一种利用HPLC检测蛋黄中α-香附酮的富集量的方法

一种利用hplc检测蛋黄中
α-香附酮的富集量的方法
技术领域
1.本发明涉及食品技术领域，具体为一种利用hplc检测蛋黄中α-香附酮的富集量的方法。


背景技术：

2.随着现代社会的高速发展，人们逐渐提高了对生活品质的要求，人类健康成为了关注热点，食品开发更偏向于有益健康的方向。近年来，研究食品的主要成分，研发并生产功能性食品，特别是保健食品(目前在国际上食品研究的热点趋向于保健品)，尤其是从天然资源环境中寻找新的原料开拓研发新型的功能性食品方面的成果极其短缺。
3.鸡蛋作为普通生活中的必需品，不仅物美价廉、产量高、安全性强，还营养丰富。肉蛋奶作为目前国内主要消耗品，该市场竞争尤为激烈，导致蛋鸡产业开始功能性开发，使得鸡蛋在原有基础上有了新的功效。功能性鸡蛋除营养丰富、味美及保护视力、减肥外，还能调节人体的生理功能。
4.在众多国内外的研究和实践中发现，通过向蛋鸡饲料中添加特定微量元素、中草药添加剂、维生素以及一些酶制剂等，可获得比普通市售的鸡蛋附加价值更高的富含活性物质的功能性鸡蛋，如高碘蛋、高锌蛋、富硒蛋、低胆固醇高卵磷脂蛋以及中草药富集蛋等。
5.除本身的营养丰富外，鸡蛋还可作为天然生物反应器，国外研究制备了高效免疫蛋，其生产方法是利用母体免疫形式，即家禽在卵中储存免疫因子，为后代提供免疫保护。科学家通过用带有人类常见病原体刺激母鸡产卵，使其产生含有抗该病原体抗体的卵，然后人类可以通过食用这些功能蛋获得一定的免疫力，但其制造困难在于不能给母鸡太多刺激抗体，否则母鸡会有生命威胁；此外所得抗体可能是特异的、非特异的或者获得抗体的质量也会下降，并没有我们在饲料中添加中草药的方法方便有效，所以研究具有这些功能性的鸡蛋有极大的意义。
6.近年来，由于受研究手段及传统思维束缚，人们对于中草药在动物科学方向研究多注重对动物生理方面的影响，且都以复方制剂形式添加，产品富集方向研究较少。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种利用hplc检测蛋黄中α-香附酮的富集量的方法，以解决上述背景技术中提出的由于受研究手段及传统思维束缚，人们对于中草药在动物科学方向研究多注重对动物生理方面的影响，且都以复方制剂形式添加，产品富集方向研究较少的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用hplc检测蛋黄中α-香附酮的富集量的方法，该利用hplc检测蛋黄中α-香附酮的富集量的方法包括如下步骤：
9.s1：溶液制备：利用甲醇对香附酮标准品进行溶解稀释，制得α-香附酮标准品溶液；
10.s2：水煮处理：利用蒸馏水对鸡蛋进行水煮，水煮过程中添加提前泡好的香附；
11.s3：皂化：将煮好的鸡蛋的蛋黄与蛋清分离，准确称取蛋黄，对其进行皂化；
12.s4：提取：在皂化后的样品内添加石油醚，制取石油醚提取液；
13.s5：浓缩：在石油醚提取液中添加甲醇进行溶解，制得浓缩液，提取溶液进行过滤冷藏，待高效液相色谱分析；
14.s6：检测试验：取α-香附酮标准品溶液和浓缩液进行专属性、线性关系、精密度以及重复性试验。
15.优选的，所述步骤s1中的溶液制取包括如下步骤：向香附酮标品中加入少量甲醇溶剂，溶解后，用移液枪吸取置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得α-香附酮标准品贮备溶液；精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得α-香附酮标准品溶液。
16.优选的，所述步骤s2中的鸡蛋水煮包括如下步骤：取一颗鸡蛋，3g炮制过的香附粉末，将鸡蛋放入烧杯中，加适量的蒸馏水，加入一定浓度的氯化钠溶液搅拌，水沸腾之后再煮10分钟，鸡蛋煮熟取出来后，过冷水之后，去掉蛋壳，拿牙签或者针，在鸡蛋表面均匀的扎一些小孔，将提前泡好的3g香附放入烧杯中加270ml的水，放入鸡蛋，煮至90ml即可。
17.优选的，所述步骤s3中的皂化过程包括如下步骤：将煮好的鸡蛋的蛋黄与蛋清分离，准确称取蛋黄5.0g，置于150ml、4
×
4宽口的棕色皂化瓶中，向皂化瓶依次加入10％抗坏血酸溶液3ml，50％氢氧化钾溶液5ml和30％的无水乙醇30ml，摇晃均匀后，放入70℃水浴恒温振荡器内，固定，皂化30min，打开振荡开关，为了防止鸡蛋附着在瓶壁上，要不停震荡，皂化完成后，取出皂化瓶后自然冷却或者用冷水冲洗，使瓶冷却至40℃。
18.优选的，所述步骤s4中的提取过程包括如下步骤：冷却后的样品溶液移到250ml的分液漏斗中，分3次加入60ml蒸馏水洗涤皂化瓶，并将所有液体转移到分液漏斗之后，振荡混匀，再加入50ml石油醚，轻摇分液漏斗，防止乳化，静置5分钟，待分层后，转移水相到第2个分液漏斗，再加入50ml石油醚，待分层后把水相转移到第3个分液漏斗，最后一次加入50ml石油醚，静置之后弃去水相，把3次石油醚相混合，用水不停地冲洗石油醚相，用ph试纸检测水层，直到水层ph值不大于7，弃去水层，最后取适量的无水硫酸钠放于大烧杯中，接着加入石油醚提取液，用玻璃棒搅拌后，再用滤纸过滤到一个干燥的烧杯中，用锡纸密封。
19.优选的，所述步骤s5中的浓缩过程包括如下步骤：把装有石油醚提取液的烧杯，放在50℃～60℃水浴上蒸发，等瓶内没有液体的时候，取下烧杯，向烧杯中加入2.0ml甲醇溶解，用取下针头的注射器吸取溶液，通过0.45μm滤膜过滤到1.5ml的棕色液相瓶里，盖上盖子，放入冰箱冷藏，待高效液相色谱分析。
20.优选的，所述检测试验包括专属性试验、线性关系试验、精密度试验以及重复性试验，所述专属性试验包括如下步骤：取α-香附酮标准品溶液一份，3种不同浓度的样品溶液各一份和一个阴性对照品溶液一份，按照试验进行的色谱条件进样测定，做试验专属性检测。
21.优选的，所述线性关系试验包括如下步骤：准确量取标准品储备溶液0.25，0.5，1.5，2.5，3.5ml分别置于25ml容量瓶内，加入甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到一系列质量浓度溶液，用注射器吸取溶液，通过0.45μm有机相滤膜过滤到1.5ml的棕色进样瓶里，盖上盖子，按照试验进行的色谱条件进样，选用色谱柱为agilent c18柱，流动相为甲醇-水(75∶25，v/v)，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，用紫外检测器在249nm处检测，进样量为10μl测
定，记录色谱图和峰面积，以质量浓度为横坐标、对应峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。
22.优选的，所述精密度试验包括如下步骤：取α-香附酮标准品溶液适量，按照上述拟订的色谱条件进样，连续测定5次，记录峰面积，做仪器的精密度检测。
23.优选的，所述重复性试验包括如下步骤：取6g香附试验后的样品溶液，按照相同的色谱条件，进行测定。进样5次，记录峰面积，做试验方法的重复性检测。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过高效液相色谱法可以检测到蛋黄中有α-香附酮的富集，该方法操作简单，结果准确误差小，通过对鸡蛋进行食品加工，提高了鸡蛋的附加值，通过检测蛋黄中α-香附酮的富集量，也为功能性鸡蛋研发提供预试验。
附图说明
25.图1为本发明α-香附酮标准品溶液hplc色谱图；
26.图2为本发明3g香附处理后的样品溶液hplc色谱图；
27.图3为本发明6g香附处理后的样品溶液hplc色谱图；
28.图4为本发明9g香附处理后的样品溶液hplc色谱图；
29.图5为本发明阴性对照品溶液hplc色谱图；
30.图6为本发明α-香附酮标准曲线。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明提供一种利用hplc检测蛋黄中α-香附酮的富集量的方法，通过高效液相色谱法可以检测到蛋黄中有α-香附酮的富集，该方法操作简单，结果准确，误差小，通过对鸡蛋进行食品加工，提高了鸡蛋的附加值，通过检测蛋黄中α-香附酮的富集量，也为功能性鸡蛋研发提供预试验；
33.该利用hplc检测蛋黄中α-香附酮的富集量的方法包括如下步骤：
34.s1：溶液制备：向香附酮标准品中加入少量甲醇溶剂，溶解后，用移液枪吸取置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得α-香附酮标准品贮备溶液；精密量取对照品贮备溶液5ml，置50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得α-香附酮标准品溶液；
35.s2：水煮处理：取一颗鸡蛋，3g炮制过的香附粉末，将鸡蛋放入烧杯瓶中，加适量的蒸馏水，加入一定浓度的氯化钠溶液搅拌，水沸腾之后再煮10分钟，鸡蛋煮熟取出来后，过冷水之后，去掉蛋壳，拿牙签或者针，在鸡蛋表面均匀的扎一些小孔，将提前泡好的3g香附放入烧杯中加270ml的水，放入鸡蛋，煮至90ml即可；
36.s3：皂化：将煮好的鸡蛋的蛋黄与蛋清分离，准确称取蛋黄5.0g，置于150ml、4
×
4宽口的棕色皂化瓶中，向皂化瓶依次加入10％抗坏血酸溶液3ml，50％氢氧化钾溶液5ml的和30％的无水乙醇30ml，摇晃均匀后，放入70℃水浴恒温振荡器内，固定，皂化30min，打开
振荡开关，为了防止鸡蛋附着在瓶壁上，要不停震荡，皂化完成后，取出皂化瓶后自然冷却或者用冷水冲洗，使瓶冷却至40℃；
37.s4：提取：冷却后的样品溶液移到250ml的分液漏斗中，分3次加入60ml蒸馏水洗涤皂化瓶，并将所有液体转移到分液漏斗之后，振荡混匀，再加入50ml石油醚，轻摇分液漏斗，防止乳化，静置5分钟，待分层后，转移水相到第2个分液漏斗，再加入50ml石油醚，待分层后把水相转移到第3个分液漏斗，最后一次加入50ml石油醚，静置之后弃去水相，把3次石油醚相混合，用水不停的冲洗石油醚相，用ph试纸检测水层，直到水层ph值不大于7，弃去水层，最后取适量的无水硫酸钠放于大烧杯中，接着加入石油醚提取液，用玻璃棒搅拌后，再用滤纸过滤到一个干燥的烧杯中，用锡纸密封；
38.s5：浓缩：把装有石油醚提取液的烧杯，放在50℃～60℃水浴上蒸发，等瓶内没有液体的时候，取下烧杯，向烧杯中加入2.0ml甲醇溶解，用取下针头的注射器吸取溶液，通过0.45μm滤膜过滤到1.5ml的棕色液相瓶里，盖上盖子，放入冰箱冷藏，待高效液相色分析，分别选取3g、6g、9g的香附与270ml水混合，将试验鸡蛋放入混合液中煮直至混合液为90ml，称取5g蛋黄进行皂化，提取，浓缩后，采用高效液相色谱(hplc)法记录色谱图，结果见表1；
39.表1不同计量处理后的检测结果
[0040][0041][0042]
s6：检测试验：取α-香附酮标准品溶液一份，3种不同浓度的样品溶液各一份和一个阴性对照品溶液一份，按照试验进行的色谱条件进样测定，做试验专属性检测，按照试验进行的色谱条件进样测定，选用色谱柱为agilent c18柱，流动相为甲醇-水(75∶25，v/v)，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，用紫外检测器在249nm处检测，进样量为10μl，色谱图如图1、2、3、4、5，结果样品色谱图中α-香附酮峰与相邻峰的分离度符合要求，阴性对照品溶液无干扰，表明本试验专属性良好，图1为α-香附酮标准品溶液，在14.557min时出现峰面积，且整个图只出现了一个峰，是单标溶液，图2为样品溶液在13.386min出现峰，在标品出峰的时
间样品有峰面积，说明样品中α-香附酮的存在，图3为样品溶液在13.385min出现峰，在标品出锋的时间样品有峰面积，说明样品中α-香附酮的存在，图4为样品溶液在14.250min出现锋，在标品出锋的时间样品有峰面积，说明样品中α-香附酮的存在，图5为空白对照，2.504min出现锋，而在标品出锋的时间没有锋，说明空白对照无干扰；
[0043]
准确量取标准品储备溶液0.25，0.5，1.5，2.5，3.5ml分别置于25ml容量瓶内，加入甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到一系列质量浓度溶液，用注射器吸取溶液，通过0.45μm有机相滤膜过滤到1.5ml的棕色进样瓶里，盖上盖子，按照试验进行的色谱条件进样测定，记录色谱图和峰面积，以质量浓度为横坐标、对应峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，依据一系列质量浓度，绘制标准曲线如图6，得回归方程a＝140.87c-113.46，r＝0.9964(n＝5)，结果说明，α-香附酮质量浓度在2、4、12、20、28μg/ml的范围内峰面积分别为43.51、137.23、324.26、448.55、592.21，在2-28μg/ml浓度范围内线性关系良好；
[0044]
取α-香附酮标准品溶液适量，按照上述拟订的色谱条件进样，连续测定5次，记录峰面积，做仪器的精密度检测，进样5次，记录的峰面积分别为324.26、325.60、323.27、323.01、322.90，结果α-香附酮峰面积sd为1.136，rsd为0.35％(n＝5)，表明仪器的精密度很好；
[0045]
取6g香附处理后的样品溶液，按照相同的色谱条件进行测定。进样5次，记录峰面积，做试验方法的重复性检测，进样5次的峰面积，面积分别为448.51、448.43、447.66、446.54、446.51，峰面积sd为0.976，rsd为0.22％(n＝5)，这些数据表明该试验方法的重复性很好。
[0046]
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。