膜蛋白质分析用基板、膜蛋白质分析用基板的制造方法、膜蛋白质的分析方法和膜蛋白质分析用网格

本发明涉及膜蛋白质分析用基板、膜蛋白质分析用基板的制造方法、膜蛋白质的分析方法和膜蛋白质分析用网格。本技术根据2020年10月28日申请的日本专利2020-180734号主张优先权，并在本技术中援引其内容。

背景技术：

1、供蛋白质埋入的生物膜典型的是薄的磷脂为双层的“脂质双层膜”。作为现有的平面状的脂质双层膜的形成方法，例如可以举出喷涂法、montal-mueller法、泡囊融合法等(例如、参照专利文献1)。到目前为止，作为使用了脂质双层膜的蛋白质的研究，多为在覆盖基板的孔的脂质双层膜埋入蛋白质，且基于被埋入的蛋白质的离子通道的功能研究。

2、现有技术文献

3、专利文献

4、专利文献1：日本特开2011-167609号公报

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、在结构生物学的领域中，进行蛋白质的结构分析。特别是，关于以已埋入细胞膜那样的生物膜的状态存在且发挥功能的蛋白质的立体结构，在理解这些蛋白质所涉及的生物体反应、药理活性的方面被认为是重要的。因此，已埋入生物膜的状态的蛋白质的结构分析在制药上的应用等产业上的重要性高，研究者对已埋入生物膜的状态的蛋白质的结构进行深入探讨。

3、关于上述的“已埋入生物膜的状态的蛋白质”，以下，将存在于以生物膜为代表的脂质双层膜中或脂质双层膜的表面，并发挥功能的蛋白质称为“膜蛋白质”。膜蛋白质包含以已埋入脂质双层膜的状态存在的“内在膜蛋白(integral membrane protein)”、和与脂质双层膜的表面暂时结合或与内在膜蛋白暂时结合的“外周膜蛋白(peripheral membraneprotein)”。另外，内在膜蛋白包含一部分埋入于脂质双层膜的膜蛋白质和具有贯通脂质双层膜的区域的所谓的“跨膜蛋白”。

4、作为蛋白质的结构分析方法，已知有基于结晶结构分析的方法。但是，基本上通过结晶结构分析无法得到存在于脂质双层膜中或脂质双层膜的表面的状态下的膜蛋白质的结构。因此，为了进行存在于脂质双层膜中或脂质双层膜的表面的膜蛋白质的结构分析，认为使用电子显微镜直接观察存在于脂质双层膜中或脂质双层膜的表面的膜蛋白质而不使其结晶是有效的。

5、作为基于电子显微镜的膜蛋白质的结构分析方法，已知有作为使用电子显微镜的方法的一种的低温电子显微镜法(cryogenic electron microscopy)。在低温电子显微镜法中，在电子显微镜用网格的贯通孔中制作薄玻璃质的冰，观察封闭固定在该冰中的膜蛋白质的试料。作为成为观察对象的膜蛋白质，已知有用表面活性剂增溶的膜蛋白。另外，作为成为观察对象的膜蛋白质，还已知有埋入作为球状的脂质双层膜的脂质体、作为圆盘状的纳米结构体的纳米盘中的膜蛋白质。纳米盘通过用膜骨架蛋白质的带来包围磷脂质双层膜而形成。

6、但是，用表面活性剂增溶的膜蛋白质不一定为具有与以埋入脂质双层膜的状态存在的情况相近的立体结构。另外，在观察脂质体中的膜蛋白质的情况下，为了保持脂质体所需要的冰的厚度厚，而容易使电子显微镜图像的质量下降。进一步，在观察纳米盘中的膜蛋白质的情况下，大到无法保持在纳米盘的膜蛋白质、膜蛋白质复合体不是观察的对象。

7、另外，为了使膜蛋白质保持于脂质体、纳米盘，并进行高分辨率的分析，要求使用大量的膜蛋白质来成为高浓度的试料。但是，由于还大量存在无法准备高浓度试料的膜蛋白质，因此要求即使膜蛋白质的试料为更低浓度且少量也能够获得电子显微镜图像的技术。

8、进一步，特别是将埋入纳米盘的膜蛋白质制备为电子显微镜观察用的试料需要复杂的操作，因此要求比以往更简便地获取电子显微镜图像的技术。

9、本发明就是鉴于这样的情况而作出的，其目的在于提供一种具有保持有膜蛋白质的脂质双层膜的新型的膜蛋白质分析用基板。另外，本发明的目的在于提供一种能够在电子显微镜用网格简便地形成保持于脂质双层膜的膜蛋白质的膜蛋白质分析用基板的制造方法。进一步，本发明的目的还在于提供一种使用了膜蛋白质分析用基板的膜蛋白质的分析方法。另外，本发明的目的在于提供一种新型的膜蛋白质分析用网格，其具有覆盖电子显微镜用网格的支承膜的孔的脂质双层膜。

10、用于解决技术问题的方案

11、为了解决上述技术问题，本发明的一方式包含以下方式。

12、[1]一种膜蛋白质分析用基板，其中，具有：具有多个贯通孔的电子显微镜用网格；覆盖所述多个贯通孔的至少一个而设置的脂质双层膜；和保持于所述脂质双层膜的与所述贯通孔平面性重叠的部分的膜蛋白质，所述脂质双层膜具有脂质单分子膜，所述脂质单分子膜在俯视时比所述贯通孔大且附着于所述电子显微镜用网格，并且构成所述脂质双层膜的一部分。

13、[2]根据[1]所述的膜蛋白质分析用基板，其中，构成所述脂质双层膜的一层脂质单分子膜由第一脂质形成，构成所述脂质双层膜的另一层脂质单分子膜由与所述第一脂质不同的第二脂质形成。

14、[3]根据[1]所述的膜蛋白质分析用基板，其中，构成所述脂质双层膜的两个脂质单分子膜由相同的脂质形成。

15、[4]根据[2]或[3]所述的膜蛋白质分析用基板，其中，所述电子显微镜用网格的表面为疏水性，构成所述脂质双层膜的一层脂质单分子膜覆盖所述电子显微镜用网格的第一面，构成所述脂质双层膜的另一层脂质单分子膜覆盖所述电子显微镜用网格的第二面，所述一层脂质单分子膜和所述另一层脂质单分子膜在所述贯通孔的内部中结合而形成所述脂质双层膜，并覆盖所述贯通孔。

16、[5]根据[3]所述的膜蛋白质分析用基板，其中，所述电子显微镜用网格的表面为疏水性，构成所述脂质双层膜的一层脂质单分子膜覆盖所述电子显微镜用网格的单面，构成所述脂质双层膜的另一层脂质单分子膜离散地设于多个所述贯通孔的内部，所述一层脂质单分子膜和所述另一层脂质单分子膜在所述贯通孔的内部中结合而形成所述脂质双层膜，并覆盖所述贯通孔。

17、[6]根据[2]或[3]所述的膜蛋白质分析用基板，其中，所述电子显微镜用网格的表面为亲水性，所述脂质双层膜从所述电子显微镜用网格的单面覆盖所述贯通孔。

18、[7]一种膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，具有：在具有多个贯通孔的电子显微镜用网格的第一面设置第一脂质的单分子膜的工序；在所述电子显微镜用网格的第二面设置第二脂质的单分子膜，并形成所述第一脂质的单分子膜与所述第二脂质的单分子膜结合而成的脂质双层膜的工序；和使膜蛋白质保持于所述脂质双层膜的工序，在设置所述第一脂质的单分子膜的工序中，由所述第一脂质的单分子膜从所述第一面的一侧覆盖所述多个贯通孔，在形成所述脂质双层膜的工序中，利用所述第二脂质的单分子膜从所述第二面的一侧覆盖所述多个贯通孔，所述第一脂质的单分子膜与所述第二脂质的单分子膜在所述多个贯通孔的内部中结合而形成所述脂质双层膜。

19、[8]根据[7]所述的膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，设置所述第一脂质的单分子膜的工序包含使所述第一面与在第一溶液的液面形成的所述第一脂质的单分子膜接触的步骤。

20、[9]根据[7]或[8]所述的膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，设置所述第二脂质的单分子膜的工序包含使所述第二面与在第二溶液的液面形成的所述第二脂质的单分子膜接触的步骤。

21、[10]根据[9]所述的膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，在保持所述膜蛋白质的工序中，将所述膜蛋白质追加至所述第二溶液，所述膜蛋白质从所述第二溶液移动到所述脂质双层膜并保持于所述脂质双层膜。

22、[11]根据[10]所述的膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，在保持所述膜蛋白质的工序中，在将通过表面活性剂而增溶于缓冲液的所述膜蛋白质追加至所述第二溶液之后，将所述表面活性剂的吸附材料追加至所述第二溶液，从而从所述第二溶液去除所述表面活性剂。

23、[12]一种膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，具有：使具有多个贯通孔的电子显微镜用网格的单面与在溶液的液面形成的脂质单分子膜接触，从而在所述多个贯通孔的内部形成脂质双层膜的工序；和将膜蛋白质追加至所述溶液，从而使所述膜蛋白质保持于所述脂质双层膜的工序，在形成所述脂质双层膜的工序中，将所述脂质单分子膜转印到所述单面，由所述脂质单分子膜从所述单面的一侧覆盖所述多个贯通孔，所述脂质单分子膜在所述多个贯通孔的内部中形成自堆积而成的脂质双层膜，在保持所述膜蛋白质的工序中，所述膜蛋白质从所述溶液移动到所述脂质双层膜并保持于所述脂质双层膜。

24、[13]根据[12]所述的膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，在追加所述膜蛋白质的工序中，在将通过表面活性剂而增溶于缓冲液的所述膜蛋白质追加至所述溶液后，将所述表面活性剂的吸附材料追加至所述溶液，从而从所述溶液去除所述表面活性剂。

25、[14]一种膜蛋白质分析用基板的制造方法，其中，具有：形成保持有膜蛋白质的脂质双层膜的工序；和将保持有所述膜蛋白质的所述脂质双层膜移至具有多个贯通孔的电子显微镜用网格的单面的工序，在移至所述单面的工序中，以覆盖所述贯通孔的整体的姿势使所述脂质双层膜与所述单面接触。

26、[15]一种膜蛋白质的分析方法，其中，包含用电子显微镜观察[1]～[6]中任一项所述的膜蛋白质分析用基板所保持的膜蛋白质或者由[7]～[14]中任一项所述的膜蛋白质分析用基板的制造方法制造的膜蛋白质分析用基板所保持的膜蛋白质的工序。

27、[16]根据[15]所述的膜蛋白质的分析方法，其中，还具有在用所述电子显微镜观察的工序之前，对保持于所述脂质双层膜的所述膜蛋白质进行染色的工序。

28、[17]根据[15]或[16]所述的膜蛋白质的分析方法，其中，在所述观察的工序中，通过低温电子显微镜法来观察所述膜蛋白质。

29、[18]一种膜蛋白质分析用网格，其中，具有：具有多个贯通孔的电子显微镜用网格；和覆盖所述多个贯通孔的至少一个而设置的脂质双层膜，构成所述脂质双层膜的一层脂质单分子膜覆盖所述电子显微镜用网格的第一面，构成所述脂质双层膜的另一层脂质单分子膜覆盖所述电子显微镜用网格的第二面，所述一层脂质单分子膜和所述另一层脂质单分子膜在所述贯通孔的内部中结合从而形成所述脂质双层膜，并覆盖所述贯通孔。

30、[19]根据[18]所述的膜蛋白质分析用网格，其中，构成所述脂质双层膜的一层脂质单分子膜由第一脂质形成，构成所述脂质双层膜的另一层脂质单分子膜由与所述第一脂质不同的第二脂质形成。

31、[20]根据[18]所述的膜蛋白质分析用网格，其中，构成所述脂质双层膜的两个脂质单分子膜由相同的脂质形成。

32、发明效果

33、根据本发明，能够提供一种具有保持了膜蛋白质的脂质双层膜的新型的膜蛋白质分析用基板。另外，能够提供一种能够在电子显微镜用网格简便地形成保持于脂质双层膜的膜蛋白质的膜蛋白质分析用基板制造方法。进一步，能够一种提供使用了膜蛋白质分析用基板的膜蛋白质的分析方法。另外，能够提供一种新型的膜蛋白质分析用网格，其具有覆盖了电子显微镜用网格的支承膜的孔的脂质双层膜。