一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器及其制备方法和应用

1.本发明属于食品安全检测领域，尤其是公开了一种用于食源性致病菌检测的广谱特异性sers生物传感器及其制备和应用。


背景技术：

2.食源性微生物是影响食品安全的主要病原体，可以通过污染食物引起人类疾病甚至死亡，这不仅是对公众健康的持续威胁，也是全世界社会经济发展的重大障碍。食源性致病菌是全世界三分之二的人类食源性疾病的病原体，近年来，食源性致病菌导致的食品安全事件频发，由此带来的食品安全问题越来越成为国内外关注的重点。然而，食品的微生物安全是一个动态情况，受到从农场到餐桌的整个食物链的多重因素的影响，因此必须建立健全科学、准确、快速的食源性致病菌检测技术，以保障食品安全，预防和控制食源性致病菌中毒事件发生。
3.随着纳米技术的迅速发展，几种光学检测技术为食源性病原体的检测开辟了新的途径。拉曼光谱是一种空间分辨率高、极水振动干扰小的散射光谱技术，在生物传感和生物成像领域具有广阔的应用前景。由于许多样品本身的致病菌信号强度较低，且荧光背景明显，使得对分析物的拉曼信号监测异常困难。表面增强拉曼光谱(sers)是将拉曼光谱与基于金属纳米材料的纳米技术相结合的一种光谱技术，可以极大地克服低信号和荧光干扰的局限性，已经被广泛用于食源性致病菌的检测研究。但是，目前绝大多数病原菌的sers传感器制备过程复杂，成本较高，难以用于大规模推广应用。而且，现有的食源性致病菌sers 生物传感器大都针对单一的食源性致病菌，不具有检测广谱性，且传感器仅能基于光谱仪进行数据采集。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器及其制备和应用，本发明将固相柔性衬底与表面增强纳米材料相结合得到双信号生物传感器，该传感器尺寸可控，厚度均匀，柔性，基于拉曼信号可以实现高灵敏度的检测，在检测精度需求较小的场合中可直接通过肉眼判别菌浓度。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
6.一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器制备方法，包括：
7.s1，制备固相柔性sers基底，将可广谱性识别食源性致病菌的识别分子修饰在固相柔性sers基底表面，得到sers生物传感器的捕捉元件；所述食源性致病菌的识别分子选用万古霉素；
8.s2，首先在金属纳米材料上修饰4-巯基苯甲酸，基于硅酸钠水解在金属纳米材料表面包覆一层硅壳；然后加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液(aptes)中，得到氨基改性的金属纳米材料，然后将氨基改性的金属纳米材料放入氰脲酰氯溶液中搅拌，再将适配体溶液
加入，搅拌后，离心，得到sers生物传感器的信号元件。
9.进一步，所述固相柔性衬底包括但不限于聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯 (pmma)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯(pe)或透明胶带；用柔性衬底作为拉曼基底，使得sers生物传感器可以随意弯曲而不易断裂，柔性衬底的前后两侧皆可修饰拉曼信号，适用于各种检测平面。
10.进一步，根据识别分子的类型，采用相应的化学修饰方法将识别分子修饰在固相柔性 sers基底表面。
11.进一步，所使用的食源性致病菌识别分子包括但不限于抗生素，广谱性适配体以及硼酸类化合物；所述识别分子对食源性致病菌具有广谱性识别作用，具有良好的富集作用。
12.进一步，所述s2金属纳米粒子选用单金属结构，或多金属杂化结构，所述金属纳米材料的金属元素包含但不限于金、银或铜。
13.进一步，多金属杂化结构包括但不限于异质结构、核壳结构、合金结构和空心结构；
14.进一步，金属纳米粒子选用金银硅核壳壳结构，所述4-巯基苯甲酸作为信号探针嵌入银壳与硅壳之间。
15.进一步，基于柠檬酸钠还原法合成金银核壳纳米粒子，将金银核壳纳米粒子溶液与4
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巯基苯甲酸溶液在常温下混合20～45min，然后将金银核壳纳米粒子离心并与1～2mm的 aptes混合20～45min，再次洗出加入0.4～0.6％硅酸钠溶液中，在80～100℃下反应4～ 6h，最终形成嵌有4-巯基苯甲酸的金银硅核壳壳纳米材料。
16.进一步，在连接有信号分子的金属纳米粒子上交联适配体，首先基于3-氨基丙基三乙氧基硅烷对金属纳米粒子表面进行改性，在金属纳米粒子表面接枝氨基基团，其次基于氨基与酰氯基团的交联在外部接枝氰脲酰氯，氰脲酰氯基于相同的基团反应将氨基修饰的适配体连接在纳米粒子表面，从而增加适配体交联在纳米粒子表面数量，增强纳米粒子对食源性致病菌特异性识别的能力。
17.一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器，采用上述方法制备。
18.一种食源性致病菌检测方法，采用上述双信号生物传感器进行检测，其包含以下步骤：
19.s1，制备食源性致病菌标准液，采用双信号生物传感器检测食源性致病菌标准液并建立颜色与拉曼信号特征值的标准曲线；
20.s2，对待测物进行预处理获得待测菌液，将待测菌液与本发明构建的捕捉元件和信号元件1：1共同混合，取出后记录固相柔性sers基底的颜色特性以及拉曼特征信号值，与建立的标准曲线对照，获得待测菌液浓度；
21.进一步，食源性致病菌标准液的制备过程为：将菌粉溶于菌落液体培养基中活化至少两次，离心后将沉淀溶于生理盐水中，稀释后平板计数取得原始菌液浓度，梯度稀释后用于测量。将梯度稀释的菌液与捕捉元件孵育0.5～1h后，再与信号原件孵育0.5～1h，在目标菌存在的情况下，捕捉元件与信号元件皆与目标菌结合，即可在捕捉元件(即柔性衬底) 上检测到信号分子的拉曼特征信号峰以及颜色变化。以菌液浓度的对数值作为横坐标，信号分子拉曼特征信号峰强度或颜色变化为纵坐标，建立标准曲线。
22.有益效果：
23.1、本发明基于柔性衬底为sers基底，使得该传感器尺寸可控，厚度均匀，可大规模生产。此外，透明衬底的使用使得反应后颜色变化更为明显，为菌落浓度可视化创造了先决条件。本发明省去了传统的sers基底在柔性基底上沉积金属纳米粒子的制作条件，直接修饰食源性致病菌捕捉分子。捕捉元件与信号元件可特异性识别待测菌从而形成三明治夹心结构，金属纳米具有色彩的且包含拉曼信号分子的纳米粒子将层积在柔性基底上，不仅产生颜色变化，也可产生拉曼信号。实现双信号检测的目的。该柔性传感器具有良好的透明性、耐热性和便携性，且价格低廉，尺寸可控，厚度均匀，负载其表面的广谱性识别分子均匀稳定，可用于长期保存和实现原位检测。
24.2、本发明将光谱性食源性致病菌识别分子与适配体相结合，考虑到适配体的不稳定性 (尤其是暴露在空气中)，可以有效延长固相捕捉基底的储藏期。此外，将适配体与液态纳米粒子相结合，可以保证传感器的特异性。
25.3、本发明中提及的纳米粒子由硅壳包覆，这主要由于硅层的水溶性较好，硅壳的形成可以有效的防止银壳的氧化，提高纳米离子的稳定性，防止团聚，保护信号分子，阻碍纳米粒子与待测菌直接接触，提高了纳米粒子的生物相容性。该纳米粒子具有较高的生物相容性，分散性及传感器性能。此外，硅壳的形成使得氨基的修饰更加简便，有利于适配体与纳米粒子交联。
26.4、本研究所构建的适配体修饰的纳米材料，可特异性捕捉待测菌。基于氰脲酰氯这种稳定、价格低廉且易于处理的试剂，使得适配体更易交联在硅壳的表面，形成核酸适配体修饰的纳米材料，且这种结构有效降低了纳米材料因适配体的结合而导致的不稳定性。
27.5、本研究提出了一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器及其制备方法和应用，当体系中存在待测菌时，待测菌同时结合在捕捉元件与信号元件上形成三明治夹心结构，实现信号分子的sers信号放大。该传感器操作简单，检测时间短，可用于原位检测。
28.6、本发明构建的特异性检测体系，不仅具体优化设计的三明治式sers生物传感体系，对食源性致病菌具有强的拉曼信号放大，对于检测精度要求不高的场合下，可直接通过肉眼识别待测物物中的待测菌浓度。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一项实施实例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明实施例中食源性致病菌检测的双信号生物传感器的构建以及原理图；
31.图2为实施例中制备的4-巯基苯甲酸嵌入的au@ag@sio2粒子的透射电镜图；
32.图3为实施例中pdms的表征图；
33.其中，a为万古霉素，pdms和万古霉素接枝的pdms的紫外图，b为氨基化前后 pdms表面的静态接触角；
34.图4为实施例中检测不同浓度金黄色葡萄球菌获得的不同颜色的
35.图5为实施例中检测不同浓度金黄色葡萄球菌建立的sers强度标准曲线；
36.其中，a为检测不同浓度金黄色葡萄球菌的传感器拉曼信号图；b为以金黄色葡萄球菌浓度对数值和传感器在1066cm-1
处的sers强度信号特征值建立的标准曲线。
具体实施方式
37.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
38.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
39.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
40.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
41.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
42.本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。
43.本技术以以下几种食源性致病菌为例进行说明不限于以下几种：金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡状芽孢杆菌，同时基于不同的食源性致病菌采用不同的适配体。上述食源性致病菌对应的适配体皆需氨基化修饰，以便更好的接枝在氰脲酰氯接枝的纳米粒子表面。不同食源性致病菌适配体序列号已被广泛研究，本发明采用已发表的食源性致病菌适配体序列号构建该生物传感器。
44.图1为本发明三明治式sers柔性生物传感器的制备和s.aureus检测的原理图；
45.实施例1
46.一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器的制备方法，包括：
47.参照图1和图3，采用万古霉素作为致病菌识别分子，以pdms作为传感器柔性衬底，具体步骤为：将pdms薄膜在食人鱼溶液中静置1～2min，清洗后放入5％～7％的aptes 溶液中，在85℃～95℃中反应1～3h。继而将pdms取出并使用ph＝7.4的pbs缓存溶液冲洗至少三次，放入5～15μg/ml的万古霉素溶液中，混合1～3h，得到sers生物传感器的捕捉元件；
48.参照图2，基于柠檬酸钠还原法合成金银核壳纳米粒子，将纳米粒子溶液与4-巯基苯甲酸溶液在常温下混合20min，然后将纳米粒子离心并与1mm的aptes混合20min，再次洗出加入0.4硅酸钠溶液中，在80下反应4h，最终形成嵌有4-巯基苯甲酸的金银硅核壳壳纳米材料，包硅后的纳米粒子在0.1mm aptes中静置至少5h，然后与3mm氰脲酰氯混合3-6h后，清
洗，加入适配体溶液，在室温下轻微搅拌过夜得到sers生物传感器的信号元件；本发明中纳米粒子基于离心的方法清洗，是用乙醇和水反复离心至少三次，离心转速为5000～8000rpm，时间为5～10min。
49.实施例2
50.一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器的制备方法，包括：
51.采用万古霉素作为广谱性致病菌识别分子，以pmma作为传感器柔性衬底，具体步骤为：将pmma薄膜在食人鱼溶液中静置1.5min，清洗后放入6％的aptes溶液中，在90℃中反应2h。继而将pdms取出清洗，放入10μg/ml的万古霉素溶液中，混合2h，得到sers 生物传感器的捕捉元件；
52.基于柠檬酸钠还原法合成金银核壳纳米花，将纳米粒子溶液与4-巯基苯甲酸溶液在常温下混合35min，然后将纳米粒子离心并与1.5mm的aptes混合35min，再次洗出加入 0.5％硅酸钠溶液中，在90℃下反应5h，最终形成嵌有4-巯基苯甲酸的金银硅核壳壳纳米材料，包硅后的纳米粒子在0.1mm aptes中静置至少5h，然后与3mm氰脲酰氯混合3-6h 后，清洗，加入适配体溶液，在室温下轻微搅拌过夜得到sers生物传感器的信号元件；
53.实施例3
54.一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器的制备方法，包括：
55.采用万古霉素作为广谱性致病菌识别分子，以pet作为传感器柔性衬底，具体步骤为：将pet薄膜在食人鱼溶液中静置2min，清洗后放入7％的aptes溶液中，在95℃中反应 3h。继而将pdms取出清洗，放入15μg/ml的万古霉素溶液中，混合3h，得到sers生物传感器的捕捉元件；
56.基于柠檬酸钠还原法合成金纳米粒子，将纳米粒子溶液与4-巯基苯甲酸溶液在常温下混合45min，然后将纳米粒子离心并与2mm的aptes混合45min，再次洗出加入0.6％硅酸钠溶液中，在100℃下反应6h，最终形成嵌有4-巯基苯甲酸的金银硅核壳壳纳米材料，包硅后的纳米粒子在0.1mm aptes中静置至少5h，然后与3mm氰脲酰氯混合6h后，清洗，加入适配体溶液，在室温下轻微搅拌过夜得到sers生物传感器的信号元件；
57.实施例4
58.利用食源性致病菌检测的双信号生物传感器检测金黄色葡萄球菌
59.参照图4和图5，将金黄色葡萄球菌菌粉溶于菌落液体培养基中活化至少两次，离心后将沉淀溶于生理盐水中，稀释后平板计数取得原始菌液浓度，梯度稀释后用于测量。将梯度稀释的菌液与捕捉元件孵育0.5h后，再与信号原件孵育0.5h，在目标菌存在的情况下，捕捉元件与信号元件皆与目标菌结合，即可在捕捉元件(即柔性衬底)上检测到信号分子的拉曼特征信号峰以及颜色变化。以菌液浓度的对数值作为横坐标，信号分子拉曼特征信号峰强度或颜色变化为纵坐标，建立标准曲线。
60.对待测物进行预处理获得待测菌液，将待测菌液与本发明构建的捕捉元件和信号元件共同混合，取出后记录柔性衬底的颜色特性以及拉曼特征信号值，与建立的标准曲线对照，获得待测菌液浓度；
61.实施例5
62.利用食源性致病菌检测的双信号生物传感器检测单增李斯特菌
63.将单增李斯特菌菌粉溶于菌落液体培养基中活化至少两次，离心后将沉淀溶于生
理盐水中，稀释后平板计数取得原始菌液浓度，梯度稀释后用于测量。将梯度稀释的菌液与捕捉元件孵育0.7h后，再与信号原件孵育0.7h，在目标菌存在的情况下，捕捉元件与信号元件皆与目标菌结合，即可在捕捉元件(即柔性衬底)上检测到信号分子的拉曼特征信号峰以及颜色变化。以菌液浓度的对数值作为横坐标，信号分子拉曼特征信号峰强度或颜色变化为纵坐标，建立标准曲线。
64.对待测物进行预处理获得待测菌液，将待测菌液与本发明构建的捕捉元件和信号元件共同混合，取出后记录柔性衬底的颜色特性以及拉曼特征信号值，与建立的标准曲线对照，获得待测菌液浓度；
65.实施例6
66.利用食源性致病菌检测的双信号生物传感器检测蜡状芽孢杆菌
67.将蜡状芽孢杆菌菌粉溶于菌落液体培养基中活化至少两次，离心后将沉淀溶于生理盐水中，稀释后平板计数取得原始菌液浓度，梯度稀释后用于测量。将梯度稀释的菌液与捕捉元件孵育1h后，再与信号原件孵育1h，在目标菌存在的情况下，捕捉元件与信号元件皆与目标菌结合，即可在捕捉元件(即柔性衬底)上检测到信号分子的拉曼特征信号峰以及颜色变化。以菌液浓度的对数值作为横坐标，信号分子拉曼特征信号峰强度或颜色变化为纵坐标，建立标准曲线。
68.对待测物进行预处理获得待测菌液，将待测菌液与本发明构建的捕捉元件和信号元件共同混合，取出后记录柔性衬底的颜色特性以及拉曼特征信号值，与建立的标准曲线对照，获得待测菌液浓度。
69.以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。