测定B族维生素和它们的同效维生素的方法与流程

本公开涉及用于测定b族维生素和它们的同效维生素的方法。更具体地，该技术涉及经由已经用惰性材料层修改的液相色谱(lc)系统和柱分析b族维生素和它们的同效维生素，例如，lc系统和柱的内部金属表面已经用沉积的惰性材料修改。

背景技术：

1、液相色谱(lc)是一种分析分离技术，其能够基于混合物的化合物与固定相之间的差异相互作用(定义为主要相互作用)来分离化学物质的混合物，该主要相互作用是混合物、设计的固定相与来自具体选择的流动相/环境条件的调节之间的预期相互作用。这些相互作用取决于许多受控变量，例如流动相组成、温度和流速。

技术实现思路

1、某些分析物与液相色谱流动路径中的金属表面之间的强相互作用可能导致差的色谱峰形、严重的分析物损失、不一致的峰响应以及lc中的其他问题，这导致结果不准确。为了减少这些相互作用的影响，通常需要变通方法或方法中的附加步骤，这增加了方法的复杂性并降低了实验室生产率。

2、因此，需要进行持续的努力，以减少分析物与金属色谱表面的螯合和次级色谱相互作用，从而有利于具有较高分辨率的色谱分离。另外，化合物分离和检测的可变性可以由许多因素引起。一种此类因素是化合物与分析柱的分析物/表面相互作用。此类相互作用可能是有问题的，尤其是在非常低的分析物浓度下。这对于b族维生素和它们的同效维生素也是如此。

3、在基于液相色谱的分离中，金属敏感分析物与分散在整个金属表面的活性位点的次级相互作用或吸附通常给分离带来挑战。已观察到液相色谱(lc)中金属离子介导的吸附是导致峰形不佳、拖尾和敏感分析物回收率降低的因素。为了解决金属流体系统中的分离遇到的问题，已经开发了使用涂层的柱硬件来限定低结合表面(lbs)。

4、在lc中使用lbs可提供减轻分析物与金属表面的相互作用的有效解决方案。一个示例是使用lbs通过与串联四极质谱联用的液相色谱(lc-ms/ms)来分析b族维生素。b族维生素是正常人体代谢和生理功能所必需的微量营养素。它们无法在体内以足够的量合成以满足生理学要求。饮食中丰富的维生素供应对于人体的生长和健康是重要的。通常在食品中富集或强化b族维生素。在食品制造过程中，通常需要测定食品中的b族维生素。与常规系统和柱相比，具有lbs的系统可增强lc性能。当使用lbs时，更好的峰形、增加的响应、更高的灵敏度和无分析物遗留是一些潜在的益处。

5、例如，在lc系统和柱中使用lbs与b族维生素和它们的同效维生素可以帮助增加峰面积(强度)，减少b族维生素的峰拖尾和峰宽(峰形)，这可获得更好的响应因子和检测灵敏度。在lc系统和柱中使用lbs还可以帮助减少b族维生素的潜在遗留问题。并且，在大量使用(诸如170次注入)后，与没有lbs的构型相比，lbs构型对于一些b族维生素(诸如硫胺素、生物素、烟酸和5mthf)仍可表现出较高的响应因子(>150％)。

6、使用lbs与b族维生素的益处因化合物而异。经历与lbs系统相关的益处的b族维生素化合物中的一些b族维生素化合物包括黄素单核苷酸、硫胺素、硫胺素焦磷酸、5'-磷酸吡哆醛和泛酸。

7、针对任何b族维生素都没有观察到与使用lbs相关联的负面影响。具体地，lbs涂覆的硬件似乎不会对色谱性能或b族维生素的回收率产生不利影响。例如，如本文所讨论的，在大量使用(诸如170次注入)后，与没有lbs的构型相比，lbs构型对于一些分析物(诸如b族维生素和它们的同效维生素)仍可表现出较高的响应因子(>150％)。

8、此外，可以通过使用本公开的技术来增加样品吞吐量。可以通过减少峰拖尾和增加的分辨率来增加样品吞吐量。例如，如果杂质与天然峰紧密洗脱并且天然峰表现出一定程度的拖尾，则用户(例如，分析员)可以尝试延长梯度或运行时间，以将杂质分辨到有利于准确量化的峰之间可接受的分辨率。在不存在拖尾时，用户可以通过在梯度中使用更陡的斜率来缩短运行时间。这可以有效地更快、更紧密地一起洗脱所有物质。峰之间的分辨率虽然减小，但是对于感兴趣分析物仍然可能是足够的，因为不存在拖尾来干扰积分或引起共洗脱。在峰拖尾减少的情况下，可以通过能够看到先前由峰拖尾覆盖的峰来检测新的痕量物质。

9、峰之间的增加的分辨率或更多时间可以允许用户以增加的吞吐量运行更快的方法。如果分辨率已经增加，则峰容量增加意味着更多的峰可以在同一色谱图中拟合，或者如果将感兴趣的临界对开始充分地分辨，则可以以分辨率和峰容量为代价运行更快的分离。

10、已经设计了结合有本公开的涂层的色谱柱来使化合物(诸如具有包含b族维生素和它们的同效维生素的化合物)的阴性分析物/表面相互作用最小化。用于减轻这些相互作用的现有技术，诸如用硝酸进行系统钝化，是耗时的并且仅产生临时性的性能增益。很难确定系统何时完全钝化并且准备好操作。如果尝试在达到完全钝化之前获得定量研究的数据，则不会检测到校准曲线的下端，因为分析物仍然具有其可以结合的金属表面。

11、色谱系统的流动路径的表面区域上的lbs(诸如具有烷基甲硅烷基涂层的表面)可使b族维生素(包括它们的同效维生素)与色谱流动路径的金属表面(例如柱内壁、管材内部、熔块表面、样品注射器等)之间的相互作用最小化。因此，涂覆的金属表面改善了b族维生素和它们的同效维生素的液相色谱分离。在金属流动路径上使用烷基甲硅烷基涂层允许使用金属色谱流动路径，这些金属色谱流动路径能够承受快速流速下的高压、使用具有小颗粒的固定相(也可以是缓慢流动)产生的高压和从较长柱床产生的高压，同时使b族维生素与金属之间的次级色谱相互作用最小化。由高压材料制成并且用涂层修改的这些部件可以被定制成使得内部流动路径减少次级色谱相互作用。涂层覆盖暴露于流体路径的金属表面。

12、在一个方面，本公开涉及一种分离和分析金属敏感样品的方法。该方法包括将该金属敏感样品注入到色谱系统中，其中该色谱系统包括具有低结合表面涂层的金属流动路径；使金属敏感样品流动通过色谱系统；分离该金属敏感样品，其中该金属敏感样品包含一种或多种b族维生素和/或b族维生素同效维生素；以及通过使所分离的金属敏感样品通过质谱仪来分析所分离的样品。在一些实施方案中，该样品包含两种或更多种b族维生素和/或b族维生素同效维生素，并且分析所分离的样品包括同时分析该两种或更多种b族维生素和/或b族维生素同效维生素以确定该样品中存在的该b族维生素和/或b族维生素同效维生素。在一些实施方案中，该方法包括，在将该金属敏感样品注入到该色谱系统之前，从一种或多种样品基质中提取该金属敏感样品。在一些实施方案中，从一种或多种样品基质中提取该金属敏感样品包括针对不同b族维生素的单独样品制备。在一些实施方案中，使该金属敏感样品流过该色谱系统包括使用单液相色谱方法来测定该b族维生素和/或b族维生素同效维生素。在一些实施方案中，使用该单液相色谱方法包括使用液相色谱-质谱(lc/ms)。在一些实施方案中，该液相色谱-质谱(lc/ms)是串联四极质谱仪(lc-ms/ms)。在一些实施方案中，b族维生素或b族维生素同效维生素包括以下中的至少一者：核黄素(b2)、黄素单核苷酸(fmn)、生物素、烟酸(b3)、烟酰胺(b3)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、吡哆素(b6)、吡哆醛(b6)、5'-磷酸吡哆醛(plp)、硫胺素(b1)、硫胺素焦磷酸(tpp)、叶酸(b9)、泛酸(b5)或5-甲基-四氢叶酸(5mthf)。在一些实施方案中，样品是饮食补充剂或能量饮料。

13、在一个方面，本公开涉及一种分离和分析金属敏感样品的方法。该方法包括将该金属敏感样品注入到色谱系统中，其中该色谱系统包括具有涂层的金属流动路径；使金属敏感样品流动通过色谱系统；分离该金属敏感样品，其中该金属敏感样品包含两种或更多种b族维生素和/或b族维生素同效维生素；以及同时分析所分离的样品中的该两种或更多种b族维生素和/或b族维生素同效维生素。在一些实施方案中，涂层为低结合表面涂层。在一些实施方案中，分析所分离的样品包括使所分离的金属敏感样品通过质谱仪。在一些实施方案中，该方法包括，在将该金属敏感样品注入到该色谱系统之前，从一种或多种样品基质中提取该金属敏感样品。在一些实施方案中，从一种或多种样品基质中提取该金属敏感样品的该方法包括针对不同b族维生素和/或b族维生素同效维生素的单独样品制备。在一些实施方案中，使该金属敏感样品流过该色谱系统包括使用单液相色谱方法来测定该b族维生素和/或b族维生素同效维生素。在一些实施方案中，该单液相色谱方法包括使用液相色谱-质谱(lc/ms)。在一些实施方案中，该液相色谱-质谱(lc/ms)是串联四极质谱仪(lc-ms/ms)。在一些实施方案中，b族维生素或b族维生素同效维生素包括核黄素(b2)、黄素单核苷酸(fmn)、生物素、烟酸(b3)、烟酰胺(b3)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、吡哆素(b6)、吡哆醛(b6)、5'-磷酸吡哆醛(plp)、硫胺素(b1)、硫胺素焦磷酸(tpp)、叶酸(b9)、泛酸(b5)或5-甲基-四氢叶酸(5mthf)。在一些实施方案中，样品是饮食补充剂或能量饮料。

14、本公开的上述方面和特征提供了优于现有技术的多种优点。在一些实施方案中，在柱上结合涂层存在多种益处。例如，本公开示出lc柱和系统性能在峰强度、峰形、遗留和响应因子方面的改进。本公开包括用于测定能量饮料和饮食补充剂中的b族维生素的方法。