使用离子迁移率谱的离子识别的制作方法

本发明总体上涉及离子迁移率谱测定法，并且更具体地，涉及对分析物在经受不同激活水平后迁移率如何变化的分析。

背景技术：

1、碰撞诱导展开(ciu)是一种可以用于区分具有非常类似结构的离子(如蛋白质离子)的技术。该技术包括通过使离子与气体分子碰撞来碰撞激活离子，从而使其结构展开，然后确定该展开离子的离子迁移率。重复该过程，但是当重复时，使用不同的碰撞能量使离子与气体分子碰撞，从而导致离子不同程度的展开，并且因此导致为该离子确定不同的相应离子迁移率。然后可以获得该离子的作为碰撞能量函数的离子迁移率的指纹图谱。具有非常类似结构的不同离子在特定碰撞能量下可能具有相同或类似的离子迁移率，特别是当离子迁移率分离器的分辨率相对较低时。因此，基于离子迁移率，可能很难区分两种类似的离子，如同一蛋白质的构象变化。然而，两种此类离子将具有不同的迁移率-碰撞能量指纹图谱，因此上面所描述的ciu技术对于区分此类离子是有用的。

技术实现思路

1、从第一方面，本发明提供了一种分析离子的方法，其包括：(i)在不同的时间使分析物分子的离子经受不同的激活水平，以便使离子在所述不同的时间具有不同的迁移率，其中激活水平在多个循环中变化，并且其中在循环中的每个期间，激活水平在所述不同的水平之间变化；(ii)使用离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器来确定所述不同激活水平的离子的迁移率；以及(iii)将确定的迁移率与它们相应的激活水平相关联，从而获得分析物分子的指纹图谱。

2、由于激活水平在不同的激活水平之间重复循环，在分析分析物的同时，任何给定的激活水平被执行多次。因此，即使分析物离子的强度随时间变化，该方法也能够获得每个强度下不同激活水平的光谱数据。因此，对于不同激活水平获得的光谱数据的统计精度可以基本上相同。

3、可以对气相中的离子执行在不同时间使分析物分子的离子经受不同激活水平的步骤。

4、本发明的实施例涉及碰撞诱导展开(ciu)技术，尽管也经考虑了用于使分析物离子展开的其他激活技术。

5、离子迁移率分离器可以是离子迁移率分离器，其中离子被促使通过漂移管中的气体，从而离子根据它们通过气体的迁移率而分离。可以通过dc梯度和/或通过沿着设备重复移动dc势垒来促使离子穿过设备。替代地，可以使用扫描离子迁移率过滤器，如差分迁移率分离器(dms)，例如faims设备。此类设备被扫描，以便在不同时间传输不同迁移率的离子。可以通过在不同的时间向设备施加不同的电压来执行此扫描。扫描离子迁移率过滤器被扫描，以便在激活水平的每次出现期间传输不同的迁移率。

6、不同的激活水平可导致分析物离子展开，并且不同程度地改变构象，因此可改变分析物的碰撞截面，并且因此改变其离子迁移率和通过离子迁移率分离器的漂移时间或离开离子迁移率过滤器的时间。

7、分析物可以是生物分子，如蛋白质。

8、可以在每个循环中执行相同的激活水平序列，即循环可以是彼此的副本。

9、离子迁移率分离的单个循环可以在离子已经经受每个激活水平之后执行，或替代地，多个离子迁移率分离循环可以在离子已经经受每个激活水平之后执行。

10、该方法可以包括：使用第一分离器分离样品中的不同分析物分子，然后电离从第一分离器洗脱的分离的分析物分子，然后在所述多个循环中的不同时间执行使分析物分子的离子经受所述不同激活水平的所述步骤；和/或使用第二分离器或过滤器根据物理化学特性分离分析物离子，然后在所述多个循环中的不同时间执行使分析物分子的离子经受所述不同激活水平的所述步骤。

11、电离从第一分离器洗脱的分离的分析物分子的该步骤可以为每种分析物提供强度随时间变化为峰值的离子，和/或每种分析物的离子可以以强度随时间变化为峰值离开第二分离器；并且可以在峰的至少部分期间对离子执行步骤(i)至(iii)以便确定该分析物的离子迁移率与其所经受的相应激活水平之间的相关性。

12、第一分离器可以是液相色谱(lc)分离器、气相色谱(gc)分离器、尺寸排阻色谱(sec)分离器、离子交换色谱(iex)分离器或毛细管电泳(ce)分离器。

13、第二分离器或过滤器可以是质荷比分离器、扫描质荷比过滤器、离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器。

14、例如，扫描离子迁移率过滤器可以是差分迁移率分离器(dms)，如faims设备或任何扫描迁移率过滤器。可以扫描该设备，使得它(仅)在不同时间传输不同迁移率的离子。类似地，如果使用扫描质荷比过滤器，则可以扫描该设备，使得它(仅)在不同时间传输不同质荷比的离子。在这些扫描设备中，可以通过以已知方式改变施加到设备的电压来执行扫描。

15、在扫描的质荷比过滤器或扫描的离子迁移率过滤器的每次扫描期间，激活水平可以在所述多个循环中变化。

16、根据本文所描述的方法，可以在离子被激活的区域的上游或下游提供质量过滤器或离子迁移率过滤器，以便相应地选择性地仅传输具有选择范围的质荷比或迁移率的离子。质量过滤器可以被设置为例如在所述多个循环期间，仅能够传输固定质荷比(或质荷比范围)的离子。类似地，如果使用离子迁移率过滤器，其可以被设置为例如在所述多个循环期间仅能够传输固定迁移率(或迁移率范围)的离子。

17、该方法可以包括：使用权利要求1的步骤(ii)中的所述离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器，根据在中的每个循环中经受激活水平中的每一个之后的离子迁移率来分离离子，以便获得激活水平中的每一个的离子迁移率光谱数据；对在多个循环中为相同激活水平获得的光谱数据求和，以便获得激活水平中的每一个的总和光谱数据；使用总和光谱数据确定不同激活水平的分析物的离子迁移率；并且将这些离子迁移率与它们相应的激活水平相关联，以便产生作为分析物的激活水平的函数的离子迁移率的指纹图谱。

18、每种分析物的离子可以作为强度随时间变化的洗脱峰从第一分离器或第二分离器洗脱，并且该方法可以包括仅将从洗脱峰的一部分中的离子获得的光谱数据求和；或可以仅对第一分离器或第二分离器的每个分离循环的一部分对光谱数据求和。

19、该方法可以包括通过使用在获得总和光谱数据时使用的该激活水平的次数来归一化每个激活水平的光谱数据的强度。

20、该方法可以包括对从第一分离器或第二分离器洗脱的每种分析物执行所述多个循环x次，其中x选自由以下组成的组：≥2；≥3；≥4；≥5；≥6；≥7；≥8；≥9；≥10；≥15；≥20；≥25；≥30；≥35；≥40；或≥45。

21、该方法可以包括在选自以下的时间尺度内执行每个循环：≤15s；≤14s；≤13s；≤12s；≤11s；≤10s；≤9s；≤8s；≤7s；≤6s；或5s。

22、在每个循环中可以有y个所述不同的激活水平，其中y选自由以下组成的组：≥2；≥3；≥4；≥5；≥6；≥7；≥8；≥9；或≥10。

23、可以通过使离子与气体分子碰撞来激活离子，其中通过以不同的能量和/或不同的持续时间使离子与气体分子碰撞来使离子经受所述不同的激活水平。

24、不太优选地，离子可以通过其他方式激活(如光激活)，并且可以使用不同频率和/或强度的光来执行不同水平的激活。替代地，可以通过与不同浓度或类型的试剂离子或分子反应来激活离子，以便执行不同水平的激活。

25、该方法可以进一步包括对本发明第一方面的步骤(ii)中所述的离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器下游的离子进行质量分析，以确定它们的质荷比。

26、该方法可以包括选择质荷比和过滤通过该方法获得的光谱数据，以便获得具有该质荷比的离子的离子迁移率和相应激活水平的相关值。

27、该方法可以包括使根据权利要求1的步骤(ii)中所述的离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器下游的离子碎片化或反应，以便形成碎片或产物离子；确定那些碎片或产物离子的质荷比；以及将碎片或产物离子的质荷比与它们相应的前体离子上使用的激活水平相关联。

28、这提供了给定类型的分析物分子的指纹图谱，其包含离子迁移率和激活水平的相关值，以及为每个激活水平产生的碎片/产物离子的类型。

29、该方法可以包括确定为每个激活水平产生的不同碎片或产物离子的相对强度并且将这些相对强度与相应的激活水平相关联。

30、可以通过碰撞诱导解离来执行该碎片化。

31、然而，可以替代地执行其他形式的碎片化。例如，离子可以通过电子俘获离解、电子转移离解或表面诱导离解等被分裂。替代地，离子可以根据任何已知技术与试剂离子或分子反应，以产生产物离子。

32、该方法可以包括使用指纹图谱识别分析物。

33、本发明还提供了一种筛选样品中感兴趣的分析物或感兴趣的特定分析物构象异构体的方法，其包括：提供感兴趣的分析物或构象异构体在用不同激活水平激活后离子迁移率如何变化的第一指纹图谱；对分析物执行上面所描述的方法，以便获得分析物的第二指纹图谱；比较该第一指纹图谱和第二指纹图谱以确定它们是否匹配；并且其中如果确定指纹图谱匹配，则确定感兴趣的分析物或构象异构体存在。

34、提供第一指纹图谱的步骤可以包括对感兴趣的分析物或构象异构体执行上面所描述的方法，以便获得第一指纹图谱。

35、本发明的实施例包括一种鉴定分析物或分析物构象的方法，该方法包括：提供包括已知化合物或相同化合物的已知构象异构体的数据库，其中数据库中的每种化合物或构象异构体都与在用不同激活水平激活后其离子迁移率如何变化的指纹图谱相关联；执行本文描述的方法；将所确定的分析物分子的指纹图谱与数据库中的指纹图谱执行比较，以确定是否匹配；并且其中如果确定所确定的指纹图谱与数据库中的指纹图谱匹配，则分析物分子被识别为数据库中具有匹配指纹图谱的化合物或构象异构体。

36、例如，该方法可以用于确定被分析的样品是否包含两种不同的分析物/成分(例如在特定的质荷比范围内)。如果分析物/成分如上所描述的被分离(例如经由lc)，对应于第一分析物/成分的干净指纹图谱将在分离循环的第一部分期间被检测，对应于第二不同分析物/成分的干净指纹图谱将在分离循环的第二稍后部分期间被检测，并且对应于第一和第二分析物/成分的混合物的指纹图谱将在分离循环的第一部分和第二部分之间的时间期间被检测。因此，此方法可以确定指纹图谱在分离循环中的变化并且使用此变化来对不同分析物/成分的指纹图谱进行去卷积。

37、在上面所描述的方法中，可以对气相离子执行在不同时间使分析物分子的离子经受不同激活水平的步骤。然而，也可以经考虑经考虑在分析物仍处于液相时对分析物执行激活。

38、因此，从第二方面来说，本发明还提供了一种分析离子的方法，其包括：(i)使分析物经受激活，然后电离该分析物以形成分析物离子，其中分析物在不同时间经受不同的激活水平，从而电离产生在不同时间具有不同迁移率的分析物离子，其中激活水平在多个循环中变化，并且其中在循环中的每个期间激活水平在所述不同水平之间变化；(ii)使用离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器来确定所述不同激活水平的离子的迁移率；以及(iii)将确定的迁移率与它们相应的激活水平相关联，从而获得分析物分子的指纹图谱。

39、此方法可以包含上面所描述的与第一方面相关的任何特征，除了其中激活在电离之前执行。

40、该方法可以包括使用第一分离器来分离液体样品中的不同分析物，其中：(a)在第一分离器中分离分析物之前，执行所述使分析物经受激活的步骤；或(b)对从第一分离器洗脱的每种分析物执行步骤(i)至(iii)。

41、第一分离器可以是液相色谱(lc)分离器、尺寸排阻色谱(sec)分离器、离子交换色谱(iex)分离器或毛细管电泳(ce)分离器。

42、例如，可以通过改变包含分析物的样品溶液的温度来激活离子，例如在第一分离器和电离设备之间。可以将样品溶液加热到不同的温度以便执行不同程度的激活，例如使用电阻加热器或电磁加热器，如红外灯或微波加热器。样品溶液可以在加热后冷却。替代地，可以通过改变样品溶液的ph水平来执行激活。例如，可以改变样品溶液的ph值以便通过向样品溶液供应酸或碱来执行不同水平的激活。

43、替代地，可以通过向样品溶液施加剪切应力或机械振动来导致激活并且可以改变机械振动的剪切应力水平，从而改变激活水平。当分析物是蛋白质时，这些技术可能特别有用。

44、本发明的第一方面还提供了一种用于分析离子的仪器，其包括：分离器，用于提供强度随时间变化的分析物分子的离子；位于分离器下游的激活区域，用于激活离子以使它们改变离子的迁移率；位于激活区域下游的离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器；以及控制电路，其被布置并被配置为：(i)控制该仪器，以便在不同的时间使该分析物分子的离子经受不同的激活水平，从而使该离子在所述不同的时间具有不同的迁移率，其中该激活水平在多个循环中变化，并且其中在循环中的每个期间，该激活水平在所述不同的水平之间变化；(ii)控制离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器，以确定所述不同激活水平的离子的迁移率；以及(iii)将确定的迁移率与它们相应的激活水平相关联，从而获得分析物分子的指纹图谱。

45、该仪器可以被配置为执行本文描述的与本发明的第一方面相关的任何方法。

46、本发明的第二方面还提供了一种用于分析离子的仪器，其包括：用于激活分析物的激活设备；位于激活设备下游的离子源，用于电离分析物；位于离子源下游的离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器；以及控制电路，其被布置并被配置为：(i)控制激活设备以使分析物经受激活，并且控制离子源电离所述分析物以形成分析物离子，其中激活设备在不同时间使分析物经受不同的激活水平，从而离子源在不同时间产生具有不同迁移率的分析物离子，其中激活水平在多个循环中变化，并且其中在循环中的每个期间激活水平在所述不同水平之间变化；(ii)控制离子迁移率分离器或扫描离子迁移率过滤器，以确定所述不同激活水平的离子的迁移率；以及(iii)将确定的迁移率与它们相应的激活水平相关联，从而获得分析物分子的指纹图谱。

47、已经描述了这种实施例，其中当离子峰从分离器洗脱时，激活水平在不同值之间循环，以便获得对于所有激活水平具有类似统计精度的指纹图谱。然而，经考虑当离子峰从分离器中洗脱时，质谱仪或迁移率谱仪的其他操作参数可以在不同的值之间循环，以便实现在所有操作参数的值下获得的光谱数据的类似统计精度。

48、因此，从第三方面，本发明还提供了一种分析离子的方法，其包括：向质谱或迁移率仪提供分析物分子的离子，其强度作为峰值随时间变化；随时间改变光谱仪的操作参数，使得峰中的离子在不同时间经受不同条件，其中操作参数在多个循环中变化，并且其中操作参数在循环中的每个期间在不同值之间变化；使用光谱仪对离子进行质量或迁移率分析，以便获得所述操作参数的所述不同值中的每一个的光谱数据；以及对在多个循环中针对操作参数的相同值获得的光谱数据求和，以便获得针对操作参数的值中的每一个的总和光谱数据。

49、由于操作参数在不同的值之间重复循环，因此在分析分析物时，任何给定值都被执行多次。因此，即使分析物离子的强度随时间变化，该方法也能够获得每个强度下不同操作参数值的光谱数据。因此，对于不同的操作参数值获得的光谱数据的统计精度可以基本上相同。

50、可以使用分离器来提供作为峰的离子。分离器可以分离样品中不同的分析物分子，然后这些分离的分析物分子可以在从分离器中洗脱出来时被电离。例如，分离器可以是液相色谱(lc)分离器、气相色谱(gc)分离器、尺寸排阻色谱(sec)分离器、离子交换色谱(iex)分离器或毛细管电泳(ce)分离器。

51、替代地，可以使用分离器根据物理化学特性分离分析物离子并且每种分析物的离子可以作为峰从分离器中洗脱出来。例如，分离器可以是质荷比分离器、质量过滤器、离子迁移率分离器或离子迁移率过滤器。

52、该方法可以包括仅对从峰的一部分中的离子获得的光谱数据求和。

53、该方法可以包括通过当获得总和光谱数据时该值被使用的次数来归一化操作参数的每个值的光谱数据的强度。

54、本文描述的方法可以在单次实验运行期间执行。

55、该方法可以包括在峰值上执行所述多个循环x次，其中x选自由以下组成的组：≥2；≥3；≥4；≥5；≥6；≥7；≥8；≥9；≥10；≥15；≥20；≥25；≥30；≥35；≥40；或≥45。

56、该方法可以包括在选自以下的时间尺度内执行每个循环：≤15s；≤14s；≤13s；≤12s；≤11s；≤10s；≤9s；≤8s；≤7s；≤6s；或5s。

57、在每个循环中，可以有y个所述不同的操作参数的值，其中y选自由以下组成的组：≥2；≥3；≥4；≥5；≥6；≥7；≥8；≥9；或≥10。

58、所述迁移率谱仪可以是差分离子迁移率谱仪，其中施加时变电场以便导致离子在第一方向上的时间平均移动并且施加静电场以便在与第一方向相反的方向上驱动离子，其中随时间变化的该操作参数是静电场的大小。

59、本发明的第三方面还提供了一种用于分析离子的仪器，其包括：分离器，用于提供强度随时间变化的分析物分子的离子；用于确定离子的质荷比或迁移率的质量或迁移率谱仪；以及控制电路，其被布置并被配置为：(i)随时间改变光谱仪的操作参数，使得峰中的离子在不同时间经受不同条件，其中操作参数在多个循环中变化，并且其中操作参数在循环中的每个期间在不同值之间变化；(ii)使用光谱仪对离子进行质量或迁移率分析，以便获得所述操作参数的所述不同值中的每一个的光谱数据；以及(iii)对在多个循环中获得的操作参数的相同值的光谱数据求和，以便获得操作参数的值中的每一个的总和光谱数据。

60、该仪器可以被配置为执行本文描述的与本发明的第三方面相关的任何方法。