
146.在一些实施例中，感兴趣的粒子分选系统被配置为：用例如于2017年3月28日提交的美国专利公开号2017/0299493中描述的所附的粒子分选模块(即细胞分选器)来分选粒子(例如细胞)，其公开内容通过引用并入本文。在特定实施例中，使用具有例如于2019年2月8日提交的美国临时专利申请号62/803,264中描述的多个分选决策单元的分选决策模块来分选样本的粒子(例如细胞)，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，用于分选样本的成分的方法包括用具有例如于2017年3月28日提交的美国专利公开号2017/0299493中描述的偏转器板的粒子分选模块来分选粒子(例如生物样本中的细胞)，其公开内容通过引用并入本文。
147.图1示出用于分析和显示生物事件的分选控制系统(例如分析控制器100)的一个示例的功能框图。分析控制器100可以被配置为实现用于控制生物事件的图形显示的各种过程。
148.粒子分析器或分选系统102可以被配置为获得生物事件数据。例如，流式细胞仪可以生成流式细胞事件数据。粒子分析器102可以被配置为向分析控制器100提供生物事件数据。粒子分析器102和分析控制器100之间可以包括数据通信通道。生物事件数据可以经由
数据通信通道提供给分析控制器100。
149.分析控制器100可以被配置为从粒子分析器102接收生物事件数据。从粒子分析器102接收的生物事件数据可以包括流式细胞事件数据。分析控制器100可以被配置为向显示装置106提供包括生物事件数据的第一图表的图形显示。例如，分析控制器100还可以被配置为将感兴趣的区域渲染为在第一图表上重叠的由显示装置106示出的生物事件数据群附近的门(gate)。在一些实施例中，门可以是基于单参数直方图或双变量图绘制的一个或更多个感兴趣的图形区的逻辑组合。在一些实施例中，显示器可以用于显示粒子参数。
150.分析控制器100还可以被配置为在显示装置106上显示与生物事件数据中的门外的其他事件不同的门中的生物事件数据。例如，分析控制器100可以被配置为将门中包含的生物事件数据的颜色渲染为与门外的生物事件数据的颜色不同。显示装置106可以被实现为监视器、平板计算机、智能电话或其他被配置成呈现图形接口的电子装置。
151.分析控制器100可以被配置为从第一输入装置接收标识门的门选择信号。例如，第一输入装置可以被实现为鼠标110。(例如通过在光标位于希望的门上或门中时在那里点击)鼠标110可以向分析控制器100发起标识要在显示装置106上显示或经由其操纵的门的门选择信号。在一些实现中，第一装置可以被实现为用于向分析控制器100提供输入信号的键盘108或其他工具，例如触屏、触笔、光检测器或语音识别系统。一些输入装置可以包括多个输入功能。在这样的实现中，输入功能均可以被当成输入装置。例如，如图1所示，鼠标110可以包括均可以生成触发事件的右鼠标按钮和左鼠标按钮。
152.触发事件可以导致分析控制器100改变数据显示的方式、在显示装置106上实际显示数据的哪些部分和/或提供用于进一步处理的输入，例如选择用于进行粒子分选的所关注的群。
153.在一些实施例中，分析控制器100可以被配置为检测何时通过鼠标110发起门控选择。分析控制器100还可以被配置为自动修改可视化绘图，以促进门控(gating)过程。所述修改可以基于通过分析控制器100接收的生物事件数据的特定分布。
154.分析控制器100可以连接至储存装置104。储存装置104可以被配置为接收和存储来自分析控制器100的生物事件数据。储存装置104还可以被配置为接收和存储来自分析控制器100的流式细胞事件数据。储存装置104还可以被配置为允许通过分析控制器100检索生物事件数据，例如流式细胞事件数据。
155.显示装置106可以被配置为从分析控制器100接收显示数据。显示数据可以包括生物事件数据的图和勾勒绘图的剖面的图。显示装置106还可以被配置为根据从分析控制器100接收的输入与来自粒子分析仪102、储存装置104、键盘108和/或鼠标110的输入的结合而改变所呈现的信息。
156.在一些实现中，分析控制器100可以生成用户接口以接收用于进行分选的示例事件。例如，用户接口可以包括用于接收示例事件或示例图像的控件。可以在采集样本的事件数据之前或基于样本的一部分的事件的初始集合来提供示例事件或图像或示例门。
157.图2a是根据本文提出的一个实施例的粒子分选器系统200(例如粒子分析器102)的示意图。在一些实施例中，粒子分选器系统200是细胞分选器系统。如图2a所示，液滴形成换能器202(例如压电振荡器)被耦接至流体导管201，流体导管201可以被耦接至、可以包括或可以是喷嘴203。在流体导管201之内，鞘液204以流体动力学方式使包括粒子209的样本
流体206集中成移动的流体柱208(例如流)。在移动的流体柱208之中，粒子209(例如细胞)排成单列穿过由照射源212(例如激光器)照射的监测区域211(例如激光器-流交叉的地方)。液滴形成换能器202的振动导致移动的流体柱208分成多个液滴210，其中的一些包含粒子209。
158.在操作中，当感兴趣的粒子(或感兴趣的细胞)穿过监测区域211时，检测台214(例如事件检测器)进行标识。检测台214向时序电路228进行输入，时序电路228接着向闪充电路230进行输入。在由定时的滴落液滴延迟(δt)通知的液滴中断点处，可以对移动的流体柱208应用闪充，以使得感兴趣的液滴携带电荷。感兴趣的液滴可以包括要分选的一个或更多个粒子或细胞。然后可以通过激活偏转板(未示出)以使液滴偏转到分区(例如诸如采集管或多孔或微孔样本板的容器，其中的分区或孔或微孔可以与特别感兴趣的液滴相关联)中来分选带电液滴。如图2a所示，可以在排出容器238中采集液滴。
159.检测系统216(例如液滴边界检测器)用于在感兴趣的粒子经过监测区域211时自动确定液滴驱动信号的相位。示例性液滴边界检测器在美国专利号7,679,039中进行了描述，通过引用将其全部并入本文。检测系统216允许仪器精确地计算在液滴中检测到的每个粒子的位置。检测系统216可以输入幅度信号220和/或相位信号218，接着(经由放大器222)将其输入幅度控制电路226和/或频率控制电路224。幅度控制电路226和/或频率控制电路224接着控制液滴形成换能器202。幅度控制电路226和/或频率控制电路224可以被包括在控制系统中。
160.在一些实现中，分选电子装置(例如检测系统216、检测台214和处理器240)可以与被配置为存储所检测的事件和基于其的分选决策的存储器耦接。分选决策可以被包括在粒子的事件数据中。在一些实现中，检测系统216和检测台214可以被实现为单个检测单元或者可通信地耦接，以使事件测量结果可以由检测系统216或检测台214中的一个收集并且被提供给非收集元件。
161.图2b是根据本文呈现的一个实施例的粒子分选器系统的示意图。图2b所示的粒子分选器系统600包括偏转板252和254。可以经由倒钩(barb)中的流充电导线施加电荷。这产生了要分析的包含粒子210的一连串液滴210。可以用一个或更多个光源(例如激光器)照亮粒子以产生光散射和荧光信息。例如通过分选电子装置或其他检测系统(图2b中未示出)分析粒子的信息。偏转板252和254可以独立控制，以吸引或排斥带电液滴，以将液滴引导到例如分区的目的采集容器(例如272、274、276或278中的一个)。如图2b所示，可以控制偏转板252和254，以沿着第一路径262将粒子引向容器274或者沿着第二路径268将其引向容器278。如果是不感兴趣的粒子(例如在特定分选范围之中不表现散射或照度信息)，则偏转板可以允许粒子继续沿着流动路径264离开。这样的不带电液滴可以例如经由抽吸器270进入废品容器。
162.可以包括分选电子装置，以发起测量结果的收集、接收粒子的荧光信号以及确定如何调整偏转板以导致对粒子进行分选。图2b所示的实施例的示例实现包括由becton、dickinson公司(新泽西州富兰克林湖区)提供的商用的bd facsaria
tm
系列的流式细胞仪。
163.在一些实施例中，所描述的用于粒子分选器系统200的一个或更多个组件可以用于通过使或不使粒子被物理地分选到采集容器中而分析和表征粒子。同样，下文描述的用于粒子分析系统300(图3)的一个或更多个组件可以用于通过使或不使粒子被物理地分选
到采集容器中而分析和表征粒子。例如，如本文所述，可以使用粒子分选器系统200或粒子分析系统300的组件中的一个或更多个以包括至少三组的树的形式对粒子进行组或显示。
164.图3示出用于基于计算的样本分析和粒子表征的粒子分析系统的功能框图。在一些实施例中，粒子分析系统300是流式系统。图3所示的粒子分析系统300可以被配置为完全或部分地执行本文描述的方法。粒子分析系统300包括流体系统302。流体系统302可以包括或耦接有样本管310及样本管之中的移动流体柱，其中样本的粒子330(例如细胞)沿着公共样本路径320移动。
165.粒子分析系统300包括检测系统304，其被配置为当每个粒子沿着公共样本路径经过一个或更多个检测台时采集来自每个粒子的信号。检测台308通常指公共样本路径的监测区域340。在一些实现中，检测可以包括当粒子330经过监测区域340时检测光或它们的一个或更多个其他性质。在图3中，示出了具有一个监测区域340的一个检测台308。粒子分析系统300的一些实现可以包括多个检测台。此外，一些检测台可以监测多于一个区域。
166.每个信号被分配信号值，以形成用于每个粒子的数据点。如上所述，这个数据可以称为事件数据。数据点可以是包括针对粒子所测量的各个性质的值的多维数据点。检测系统304被配置为在第一时间间隔中采集一系列这样的数据点。
167.粒子分析系统300还可以包括控制系统306。控制系统306可以包括图2a所示的一个或更多个处理器、幅度控制电路226和/或频率控制电路224。所示出的控制系统206可以可操作地与流体系统302相关联。控制系统306可以被配置为基于泊松分布以及由检测系统304在第一时间间隔期间采集的数据点的数量生成针对第一时间间隔的至少一部分的经计算的信号频率。控制系统306还可以被配置为基于第一时间间隔的该部分中的数据点的数量生成实验信号频率。控制系统306还可以将实验信号频率与经计算的信号频率或预定信号频率进行比较。
168.图4示出根据本发明的说明性实施例的用于流式细胞术的系统400。系统400包括流式细胞仪410、控制器/处理器490和存储器495。流式细胞仪410包括一个或更多个激发激光器415a-415c、聚焦透镜420、液流腔425、前散射检测器430、侧散射检测器435、荧光采集透镜440、一个或更多个分束器445a-445g、一个或更多个带通滤光片450a-450e、一个或更多个长通(“lp”)滤光片455a-455b，以及一个或更多个荧光检测器460a-460f。
169.激发激光器415a-c发射激光束形式的光。在图4的示例系统中，从激发激光器415a-415c发射的激光束的波长分别是488nm、633nm和325nm。首先指引激光束通过分束器445a和445b中的一个或更多个。分束器445a透射488nm的光以及反射633nm的光。分束器445b透射uv光(具有10至400nm的范围中的波长的光)以及反射488nm和633nm的光。
170.然后指引激光束至聚焦透镜420，其将光束集中到液流腔425之中的样本的粒子所在的那部分流体流上。液流腔是流体系统的将流中的粒子(通常一次一个)引向用于探查的聚焦激光束的部件。液流腔可以包括台式细胞仪中的流通池或空气流细胞仪中的喷嘴尖端。
171.根据粒子的特性(例如其尺寸、内部结构)以及存在依附于粒子或自然存在于粒子之上或之中的一个或更多个荧光分子，来自激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和各种不同波长下的再发射的吸收而与样本中的粒子相互作用。荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光可以通过分束器445a-445g、带通滤光片450a-450e、长通滤光片455a-455b和
荧光采集透镜440中的一个或更多个选路至前散射检测器430、侧散射检测器435和一个或更多个荧光检测器460a-460f中的一个或更多个。
172.荧光采集透镜440采集由于粒子-激光束相互作用而发射的光，并且使这些光选路到一个或更多个分束器和滤光片。带通滤光片，例如带通滤光片450a-450e，允许窄范围的波长经过滤光片。例如，带通滤光片450a是510/20滤光片。第一个数字表示光谱带的中心。第二个数字提供光谱带的范围。因此，510/20滤光片在光谱带的中心的每一侧延伸10nm，或从500nm至520nm。短通滤光片透射波长等于或短于特定波长的光。长通滤光片，例如长通滤光片455a-455b，透射的光波长等于或长于特定光波长。例如，长通滤光片455a，其为670nm长通滤光片，透射等于或长于670nm的光。通常对滤光片进行选择，以优化检测器针对特定荧光染料的特性。可以对滤光片进行配置，以使得透射至检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。
173.分束器将不同波长的光指引至不同方向。可以通过滤光片性质表征分束器分例如为短通和长通。例如，分束器445g是620sp分束器，表示分束器445g透射620nm或更短波长的光并且将长于620nm的波长的光反射至不同方向。在一个实施例中，分束器445a-445g可以包括光学镜，例如分色镜。
174.前散射检测器430略微偏离光束定向通过流通池的轴线设置并且被配置为检测衍射光，激发光主要在前向方向上穿过粒子或其附近行进。由前散射检测器检测的光的强度取决于粒子的总尺寸。前散射检测器可以包括光电二极管。侧散射检测器435被配置为检测基于粒子的表面和内部结构折射以及反射的光，并且随着粒子结构的复杂度增加而趋于增加。来自与粒子相关联的荧光分子的荧光发射可以通过一个或更多个荧光检测器460a-460f进行检测。侧散射检测器435和荧光检测器可以包括光电倍增管。在前散射检测器430、侧散射检测器435和荧光检测器处检测到的信号可以通过检测器转换成电信号(电压)。这个数据可以提供关于样本的信息。
175.本领域技术人员将认识到，根据本发明的实施例的流式细胞仪不限于图4所描绘的流式细胞仪，而是可以包括现有技术已知的任意流式细胞仪。例如，流式细胞仪可以具有采用各种波长和各种不同构型的任意数量的激光器、分束器、滤光片和检测器。
176.在操作中，细胞仪操作由控制器/处理器490控制，并且来自检测器的测量数据可以存储在存储器495中并且由控制器/处理器490处理。虽然未明确示出，但是控制器/处理器190被耦接至检测器以从其接收输出信号，并且还可以被耦接至流式细胞仪400的电气和机电组件以控制激光器、流体流参数等。还可以在系统中提供输入/输出(i/o)功能部497。存储器495、控制器/处理器490和i/o 497可以全部作为流式细胞仪410的集成部件提供。在这样的实施例中，显示器还可以形成i/o功能部497的用于向细胞仪400的用户呈现实验数据的部件。备选地，存储器495和控制器/处理器490以及i/o功能部中的一些或全部可以是诸如通用计算机之类的一个或更多个外部装置的部件。在一些实施例中，存储器495和控制器/处理器490中的一些或全部可以与细胞仪410无线或有线通信。结合存储器495和i/o 497的控制器/处理器490可以被配置为执行与流式细胞仪实验的制备和分析有关的各种功能。
177.如从流通池425到每个检测器的光路中的滤光片和/或分束器的构型所定义，图4所示的系统包括检测6个不同波段的荧光的6个不同检测器(在本文可以将其称为用于指定
检测器的“滤光窗口”)。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子将发射在其自身的特征波段中的光。可以对用于实验及其相关联的荧光发射段的特定荧光标签进行选择，以大体上与检测器的滤光窗口重合。然而，因为提供了更多检测器，并且使用了更多标签，所以滤光窗口与荧光发射谱之间的完美对应是不可能的。真实情况一般是，虽然特定荧光分子的发射谱的峰可以位于一个特定检测器的滤光窗口之中，但是该标签的一些发射谱也将与一个或更多个其他检测器的滤光窗口重叠。这可以被称为溢出。i/o 497可以被配置为接收关于流式细胞仪实验的数据，该实验具有荧光标签组和具有多个标记的多个细胞群，每个细胞群具有多个标记的子集。i/o 497还可以被配置为接收为一个或更多个细胞群分配一个或更多个标记的生物数据、标记密度数据、发射谱数据、为一个或更多个标签分配标记的数据以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据，例如标签谱特性和流式细胞仪配置数据还可以存储在存储器495中。控制器/处理器490可以被配置为评估标签到标记的一个或更多个指定。
178.根据一些实施例的系统可以包括显示器和操作员输入装置。操作员输入装置可以例如是键盘、鼠标等。所述处理模块包括：处理器，其具有对其上存储有用于执行主题方法的步骤的指令的存储器的访问权。所述处理模块可以包括操作系统、图形用户接口(gui)控制器、系统存储器、存储器储存装置、以及输入输出控制器、缓冲器存储器、数据备份单元以及许多其他装置。处理器可以是商用的处理器或者其可以是可用或将变为可用的其他处理器中的一个。处理器执行操作系统，并且操作系统以周知的方式与固件和硬件连接，并且促进处理器协调和执行可以用各种编程语言编写的各种计算机程序的功能，例如本领域已知的java、perl、c++、其他高级或低级语言以及其组合。通常都与处理器合作的操作系统协调和执行计算机的其他组件的功能。操作系统还完全根据已知技术来提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理以及通信控制和有关的服务。处理器可以是任意合适的模拟或数字系统。在一些实施例中，例如，处理器包括提供反馈控制例如负反馈控制的模拟电子装置。
179.系统存储器可以是各种已知的或将来的存储器储存装置中的任一个。示例包括通常可以商购得到的任意随机存取存储器(ram)、磁介质例如常驻硬盘或磁带、光介质例如读写光盘、闪存装置或其他存储器储存装置。存储器储存装置可以是各种已知的或未来装置中的任一个，包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。这些类型的存储器储存装置通常对程序存储介质(未示出)进行读和/或写，例如分别是光盘、磁带、可移除硬盘或软盘。这些或现在使用或将以后开发的其他程序存储介质中的任一个可以被当成为计算机程序产品。将理解的是，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，也被称为计算机控制逻辑，通常存储在系统存储器和/或结合存储器储存装置使用的程序储存装置中。
180.在一些实施例中，计算机程序产品被描述为包括其中存储有控制逻辑(包括程序代码的计算机软件程序)的计算机可用介质。当由计算机的处理器执行时，控制逻辑将导致处理器执行本文描述的功能。在其他实施例中，一些功能主要在使用例如硬件状态机的硬件中实现。实现硬件状态机以执行本文描述的功能对于相关领域技术人员将是显而易见的。
181.存储器可以是处理器可以存储和接收数据的任意合适的装置，例如磁、光或固态
储存装置(包括磁盘或光盘或磁带或ram或任意其他合适的装置，固定式或便携式之一)。处理器可以包括基于承载必要的程序代码的计算机可读介质适当地进行编程的通用数字微处理器。程序可以通过通信通道远程提供给处理器或预先保存在计算机程序产品中，例如存储器或使用与存储器结合的那些装置中的任意装置的某个其他的便携式或固定式计算机可读存储介质。例如，磁盘或光盘可以承载程序，并且可以由磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括程序，例如用于实践如上所述的方法时使用的计算机程序产品、算法的形式。根据本发明的程序可以记录在计算机可读介质上，例如可以由计算机直接读取和访问的任意介质。这样的介质包括但不限于磁储存介质，例如软盘、硬盘储存介质和磁带；光储存介质，例如cd-rom；电储存介质，例如ram和rom；便携式闪存驱动器；以及这些种类装置的混合，例如磁/光储存介质。
182.处理器还可以具有对通信通道的访问权，以与在远程位置的用户通信。通过远程位置表示用户不与系统直接接触以及将来自以下外部装置的输入信息中继至输入管理器：例如连接至广域网(“wan”)、电话网、卫星网或任意其他合适的通信通道的计算机，包括移动电话(即智能电话)。
183.在一些实施例中，根据本公开的系统可以被配置为包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一装置通信的接收器和/或发射器。通信接口可以被配置用于有线或无线通信，包括但不限于射频(rf)通信(例如射频标识(rfid)、zigbee通信协议、wifi、红外线、无线通用串行总线(usb)、超宽带(uwb)、通信协议以及蜂窝通信，例如码分多址(cdma)或全球移动通信(gsm)。
184.在一个实施例中，通信接口被配置为包括一个或更多个通信端口，例如物理端口或接口，例如usb端口、rs-232端口或任意其他合适的电连接端口，以允许主题系统与其他外部装置之间的数据通信，例如(例如在医生的办公室或在医院环境中的)被配置用于类似的互补数据通信的计算机终端。
185.在一个实施例中，通信接口被配置用于红外线通信、通信或任意其他合适的无线通信协议，以使主题系统与其他装置(例如，计算机终端和/或网络、启用通信的移动电话、个人数字助理或用户可以结合使用的任意其他通信装置)通信。
186.在一个实施例中，通信接口被配置为通过利用以下提供数据传输的连接：通过手机网络的互联网协议(ip)、短消息服务(sms)、与连接至互连网的局域网(lan)上的个人计算机(pc)的无线连接或在wifi热点处的与互联网的wifi连接。
187.在一个实施例中，主题系统被配置为例如使用常见标准(例如802.11或rf协议或irda红外线协议)、经由通信接口与服务器装置进行无线通信。服务器装置可以是另一便携式装置，例如智能电话、个人数字助理(pda)或笔记本计算机；或较大装置，例如台式计算机、电器等。在一些实施例中，服务器装置具有：显示器，例如液晶显示器(lcd)；以及输入装置，例如按键、键盘、鼠标或触屏。
188.在一些实施例中，通信接口被配置为使用上述通信协议和/或机制中的一个或更多个与网络或服务器装置自动地或半自动地传递存储在主题系统中的(例如在可选的数据储存单元中的)数据。
189.输出控制器可以包括用于向用户呈现信息的各种已知的显示装置中的任意一种
molecular biology(流式细胞术方案，分子生物学中的方法)，91期，humana出版社(1997)；practical flow cytometry(实际流式细胞术)，第三版，wiley-liss(1995)；virgo等(2012)ann clin biochem，1月，49(第1部分):17-28；linden等，semin throm hemost，2004年10月，30(5):502-11；alison等，j pathol，2010年12月，222(4):335-344；以及herbig等(2007)crit rev ther drug carrier syst，24(3):203-255；其公开内容通过引用并入本文。在特定实例中，感兴趣的流式细胞系统包括bd biosciences facscanto
tm ii流式细胞仪、bd accuri
tm
流式细胞仪、bd biosciences facscelesta
tm
流式细胞仪、bd biosciences facslyric
tm
流式细胞仪、bd biosciences facsverse
tm
流式细胞仪、bd biosciences facsymphony
tm
流式细胞仪、bd biosciences lsrfortessa
tm
流式细胞仪、bd biosciences lsrfortess
tm x-20流式细胞仪、以及bd biosciences facscalibur
tm
细胞分选器、bd biosciences facscount
tm
细胞分选器、bd biosciences facslyric
tm
细胞分选器、以及bd biosciencesvia
tm
细胞分选器、bd biosciences influx
tm
细胞分选器、bd biosciences jazz
tm
细胞分选器、bd biosciences aria
tm
细胞分选器、以及bd biosciences facsmelody
tm
细胞分选器等。
194.在一些实施例中，主题粒子分选系统是流式细胞系统，例如以下中描述的那些：美国专利号9,952,076；9,933,341；9,726,527；9,453,789；9,200,334；9,097,640；9,095,494；9,092,034；8,975,595；8,753,573；8,233,146；8,140,300；7,544,326；7,201,875；7,129,505；6,821,740；6,813,017；6,809,804；6,372,506；5,700,692；5,643,796；5,627,040；5,620,842；5,602,039；其中的每一个的公开内容通过引用全部并入本文。
195.用于基于标识的顺序而采用流式细胞术对具有粒子(例如细胞)的样本进行分选的计算机可读存储介质
196.本公开的方面还包括具有用于实践主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。计算机可读存储介质可以在一个或更多个计算机上使用，以完成用于实践本文描述的方法的系统的自动化或部分自动化。在特定实施例中，根据本文描述的方法的指令可以以“编程”的形式编码到计算机可读介质上，其中如本文所使用的术语“计算机可读介质”指代参与向用于执行和处理的计算机提供指令和数据的任意非暂时性存储介质。合适的非暂时性存储介质的示例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、cd-rom、cd-r、磁带、非易失性存储卡、rom、dvd-rom、蓝光光盘、固态盘和网络附属储存器(nas)，而不管这样的装置在计算机内部还是外部。包含信息的文件可以被“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”表示记录信息以使得其在以后可由计算机访问和检索。本文描述的计算机实现的方法可以使用程序来执行，所述程序可以用任意数量的计算机编程语言中的一个或更多个编写。这样的语言包括例如java(加利福尼亚州圣塔克拉拉的sun微系统公司)、visual basic(华盛顿州雷德蒙德的微软公司)和c++(新泽西州贝德明斯特的美国电话电报公司)以及任意许多其他语言。
197.在一些实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括存储在其上的计算机程序，其中当所述计算机程序被加载到计算机上时，包括具有以下各项的指令：用于基于从所检测的来自样本的细胞的光生成的一个或更多个数据信号而标识细胞表型的算法；以及用于指示细胞分选器基于标识的顺序而将具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到分区中的算法。
198.所述计算机可读存储介质可以包括用于捕捉液流的一个或更多个图像的指令，例
如液流的2个或更多个图像、例如3个或更多个图像、例如4个或更多个图像、例如5个或更多个图像、例如10个或更多个图像、例如15个或更多个图像以及包括25个或更多个图像。在特定实施例中，所述计算机可读存储介质包括用于捕捉的图像的光学调整的指令，例如以提高图像的光分辨率。在特定实施例中，计算机可读存储介质可以包括用于将捕捉的图像的分辨率提高5％或更多的指令，例如10％或更多、例如25％或更多、例如50％或更多，以及包括将捕捉的图像的分辨率提高75％或更多。
199.在实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括用于在分选预定数量的具有表型的集合中的第一表型的细胞之后指示细胞分选器停止分选第一表型的算法。在特定实施例中，所述计算机可读存储介质包括用于指示细胞分选器将预定数量的细胞动态地分选到分区中的算法。在其他实施例中，所述计算机可读存储介质包括用于在将预定数量的细胞分选到第一孔之后指示支撑台将多孔板移动到第二孔的算法。
200.所述计算机可读存储介质还可以包括用于记录分选到分区中的细胞的表型的算法。在一些实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括用于通过将已分选的细胞的表型的表示添加到表型的列表而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于查询表型的列表以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在其他实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括用于通过将已分选的细胞的表型的表示添加到概率数据结构而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于查询概率数据结构以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在一些实例中，所述概率数据结构是布隆过滤器。在其他实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括用于通过将已分选的细胞的表型的表示添加到关联数组而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于查询关联数组以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在一些实例中，所述关联数组是内容可寻址的存储器。在一些实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括用于通过在真值表中与细胞表型对应的位置处设置值而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于查询真值表以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。在其他实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括用于记录标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表的算法。
201.所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于计算粒子的一个或更多个参数的算法。在这些实施例中，所述计算机可读存储介质包括用于指示细胞分选器进行以下操作的算法：基于标识的顺序而将样本中的表现包括一个或更多个表型的第一表型集合的细胞动态地分选到第一分区中；以及将样本中的不表现所述第一表型集合的细胞动态地分选到第二分区中。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于基于样本中已分选的细胞动态地更新第一表型集合以使得分选到第一分区中的细胞和分选到第二分区中的细胞包括基本上相同的细胞数量的算法。
202.所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于不分选表现不确定的表型的
细胞的算法。
203.所述非暂时性计算机可读存储介质还可以包括用于基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算针对单个数据信号测量的荧光溢出量的估计值的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算两个萤光团之间的协方差的估计值的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于基于所估计的萤光团之间的协方差而计算用于萤光团的表达的阈值的算法。在这样的实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质可以包括用于基于所估计的萤光团之间的协方差而计算关于由已分选的细胞表现的表型的不确定性的量度的算法。
204.计算机可读存储介质可以在具有显示器和操作员输入装置的一个或更多个计算机系统上使用。操作员输入装置可以例如是键盘、鼠标等。所述处理模块包括处理器，其具有对具有存储在其上的用于执行主题方法的步骤的指令的存储器的访问权。所述处理模块可以包括操作系统、图形用户接口(gui)控制器、系统存储器、存储器储存装置、以及输入输出控制器、缓冲器存储器、数据备份单元以及许多其他装置。处理器可以是商用的处理器或者其可以是可用或将变为可用的其他处理器中的一个。处理器执行操作系统，并且操作系统以周知的方式与固件和硬件连接，并且促进处理器协调和执行可以用各种编程语言编写的各种计算机程序的功能，例如本领域已知的java、perl、c++、其他高级或低级语言以及其组合。通常都与处理器合作的操作系统协调和执行计算机的其他组件的功能。操作系统还完全根据已知技术来提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理以及通信控制和有关的服务。
205.实用性
206.主题系统、方法和计算机系统用于希望分析和分选流体介质中的样本(例如生物样本)中的粒子成分(例如细胞)的多种应用。在一些实施例中，本文描述的系统和方法用于采用流式细胞术来表征用荧光标签标记的生物样本。在其他实施例中，所述系统和方法用于发射光的光谱学。此外，所述主题系统和方法用于提高对(例如液流中的)样本进行分选的效率。通过提高对样本进行分选的效率来表示在对样本进行分选时、在使用主题系统和方法时可以浪费样本的较少的粒子(例如细胞)(即丢弃粒子(例如细胞)以导致其未被使用)。具体地，所述主题系统和方法可以提高进行分选的效率，具体地，当对样本之中的表型较不频繁出现的细胞进行分选时，可以减少被浪费的细胞的数量。在特定实例中，在使用主题系统和方法时，进行分选的效率可以提高，使得可以采集和分选变化较大的粒子。通过粒子的变化来表示，例如当使用本公开的实施例时可以分选细胞表型使得分选数量更多的不同的细胞表型。本公开的实施例用于希望提供在细胞分选期间具有更高的细胞分选效率、更好的粒子采集及粒子充电效率、更准确的粒子充电和更好的粒子偏转的情况。
207.本公开的实施例也可以用于以下应用：可能希望将从生物样本制备的细胞用于研究、实验室测试或在治疗中使用。在一些实施例中，主题方法和装置可以促进获得从目标流体或组织生物样本制备的各个的细胞。例如，主题方法和系统促进基于用作疾病(例如癌)的研究或诊断样品的流体或组织样本获得细胞。同样，主题方法和系统可以促进基于要在治疗中使用的流体或组织样本获得细胞。与传统的流式细胞系统相比，本公开的方法和装置允许以更好的效率和低的成本从生物样本(例如器官、组织、组织碎片、流体)分离和收集
细胞。
208.尽管存在随附权利要求，但是本公开也由以下各项限定：
209.1.一种采用流式细胞术对样本进行分选的方法，所述方法包括：
210.将所述样本引入流式细胞仪；
211.使引入的所述样本在液流中流动；
212.用光源照射所述液流中的所述样本；
213.检测来自在所述液流中流动的所述样本中的细胞的光；
214.基于从检测的光生成的一个或更多个数据信号而标识在所述液流中流动的所述样本中的细胞的表型；以及
215.基于标识的顺序将所述样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到分区中。
216.2.根据项1所述的方法，还包括：在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后，从所述表型的集合中排除所述第一表型。
217.3.根据项1所述的方法，其中，预定数量的细胞被分选到分区中。
218.4.根据项1所述的方法，其中，所述分区包括孔。
219.5.根据项4所述的方法，其中，所述孔是多孔板的孔。
220.6.根据项5所述的方法，还包括：在将预定数量的细胞分选到第一孔中之后将所述多孔板向前移动到第二孔。
221.7.根据项1所述的方法，还包括：记录分选到分区中的细胞的表型。
222.8.根据项7所述的方法，其中，记录分选到分区中的细胞的表型包括将已分选的细胞的表型的表示添加到表型的列表。
223.9.根据项8所述的方法，还包括：查询表型的列表以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
224.10.根据项7所述的方法，其中，记录分选到分区中的细胞的表型包括将已分选的细胞的表型的表示添加到概率数据结构。
225.11.根据项10所述的方法，还包括：查询所述概率数据结构以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
226.12.根据项10所述的方法，其中，所述概率数据结构是布隆过滤器。
227.13.根据项12所述的方法，还包括：基于所述样本的分析选择用于所述布隆过滤器的哈希函数以减少所述布隆过滤器中的冲突。
228.14.根据项7所述的方法，其中，记录分选到分区中的细胞的表型包括将已分选的细胞的表型的表示添加到关联数组。
229.15.根据项14所述的方法，还包括：查询关联数组以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
230.16.根据项14所述的方法，其中，所述关联数组是内容可寻址的存储器。
231.17.根据项7所述的方法，其中，记录分选到分区中的细胞的表型包括在真值表中与细胞表型对应的位置处设置值。
232.18.根据项17所述的方法，还包括：查询所述真值表以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
233.19.根据项1所述的方法，还包括：记录标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息。
234.20.根据项19所述的方法，还包括：维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表。
235.21.根据项1所述的方法，还包括：基于样本中的细胞的子集估计由样本中的细胞表现出的表型的数量。
236.22.根据项1所述的方法，其中，分选细胞包括使细胞偏转到第一分区和第二分区中。
237.23.根据项22所述的方法，其中，将所述样本中的细胞分成表现包括预定数量的表型的第一表型集合的第一组以及不表现第一表型集合的第二组。
238.24.根据项23所述的方法，其中，基于标识的顺序将所述第一组分选到第一分区或第二分区之一中。
239.25.根据项23所述的方法，其中，用于将细胞分成第一组和第二组的第一表型集合被确定为使得第一组和第二组包括基本上相同的细胞数量。
240.26.根据项23所述的方法，还包括：基于样本中已分选的细胞动态地更新第一表型集合，以使得第一组和第二组包括基本上相同的细胞数量。
241.27.根据项1所述的方法，其中，基于从根据检测的光生成的数据信号而确定的一个或更多个参数值而标识细胞表型。
242.28.根据项27所述的方法，其中，细胞的特定参数值指示细胞是否具有表型的不确定状态。
243.29.根据项28所述的方法，其中，当细胞表现细胞是否具有表型的不确定状态时不分选该细胞。
244.30.根据项1所述的方法，还包括：基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而估计针对单个数据信号测量的荧光溢出量。
245.31.根据项30所述的方法，还包括：基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而估计两个萤光团之间的协方差。
246.32.根据项31所述的方法，还包括：基于所估计的萤光团之间的协方差而定义用于萤光团的表达的阈值。
247.33.根据项32所述的方法，还包括：基于所估计的萤光团之间的协方差而定义关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度。
248.34.根据项2、3、6和23中的任意项所述的方法，其中，所述预定数量是1。
249.35.根据项1-34中任意一项所述的方法，其中，所述预定表型的集合包括具有一个或更多个细胞亚型的细胞类型。
250.36.根据项35所述的方法，其中，所述细胞类型是t细胞。
251.37.根据项36所述的方法，其中，所述细胞亚型包括cd4+t细胞。
252.38.根据项36所述的方法，其中，所述细胞亚型包括cd8+t细胞。
253.39.根据项1-38中任意一项所述的方法，其中，检测来自在液流中流动的样本的光包括检测光吸收、光散射、荧光或其组合。
254.40.根据项39所述的方法，其中，从来自细胞的散射光确定细胞的表型。
255.41.根据项40所述的方法，其中，所述散射光包括前散射光。
256.42.根据项40所述的方法，其中，所述散射光包括侧散射光。
257.43.根据项39所述的方法，其中，从来自细胞的荧光确定该细胞的表型。
258.44.根据项43所述的方法，其中，从根据细胞的频率编码的荧光数据确定该细胞的表型。
259.45.根据项1-44中任意一项所述的方法，其中，通过集成电路装置检测细胞的表型。
260.46.根据项45所述的方法，其中，所述集成电路装置是现场可编程门阵列(fpga)。
261.47.根据项45所述的方法，其中，所述集成电路装置是专用集成电路(asic)。
262.48.根据项45所述的方法，其中，所述集成电路装置是复杂可编程逻辑器件(cpld)。
263.49.根据项1所述的方法，其中，用波长从200nm至800nm的光源照射所述液流。
264.50.根据项49所述的方法，其中，所述方法包括用第一频移光束和第二频移光束照射所述液流。
265.51.根据项50所述的方法，其中，所述第一频移光束包括本振(lo)光束并且所述第二频移光束包括射频梳(comb)光束。
266.52.根据项50-51中任意一项所述的方法，还包括：
267.对声光装置应用射频驱动信号；以及
268.用激光器照射所述声光装置以生成所述第一频移光束和所述第二频移光束。
269.53.根据项52所述的方法，其中，所述激光器是连续波激光器。
270.54.一种用于采用流式细胞术对样本进行分选的系统，所述系统包括：
271.光源，被配置为照射在液流中流动的包括细胞的所述样本；
272.光检测系统，包括光电检测器，所述光电检测器用于检测来自所述样本中的所述细胞的光并且从检测的光生成多个数据信号；
273.细胞分选器，被配置为接收在所述液流中流动的包括细胞的所述样本；
274.多个分区，被配置为接收来自所述样本的通过所述细胞分选器分选的细胞；以及
275.处理器，包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器：
276.基于从检测的光生成的所述数据信号中的一个或更多个数据信号而标识所述样本中的细胞的表型；以及
277.指示所述细胞分选器基于标识的顺序而将所述样本中的具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到所述分区中。
278.55.根据项54所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后停止分选所述表型的集合中的所述第一表型。
279.56.根据项54所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器将预定数量的细胞动态地分选到分区中。
280.57.根据项54所述的系统，其中，所述分区包括孔。
281.58.根据项57所述的系统，其中，所述孔是多孔板的孔。
282.59.根据项58所述的系统，还包括：
283.可平移的支撑台，被配置为移动所述多孔板；
284.其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器在将预定数量的细胞分选到第一孔中之后指示所述支撑台将所述多孔板移动到第二孔。
285.60.根据项54所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器存储分选到分区中的细胞的表型。
286.61.根据项60所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过将已分选的细胞的表型的表示添加到表型的列表而存储分选到分区中的细胞的表型。
287.62.根据项61所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询表型的列表以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
288.63.根据项60所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过将已分选的细胞的表型的表示添加到概率数据结构而存储分选到分区中的细胞的表型。
289.64.根据项63所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询概率数据结构以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
290.65.根据项63所述的系统，其中，所述概率数据结构是布隆过滤器。
291.66.根据项60所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过将已分选的细胞的表型的表示添加到关联数组而存储分选到分区中的细胞的表型。
292.67.根据项66所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询关联数组以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
293.68.根据项66所述的系统，其中，所述关联数组是内容可寻址的存储器。
294.69.根据项60所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器通过在真值表中与细胞表型对应的位置处设置值而存储分选到分区中的细胞的
表型。
295.70.根据项69所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器查询所述真值表以确定是否已经分选第一细胞，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
296.71.根据项54所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器存储标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息。
297.72.根据项71所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表。
298.73.根据项54所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器指示所述细胞分选器：
299.基于标识的顺序而将所述样本中的表现包括一个或更多个表型的第一表型集合的细胞动态地分选到第一分区中，以及
300.将所述样本中的不表现所述第一表型集合的细胞动态地分选到第二分区中。
301.74.根据项73所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所述样本中已分选的细胞而动态地更新所述第一表型集合，以使得分选到所述第一分区中的细胞和分选到所述第二分区中的细胞包括基本上相同的细胞数量。
302.75.根据项54所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器不分选表现不确定的表型的细胞。
303.76.根据项54所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算针对单个数据信号测量的荧光溢出量的估计值。
304.77.根据项76所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算两个萤光团之间的协方差的估计值。
305.78.根据项77所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所估计的萤光团之间的协方差而计算用于萤光团的表达的阈值。
306.79.根据项78所述的系统，其中，所述处理器包括可操作地耦接至所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由所述处理器执行时，致使所述处理器基于所估计的萤光团之间的协方差而计算关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度。
307.80.根据项55、56和59中的任意项所述的系统，其中，所述预定数量是1。
308.81.根据项54-80中任意一项所述的系统，其中，所述预定表型的集合包括具有一个或更多个细胞亚型的细胞类型。
309.82.根据项81所述的系统，其中，所述细胞类型是t细胞。
310.83.根据项82所述的系统，其中，所述细胞亚型包括cd4+t细胞。
311.84.根据项82所述的系统，其中，所述细胞亚型包括cd8+t细胞。
312.85.根据项54-84中任意一项所述的系统，其中，所述光检测系统被配置为检测光吸收、光散射、荧光或其组合。
313.86.根据项54-85中任意一项所述的系统，其中，所述光源包括被配置为至少生成第一频移光束和第二频移光束的光束生成器组件。
314.87.根据项86所述的系统，其中，所述光束生成器包括声光偏转器。
315.88.根据项86-87中任意一项所述的系统，其中，所述光束生成器包括直接数字合成器(dds)rf梳生成器。
316.89.根据项86-88中任意一项所述的系统，其中，所述光束生成器组件被配置为生成频移本振光束。
317.90.根据项86-89中任意一项所述的系统，其中，所述光束生成器组件被配置为生成多个频移梳光束。
318.91.根据项54-90中任意一项所述的系统，其中，所述光源包括激光器。
319.92.根据项91所述的系统，其中，所述激光器是连续波激光器。
320.93.根据项54所述的系统，其中，所述细胞分选器包括液滴偏转器。
321.94.一种非暂时性计算机可读存储介质，包括存储在其上的用于对样本进行分选的指令，所述指令包括：
322.用于基于从所检测的来自所述样本的细胞的光生成的一个或更多个数据信号而标识细胞表型的算法；以及
323.用于指示细胞分选器基于标识的顺序而将具有预定表型的集合中的表型的细胞动态地分选到分区中的算法。
324.95.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于在分选预定数量的具有第一表型的细胞之后指示所述细胞分选器停止分选所述表型的集合中的所述第一表型的算法。
325.96.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于指示所述细胞分选器将预定数量的细胞动态地分选到分区中的算法。
326.97.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于在将预定数量的细胞分选到第一孔之后指示支撑台将多孔板移动到第二孔的算法。
327.98.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于记录分选到分区中的细胞的表型的算法。
328.99.根据项98所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过将已分选的细胞的表型的表示添加到表型的列表而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。
329.100.根据项99所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于查询表型的列表以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
330.101.根据项98所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过将已分选的细胞的表型的表示添加到概率数据结构而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。
331.102.根据项98所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于查询概率数据结构以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
332.103.根据项101所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述概率数据结构是布隆过滤器。
333.104.根据项98所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过将已分选的细胞的表型的表示添加到关联数组而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。
334.105.根据项104所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于查询关联数组以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
335.106.根据项104所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述关联数组是内容可寻址的存储器。
336.107.根据项98所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过在真值表中与细胞表型对应的位置处设置值而记录分选到分区中的细胞的表型的算法。
337.108.根据项107所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于查询真值表以确定是否已经分选第一细胞的算法，其中，所述第一细胞具有也由第二细胞表现出的表型。
338.109.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于记录标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的信息的算法。
339.110.根据项109所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于维护标识分区和分选到该分区中的细胞的表型的列表的算法。
340.111.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于指示所述细胞分选器进行以下操作的算法：
341.基于标识的顺序而将所述样本中的表现包括一个或更多个表型的第一表型集合的细胞动态地分选到第一分区中，以及
342.将所述样本中的不表现所述第一表型集合的细胞动态地分选到第二分区中。
343.112.根据项111所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于所述样本中已分选的细胞动态地更新第一表型集合以使得分选到所述第一分区中的细胞和分选到所述第二分区中的细胞包括基本上相同的细胞数量的算法。
344.113.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机
可读存储介质包括用于不分选表现不确定的表型的细胞的算法。
345.114.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算针对单个数据信号测量的荧光溢出量的估计值的算法。
346.115.根据项114所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于已分选的细胞的未混合数据的预测方差-协方差矩阵而计算两个萤光团之间的协方差的估计值的算法。
347.116.根据项115所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于所估计的萤光团之间的协方差而计算用于萤光团的表达的阈值的算法。
348.117.根据项94所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于所估计的萤光团之间的协方差而计算关于由已分选的细胞表现出的表型的不确定性的量度的算法。
349.118.根据项95、96和97中的任意项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述预定数量是1。
350.119.根据项94-118中任意一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述预定表型的集合包括具有一个或更多个细胞亚型的细胞类型。
351.120.根据项119所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述细胞类型是t细胞。
352.121.根据项120所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述细胞亚型包括cd4+t细胞。
353.122.根据项121所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述细胞亚型包括cd8+t细胞。
354.虽然已经为了清楚的理解的目的而通过说明和示例的方式详细地描述了上述发明，但是根据本发明的教导，对于本领域技术人员显而易见的是，可以对其做出特定的改变和修改而不背离随附权利要求的精神和范围。
355.因此，上述内容仅说明了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计体现本发明的原理并且被包括在其精神和范围之中但在本文中却未明确描述或示出的各种布置。此外，本文列举的所有示例和带条件的描述原则上旨在帮助读者理解本发明的原理以及发明人对现有技术做出另外的贡献的构思，并且被解释为不限于这些明确列举的示例和条件。此外，本文列举本发明的原理、方面和实施例以及其特定示例的所有陈述旨在包括其结构等同项和功能等同项两者。此外，这些等同项旨在包括当前已知的等同项和将来开发的等同项两者，即所开发的执行相同功能的(而不论其结构如何)任意元件。此外，无论在权利要求中是否明确列举，本文公开的任何内容都不旨在专门用于公众。
356.因此，不旨在将本发明的范围限制在本文示出和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神通过随附权利要求体现。在权利要求中，35u.s.c
§
112(f)或35u.s.c
§
112(6)被明确定义为，仅当在权利要求中在开始时列举准确的短语“用于
…
的装置”或准确的短语“用于的
…
步骤”进行限制时，才引用其以对权利要求进行这样的限制；如果在权利要求中不使用这样的准确的短语进行限制，那么就不援用35u.s.c
§
112(f)或35u.s.c
§
112
(6)。