溶血试剂、试剂盒及白细胞的分类方法与流程

溶血试剂、试剂盒及白细胞的分类方法
【技术领域】
1.本发明涉及溶血试剂。另外，本发明涉及白细胞分类用试剂盒及白细胞分类方法。


背景技术：

2.正常的白细胞分类为淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞的5种。白细胞的分类或数等的信息是对于检查受试者的健康状态有用的信息。作为用于白细胞的分类计数的试剂，知晓例如，记载在专利文献1的试剂。在专利文献1中公开了含芳香族有机酸的指定的ph的溶血试剂，记载了通过使用此试剂可对单核细胞和淋巴细胞高精度地进行分类的意思。
3.【现有技术文献】
4.【专利文献】
5.【专利文献1】美国专利申请公开第2014/0120530号说明书
6.【发明的概要】
7.【发明要解决的课题】
8.本发明旨在提供不仅是单核细胞和淋巴细胞，还有对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞进一步高精度地进行分类的溶血试剂、白细胞分类试剂盒及白细胞的分类方法。
9.【用于解决课题的手段】
10.本发明提供溶血试剂，其含以下的式(i)所表示的非离子表面活性剂，r1是碳原子数8以上、25以下的烷基、烯基或炔基，r2是氧原子、(coo)或以下的式(ii)所示，所述式(i)的n是23以上25以下或30，在n是23以上25以下时，所述非离子表面活性剂的浓度是1700ppm以上2300ppm以下，在n是30时，所述非离子表面活性剂的浓度是1900ppm以上2300ppm以下。
11.r
1-r
2-(ch2ch2o)
n-h式(i)
12.【化1】
[0013][0014]
本发明提供含上述溶血试剂和对核酸进行荧光染色的染色试剂的白细胞分类试剂盒。另外，本发明提供使用上述试剂盒的白细胞的分类方法。
[0015]
【发明的效果】
[0016]
根据本发明提供可对单核细胞和淋巴细胞高精度地进行分类，并且对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞高精度地进行分类的溶血试剂、试剂盒及白细胞的分类方法。
[0017]
【附图的简单的说明】
[0018]
【图1a】是显示本实施方式的溶血试剂的一例的概略图。
[0019]
【图1b】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。
[0020]
【图2】是使用本实施方式的白细胞分类试剂盒对正常的血液受试体进行测定之时的散点图的一例。
[0021]
【图3a】是显示实施例4的淋巴细胞的集团和单核细胞的集团的距离的坐标图。
[0022]
【图3b】是显示实施例4的嗜中性粒细胞的集团和嗜酸性粒细胞的集团的距离的坐标图。
[0023]
【图4】是显示实施例5的受试体1的散点图的结果的坐标图。
【具体实施方式】
[0024]
[1.溶血试剂]
[0025]
本发明的实施方式之一是溶血试剂。溶血试剂是用于使受试体中的红细胞溶血，给白细胞的细胞膜可透过荧光染料的程度的损伤的试剂。本实施方式的溶血试剂使用流式细胞术，适宜地在能将全血受试体中所含的白细胞分类为淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞的5种集团的自动血细胞计数装置中使用。例如，自动血细胞计数装置通过使作为血液受试体的全血受试体与溶血试剂及对核酸进行荧光染色的染色试剂混合，调制红细胞被溶血，白细胞被染色的测定试样。测定试样供给于流动池，通过照射光而从白细胞取得光学信息。各白细胞基于取得的光学信息，分类为上述的5种集团。这样的自动血细胞计数装置在例如特开2008-209383号公报中公开。由所述溶血试剂，可一边对通过由自动血细胞计数装置混合溶血试剂和全血受试体而调制的测定试样的淋巴细胞和单核细胞高精度地进行分类，一边对嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞进一步高精度地进行分类。
[0026]
自动血细胞计数装置除了测定全血受试体的功能之外，也可搭载对全血受试体以外的体液受试体(例如，腹水、关节液、胸水、脑脊髓液、骨髓液、支气管肺泡清洗液、腹腔清洗液等)进行测定的功能。此时，所述溶血试剂还可在全血受试体以外的体液受试体中所含的白细胞的测定试样的调制中使用。由所述溶血试剂，能对全血受试体以外的体液受试体中所含的白细胞、特别单核细胞和其他集团良好地进行分级分离。搭载对全血受试体以外的体液受试体进行测定的功能的自动血细胞计数装置在例如特开2008-209383号公报中公开。
[0027]
本实施方式的溶血试剂含以下的式(i)所表示的非离子表面活性剂。在式(i)中，r1是碳原子数8以上、25以下的烷基、烯基或炔基，r2是氧原子、(coo)或以下的式(ii)所示。
[0028]r1-r
2-(ch2ch2o)
n-h式(i)
[0029]
【化2】
[0030][0031]
在所述溶血试剂中，溶剂只要是可使式(i)所示的非离子表面活性剂溶解，就不特别限定。例如，可举出水、有机溶剂、及它们的混合物。作为有机溶剂，可举出例如碳原子数1～6的醇、乙二醇、二乙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜(dmso)等。
[0032]
本实施方式的溶血试剂也可含用于使ph一定的缓冲物质。例如，可举出无机酸盐类、有机酸盐类、good的缓冲剂、它们的组合等。作为无机酸盐类，可举出例如，磷酸盐、硼酸盐、它们的组合等。作为有机酸盐类，可举出柠檬酸盐、苹果酸盐、它们的组合等。作为good的缓冲剂，可举出例如，mes、bis-tris、ada、pipes、bis-tris-propane、aces、mops、mopso、bes、tes、hepes、hepps、tricine、tris、bicine、taps、它们的组合等。
[0033]
本实施方式的溶血试剂是，式(i)的n是23以上25以下。更优选为式(i)的n是23或
25，再优选为n是23。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1700ppm以上，优选为1750ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2300ppm以下，优选为2200ppm以下。在进一步的实施方式的溶血试剂中，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1700ppm以上，优选为约1750ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2300ppm以下，优选为约2200ppm以下。
[0034]
本实施方式的溶血试剂的一例是，式(i)的n是23。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1700ppm以上，优选为1750ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2300ppm以下，优选为2200ppm以下。在进一步的实施方式的溶血试剂的一例中，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1700ppm以上，优选为约1750ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2300ppm以下，优选为约2200ppm以下。
[0035]
本实施方式的溶血试剂的别的一例是，式(i)的n是25。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1700ppm以上，优选为1750ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2300ppm以下，优选为2200ppm以下。在进一步的实施方式的溶血试剂的别的一例中，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1700ppm以上，优选为约1750ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2300ppm以下，优选为约2200ppm以下。
[0036]
本实施方式的溶血试剂的一样态是，式(i)的n是30。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1900ppm以上，优选为2000ppm以上，更优选为2100ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2300ppm以下，优选为2200ppm。在进一步的实施方式的溶血试剂的一样态中，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1900ppm以上，优选为约2000ppm以上，更优选为约2100ppm以上。另外，式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2300ppm以下，优选为约2200ppm以下。
[0037]
在本实施方式的溶血试剂中，式(i)所示的非离子表面活性剂可使用例如，聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯甾醇、聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、它们的组合等。就是在其中，优选含聚氧乙烯烷基醚。作为聚氧乙烯烷基醚，优选为选自聚氧乙烯(23)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(25)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(30)鲸蜡基醚及它们的组的至少1种。更优选为聚氧乙烯(23)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(25)鲸蜡基醚及它们的组合，再优选为聚氧乙烯(23)鲸蜡基醚。再者，在所述溶血试剂中，非离子表面活性剂可为1种，也可为2种以上。另外所述溶血试剂也可还含式(i)所表示的非离子表面活性剂以外的非离子表面活性剂。
[0038]
本实施方式的溶血试剂也可还含阳离子表面活性剂。作为阳离子表面活性剂，可举出季铵盐型表面活性剂、吡啶鎓盐型表面活性剂及它们的组合。作为季铵盐型表面活性剂，适宜地使用例如式(iii)所示的总碳原子数是9～30的表面活性剂。再者，所述溶血试剂中所含的阳离子表面活性剂可为1种，也可为2种以上。
[0039]
【化3】
[0040][0041]
在式(iii)中，r1是碳原子数6～18的烷基或烯基。r2及r3互相相同或不同，是碳原
子数1～4的烷基或烯基。r4是碳原子数1～4的烷基或烯基或苄基，x-是卤素离子。
[0042]
在式(iii)中，作为r1，优选碳原子数是6、8、10、12及14的烷基或烯基，特别优选直链的烷基。作为更具体性的r1，可举出辛基、癸基及十二烷基。作为r2及r3，优选甲基、乙基及丙基。作为r4，优选甲基、乙基及丙基。
[0043]
作为吡啶鎓盐型表面活性剂，可举出例如式(iv)所示的表面活性剂。
[0044]
【化4】
[0045][0046]
在式(iv)中，r1是碳原子数6～18的烷基或烯基，x-是卤素原子。
[0047]
在式(iv)中，作为r1，优选碳原子数是6、8、10、12及14的烷基或烯基，特别优选直链的烷基。作为更具体性的r1可举出辛基、癸基及十二烷基。
[0048]
在所述溶血试剂中，阳离子表面活性剂浓度可由表面活性剂的种类适宜选择。阳离子表面活性剂浓度是10ppm以上。优选400ppm以上、更优选为500ppm以上、再者优选600ppm以上。另外，阳离子表面活性剂浓度是10000ppm以下。优选1000ppm以下，更优选800ppm以下，再优选为700ppm以下。
[0049]
本实施方式的溶血试剂也可还含芳香族有机酸。再者，在本说明书中，芳香族有机酸是指分子中具有至少1个芳香环的酸及其盐。作为芳香族有机酸，可举出例如，芳香族羧酸、芳香族磺酸等。作为芳香族羧酸，可举出例如，酞酸、安息香酸、水杨酸、马尿酸、它们的盐、它们的组合等。作为芳香族磺酸，可举出例如，p-氨基苯磺酸、苯磺酸、它们的盐、它们的组合等。再者，所述溶血试剂中所含的芳香族有机酸可为1种，也可为2种以上。另外，芳香族有机酸有显示缓冲作用的情况。在使用示缓冲作用的芳香族有机酸时，任意缓冲液的添加，也可与上述的缓冲液组合。
[0050]
在所述溶血试剂中还含芳香族有机酸时，芳香族有机酸的浓度不特别限定，从单核细胞和淋巴细胞的分类能的观点来看，优选20mm以上，更优选为25mm以上。另外，所述溶血试剂中所含的芳香族有机酸的浓度优选50mm以下，更优选为45mm以下。
[0051]
在本实施方式的溶血试剂中，不特别限定，ph优选5.5以上。更优选为5.7以上，再优选为5.9以上。另外，在所述溶血试剂中，ph优选7.2以下。更优选为6.9以下，再优选为6.6以下。在ph的调整中，可使用公知的碱基(氢氧化钠等)或酸(盐酸等)。
[0052]
在本实施方式的溶血试剂中，渗透压不特别限定，从红细胞的溶血效率的观点来看，优选150mosm/kg以下，更优选130mosm/kg以下，最优选110mosm/kg以下。也可添加对于渗透压的调整适合的渗透压调整剂。作为渗透压调整剂，可举出例如，糖、氨基酸、有机溶剂、氯化钠、它们的组合等。
[0053]
本实施方式的溶血试剂的一例示于图1a。在图1a中，10表示收容有所述溶血试剂的容器。容器10还可收容在捆包箱等。在容器10收容在捆包箱时，可与记载溶血试剂的组成、使用方法、保存方法等的附带文书、用于使来自外部的冲击降低的缓冲材等一同收容。
[0054]
[2.白细胞分类试剂盒]
[0055]
本发明的实施方式之一是含溶血试剂和对核酸进行荧光染色的染色试剂的白细胞分类试剂盒。所述试剂盒中所含的溶血试剂是[1.溶血试剂]中所述的溶血试剂。
[0056]
在所述试剂盒中，对核酸进行染色的荧光染料不特别限定，可对应于从光源照射
的光的波长等而适宜选择。例如，可举出碘化丙啶、溴化乙锭、乙啶-吖啶异源二聚体、乙啶二叠氮化物、乙啶同源二聚体-1、乙啶同源二聚体-2、乙啶单叠氮化物、三亚甲基双[[3-[[4-[[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]亚甲基]-1,4-二氢喹啉]-1-基]丙基]二甲基铵]
·
四碘化物(toto-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2(3h)-亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵)丙基]喹啉鎓－二碘化物(to-pro-1)、n,n,n',n'-四甲基-n,n'-双[3-[4-[3-[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]-2-亚丙烯基]-1,4-二氢喹啉-1-基]丙基]-1,3-丙烷二铵－四碘化物(toto-3)、或者2-[3-[[1-[3-(三甲基铵)丙基]-1,4-二氢喹啉]-4-亚基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鎓－二碘化物(to-pro-3)、以下的通式(v)所表示的荧光染料、它们的组合等。
[0057]
【化5】
[0058][0059]
在式(v)中，r1及r4互相相同或不同，是氢原子、烷基、具有羟基的烷基链、具有醚基的烷基链、具有酯基的烷基链、或者任选有取代基的苄基。r2及r3互相相同或不同，是氢原子、羟基、卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基磺酰基或苯基。z是具有硫原子、氧原子或碳原子的甲基。n是0、1、2或3。x-是阴离子。
[0060]
在式(v)中，烷基也可为直链状或分枝链状之任一者。另外，在r1及r4之任一方是碳原子数6～18的烷基时，另一方优选为氢原子或碳原子数6不足的烷基。在碳原子数6～18的烷基之中，也优选碳原子数是6、8或10的烷基。
[0061]
在式(v)中，作为r1及r4的苄基的取代基，可举出例如碳原子数1～20的烷基、碳原子数2～20的烯基或碳原子数2～20的炔基。在它们之中，也特别优选甲基或乙基。
[0062]
在式(v)中，作为r2及r3的烯基，可举出例如碳原子数2～20的烯基。另外，作为r2及r3的烷氧基，可举出碳原子数1～20的烷氧基。在它们之中，也特别优选甲氧基或乙氧基。
[0063]
在式(v)中，作为阴离子x-，可举出如f-、cl-、br-及i-一样的卤素离子、cf3so
3-、bf
4-等。
[0064]
在所述试剂盒中，荧光染料可使用1种，也可使用2种以上。荧光染料的浓度可对应于荧光染料的种类适宜设定。通常，荧光染料的浓度是0.01pg/μl以上、优选为0.1pg/μl以上，上述荧光染料的浓度是100pg/μl以下，优选为10pg/μl以下。例如，在作为1试剂的荧光染料，使用式(i)所表示的荧光染料时，试剂盒中的荧光染料的浓度优选0.2pg/μl以上、更优选为0.3pg/μl以上。另外，在作为1试剂的荧光染料，使用式(i)所表示的荧光染料时，试剂盒中的荧光染料的浓度优选为0.6pg/μl以下，更优选为0.5pg/μl以下。
[0065]
在本实施方式的试剂盒中，染色试剂也可使用市售的白细胞测定用的染色试剂。例如，可举出fluorocellwdf(sysmex公司)、stromatolyser4ds(sysmex公司)。
[0066]
在本实施方式的试剂盒中，试剂盒中所含的试剂的溶剂只要是可使式(i)所示的非离子表面活性剂及/或荧光染料溶解，就不特别限定。溶剂的详细内容与上述的[1.溶血试剂]中所述的同样。使荧光染料溶解的溶剂，从保存稳定性的观点来看，优选为有机溶剂。
[0067]
在本实施方式的试剂盒中，试剂盒中所含的各试剂的溶剂也可含用于使ph一定的
缓冲物质。缓冲物质的详细内容与上述的[1.溶血试剂]中所述的同样。
[0068]
本实施方式的试剂盒的一例示于图1b。在图1b中，30表示所述试剂盒。11表示收容有[1.溶血试剂]中所述的溶血试剂的第1容器。20表示收容有对核酸进行荧光染色的染色试剂的第2容器。所述试剂盒30还可收容在捆包箱等。在试剂盒30收容在捆包箱时，可与记载试剂盒中所含的各试剂的组成、使用方法、保存方法等的附带文书、用于使来自外部的冲击降低的缓冲材等一同收容。在试剂盒30中也可含其他试剂，可含例如缓冲液、校准物等的试剂。
[0069]
[3.白细胞的分类方法]
[0070]
本发明的实施方式之一是白细胞的分类方法。所述分类方法包括向通过将溶血试剂、对核酸进行染色的染色试剂和含白细胞的受试体混合而调制的测定试样照射光，检测光学信息的工序，和基于上述光学信息对上述白细胞进行分类的工序。
[0071]
在所述实施方式的方法中，受试体只要是有含白细胞的或含血细胞的可能性的试样，就不特别限定。作为有含白细胞的或含血细胞的可能性的试样，哺乳动物、优选为从人采集的试样。作为受试体，可举出例如，全血、腹水、关节液、胸水、脑脊髓液、骨髓液、支气管肺泡清洗液、腹腔清洗液、尿、用单采血液成分法等采集的试样等。
[0072]
在所述实施方式的方法中，受试体只要是不妨碍后述的检测工序及/或分类工序，就可使用被适合的水性溶剂稀释的，或添加公知的添加剂的。作为水性溶剂的例，不特别限定，可举出例如，水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液优选在中性附近的ph(例如，6以上8以下的ph)具有缓冲作用。作为添加剂，不特别限定，可举出抗凝固剂等。作为抗凝固剂的例，可举出k3-edta、edta、egta、tpen、bapta、柠檬酸钠、华法林、肝素、达那肝素、磺达肝素、它们的组合等。另外，在受试体中含混杂物时，也可由离心分离、过滤等的公知的手段除去混杂物。
[0073]
在本实施方式的方法中，溶血试剂、染色试剂和受试体的混合顺序不特别限定。例如，也可将溶血试剂和染色试剂先混合，将此混合液和受试体混合。另外，也可将溶血试剂和受试体先混合，将此混合液和染色液混合。也可将溶血试剂的一部分和受试体混合而调制混合液之后，将调制的混合液和染色液混合，最后将其余的溶血试剂混合。
[0074]
在所述实施方式的方法中，溶血试剂、染色试剂和受试体的混合比可对应于溶血试剂、染色试剂及受试体适宜选择。溶血试剂、染色试剂和受试体的混合比优选例如，以体积比表示，1000:1以上。更优选为1000:10以上，再优选为1000:15以上。另外，在所述实施方式的方法中，溶血试剂、染色试剂和受试体的混合比优选为例如，以体积比表示，1000:50以下：50以下。更优选为1000:30以下：30以下，再优选为1000:25以下：25以下。再者，染色试剂和受试体的混合比可相同，也可不同。
[0075]
在本实施方式的方法中，优选在向测定试样照射光之前，温育。温育的条件不特别限定，可对应于受试体适宜选择。例如，温育的温度是15℃以上，优选为30℃以上。温育的温度是50℃以下，优选为45℃以下。温育时间是5秒钟以上，优选为10秒钟以上，更优选为15秒钟以上。温育时间是120秒钟以下，优选为80秒钟以下、更优选为40秒钟以下。
[0076]
在本实施方式的方法中，向测定试样照射光，检测光学信息(检测工序)。所述检测工序优选由流式细胞仪进行。在利用流式细胞仪的测定中，通过向流动池中的测定试样照射光，从测定试样中的粒子等发生信号。通过检测发生的信号，可得到光学信息。再者，可在检测的前后适宜进行信号的修正、扩增、变换等的处理，进行它们的处理的信号也可含在光
学信息中。
[0077]
在所述检测工序中，照射到测定试样的光不特别限定，选适宜于荧光染料的激发的波长的光源。例如，使用红色半导体激光、蓝色半导体激光、氩激光、he-ne激光、汞弧光灯等。特别是，由于半导体激光与气体激光相比非常地廉价，在成本的观点优选。
[0078]
在所述检测工序中，光学信息只要是一般在流式细胞术中使用的，就不特别限定。例如，可使用散射光信息或荧光信息等。作为散射光，可举出前方散射光(例如，光接收角度0度～约20度的散射光)和侧方散射光(例如，光接收角度约20度～约90度的散射光)。散射光信息或荧光信息可举出散射光及荧光的脉冲高、脉冲面积、脉宽、透过率、斯托克斯位移、比率、经时变化、与它们相关的值等。侧方散射光只要是反映细胞结构的复杂性、颗粒特性、核结构、分钟叶度等的内部信息，就不特别限定。
[0079]
在本实施方式的方法中，基于上述的光学信息而分类测定试样中的白细胞(分类工序)。在所述分类工序中，白细胞的分类优选通过制成以侧方散射光信息和荧光信息作为二轴的散点图，使用适当的解析软解析得到的散点图进行。例如，在x轴设侧方散射光强度(ssc)、在y轴设荧光强度(sfl)而描绘散点图时，如图2所示，白细胞分类为淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞的5种集团。
[0080]
所述分类工序优选包括对嗜中性粒细胞的集团、嗜酸性粒细胞的集团、单核细胞的集团和淋巴细胞的集团进行分类的工序。还优选将与嗜中性粒细胞的集团的侧方散射光强度相比而侧方散射光强度大的集团分类为嗜酸性粒细胞的集团，并且将与单核细胞的集团的侧方散射光强度相比而侧方散射光强度小的集团分类为淋巴细胞的集团。集团的侧方散射光强度可通过例如，将所述集团中所含的各细胞的侧方散射光强度的值加权平均，算出所述集团中所含的各细胞的侧方散射光强度的值的中位值等来确定。
[0081]
可由本实施方式的方法高精度地分类嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在一例中，可通过嗜中性粒细胞的集团的侧方散射光强度和嗜酸性粒细胞的集团的侧方散射光强度的差异与以往的方法相比变大而明确地分类。在别的例中，可通过嗜中性粒细胞的集团及/或嗜酸性粒细胞的集团的光学信息相关的值的偏差与以往的方法相比变小而明确地分类。
[0082]
可由本实施方式的方法高精度地分类单核细胞和淋巴细胞。在一例中，可通过单核细胞的集团的侧方散射光强度和淋巴细胞的集团的侧方散射光强度的差异与以往的方法相比变大而明确地分类。在别的例中，可通过单核细胞的集团及/或淋巴细胞的集团的光学信息相关的值的偏差与以往的方法相比变小而明确地分类。
[0083]
在本实施方式的方法中，侧方散射光强度中值的偏差可使用统计学地使用的指标等评价。例如，可举出变动系数、标准偏差、分散等。
[0084]
在本实施方式的方法中，溶血试剂含以下的式(i)所表示的非离子表面活性剂。在式(i)中，r1是碳原子数8以上、25以下的烷基、烯基或炔基，r2是氧原子、(coo)或以下的式(ii)所示。
[0085]r1-r
2-(ch2ch2o)
n-h式(i)
[0086]
【化6】
[0087][0088]
在本实施方式的方法中，式(i)的n是23以上25以下。优选为式(i)的n是23、25，更
优选为式(i)的n是23。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1650ppm以上，优选为1700ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2250ppm以下，优选为2150ppm以下。在进一步的实施方式的溶血试剂中，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1650ppm以上，优选为约1700ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2250ppm以下，优选为约2150ppm以下。
[0089]
在本实施方式的方法的一例中，式(i)的n是23。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1650ppm以上，优选为1700ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2250ppm以下，优选为2150ppm以下。在进一步的实施方式的方法的一例中，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1650ppm以上，优选为约1700ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2250ppm以下，优选为约2150ppm以下。
[0090]
在实施方式的方法的别的一例中，式(i)的n是25。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1650ppm以上，优选为1700ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2250ppm以下，优选为2150ppm以下。在进一步的实施方式的方法的别的一例中，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1650ppm以上，优选为约1700ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2250ppm以下，优选为约2150ppm以下。
[0091]
在本实施方式的方法的一样态中，式(i)的n是30。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是1850ppm以上，优选为1950ppm以上，更优选为2050ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是2250ppm以下，优选为2150ppm以下。在进一步的实施方式的方法的一样态中，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约1850ppm以上，优选为约1950ppm以上，更优选为约2050ppm以上。另外，测定试样中的式(i)所示的非离子表面活性剂的浓度是约2250ppm以下，优选为约2150ppm以下。
[0092]
由本实施方式的方法，在白细胞的分类计数时，不仅是单核细胞和淋巴细胞，还可提升嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分类精度。另外，在一实施方式的方法中，还可提升单核细胞的集团的分类精度。
[0093]
接下来，将本发明由实施例详细地说明，本发明不限定于这些实施例。
[0094]
【实施例】
[0095]
【实施例1】
[0096]
探讨非离子表面活性剂的poe链长和嗜中性粒细胞的集团和嗜酸性粒细胞的集团的分类精度及淋巴细胞的集团和单核细胞的集团的分类精度的关系。嗜中性粒细胞的集团和嗜酸性粒细胞的集团的分类精度通过算出嗜酸性粒细胞的集团的侧方散射光强度和嗜中性粒细胞的集团的侧方散射光强度的差异的值(eo-ne差异)来评价。另外，单核细胞的集团和淋巴细胞的集团的分类精度通过算出淋巴细胞的集团的侧方散射光强度和单核细胞的集团的侧方散射光强度的差异的值(mo-ly差异)来评价。
[0097]
作为溶血试剂，将十二烷基三甲基铵氯化物(以下，称为ltac)(东京化成化学工业公司)、酞酸氢钾(和光纯药工业公司)、edta-2k(中部chelest公司)及聚氧乙烯(n)鲸蜡基醚(以下，称为poe(n)鲸蜡基醚，n表示聚氧乙烯(poe)的聚合度)以成为以下的表1所示的组
成的方式混合。另外，将溶血试剂的ph使用naoh调整到ph6.0。作为染色试剂，使用fluorocellwdf(sysmex公司)。再者，poe(n)鲸蜡基醚是非离子表面活性剂。
[0098]
【表1】
[0099]
化合物浓度[ppm]ltac685poe(n)鲸蜡基醚1750edta-2k200酞酸氢钾8160
[0100]
作为受试体，使用从健康人采集的血液15个受试体。作为流式细胞仪，使用xn-20(sysmex公司)。通过将测定试样与溶血试剂1000μl、受试体17μl及染色液20μl混合来调制。测定条件基于xn-20(sysmex公司)的wdf通道的设定。基于由流式细胞仪得到的测定值而制成散点图。通过对于制成的散点图使用适当的解析软解析，确定各白血细胞的集团。从确定的白血细胞的集团中所含的细胞数和侧方散射光强度及荧光强度算出各白血细胞的集团的侧方散射光强度及荧光强度。从各白血细胞的集团的侧方散射光强度算出mo-ly差及eo-ne差异。
[0101]
作为非离子表面活性剂，使用poe(20)鲸蜡基醚(日光chemicals公司)、poe(25)鲸蜡基醚(青木油脂公司)、poe(30)鲸蜡基醚(日光chemicals公司)或poe(40)鲸蜡基醚(日光chemicals公司)，以成为表1所示的组成的方式调制溶血试剂。使用调制的各溶血试剂对15个受试体用流式细胞仪进行测定。对于各溶血试剂，基于测定值而算出15个受试体的eo-ne差异的平均值和15个受试体的mo-ly差异的平均值。实施例1的结果示于表2。
[0102]
【表2】
[0103][0104][0105]
表2显示，溶血试剂中的poe(n)鲸蜡基醚的poe链的聚合度变大，则有eo-ne差异变小，mo-ly差异变大的倾向。
[0106]
【实施例2】
[0107]
探讨溶血试剂中的非离子表面活性剂的浓度、eo-ne差异和mo-ly差异的关系。
[0108]
除了作为非离子表面活性剂，使用poe(23)鲸蜡基醚，将poe(23)鲸蜡基醚的浓度调制到879ppm、1318ppm、1758ppm、1977ppm、2197ppm、2417ppm或2636ppm及将ph调整到6.1之外，与实施例1同样地调制溶血试剂。除了作为非离子表面活性剂，使用poe(25)鲸蜡基醚，将poe(25)鲸蜡基醚的浓度调制到879ppm、1318ppm、1758ppm、2197ppm或2636ppm及将ph调整到6.1之外，与实施例1同样地调制溶血试剂。与实施例1中作为非离子表面活性剂使用poe(30)鲸蜡基醚时同样地调制溶血试剂。使用调制的各溶血试剂对于3个受试体使用流式细胞仪进行测定。基于测定值而算出3个受试体的eo-ne差异的平均值和3个受试体的mo-ly差异的平均值。对于溶血试剂中的非离子表面活性剂，使用poe(23)鲸蜡基醚时的结果示于
表3，使用poe(25)鲸蜡基醚时的结果示于表4，使用poe(30)鲸蜡基醚时的结果示于表5。
[0109]
【表3】
[0110]
poe(23)鲸蜡基醚浓度[ppm]eo-ne差异mo-ly差异87954.027.3131856.530.0175860.038.3197762.538.7219762.537.0241762.532.7263663.029.0
[0111]
【表4】
[0112]
poe(25)鲸蜡基醚浓度[ppm]eo-ne差异mo-ly差异87955.028.0131856.732.0175860.739.7219761.736.0263660.030.0
[0113]
【表5】
[0114]
poe(30)鲸蜡基醚浓度[ppm]eo-ne差异mo-ly差异175045.040.0
[0115]
在使用poe(23)鲸蜡基醚或poe(25)鲸蜡基醚时，见到随着非离子表面活性剂的浓度变高，eo-ne差异变大的倾向。另外得知，在以1758ppm～2197ppm的浓度使用poe(23)鲸蜡基醚或poe(25)鲸蜡基醚时，可使嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分类及单核细胞和淋巴细胞的分类明确。
[0116]
【实施例3】
[0117]
探讨poe(23)鲸蜡基醚的浓度和eo-ne差异和mo-ly差异的关系。
[0118]
除了作为非离子表面活性剂，使用poe(23)鲸蜡基醚，将poe(23)鲸蜡基醚的浓度调制到1758ppm、1933ppm、2021ppm、2109ppm、2197ppm、或者2285ppm及将ph调整到6.2之外，与实施例1同样地调制溶血试剂。与实施例1中作为非离子表面活性剂使用poe(30)鲸蜡基醚时同样地调制溶血试剂。使用调制的各溶血试剂对于4个受试体使用流式细胞仪进行测定。基于测定值而算出4个受试体的eo-ne差异的平均值和4个受试体的mo-ly差异的平均值。对于溶血试剂中的非离子表面活性剂，使用poe(23)鲸蜡基醚时的结果示于表6，使用poe(30)鲸蜡基醚时的结果示于表7。
[0119]
【表6】
[0120]
poe(23)鲸蜡基醚浓度[ppm]eo-ne差异mo-ly差异175854.042.5193355.844.0202158.343.0
210957.342.5219757.842.0228558.540.8
[0121]
【表7】
[0122]
poe(30)鲸蜡基醚浓度[ppm]eo-ne差异mo-ly差异175039.042.5
[0123]
在使用poe(23)鲸蜡基醚时，见到随着非离子表面活性剂的浓度变高，eo-ne差异变大的倾向。另外得知，在以1758ppm～2285ppm的浓度使用poe(23)鲸蜡基醚时，可使嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分类及单核细胞和淋巴细胞的分类明确。
[0124]
【实施例4】
[0125]
进行试剂a、试剂b及试剂c和试剂d的eo-ne差及mo-ly差异的比较。
[0126]
除了作为非离子表面活性剂，使用poe(23)鲸蜡基醚，将poe(23)鲸蜡基醚浓度调制到2021ppm及调整到ph6.2之外，与实施例1同样地调制溶血试剂(以下，称为试剂a)。除了作为非离子表面活性剂，使用poe(25)鲸蜡基醚，将poe(25)鲸蜡基醚浓度调制到1758ppm及将ph调整到6.1之外，与实施例1同样地调制溶血试剂(以下，称为试剂b)。作为溶血试剂的非离子表面活性剂，使用poe(30)鲸蜡基醚。另外，通过将poe(30)鲸蜡基醚浓度调制到2144ppm、将ltac调制到668ppm、将酞酸氢钾调制到5106ppm、将ada调制到1236ppm及调整到ph6.5，调制溶血试剂(以下，称为试剂c)。与实施例1的使用poe(30)鲸蜡基醚时同样地调制溶血试剂(以下，称为试剂d)。使用试剂a、试剂b、试剂c及试剂d，与实施例1同样地，对于132个受试体，用流式细胞仪测定。基于测定值而算出132个受试体的eo-ne差异的平均值及132个受试体的mo-ly差异的平均值。
[0127]
实施例4的结果示于图3a、图3b。图3a显示，在使用试剂a、试剂b或试剂c之任一者的试剂时，eo-ne差异也与使用试剂d时相比大。图3b显示，在使用试剂a、试剂b、试剂c及试剂d之任一者的试剂时，mo-ly差异均是同等的。得知通过使用试剂a、试剂b及试剂c，单核细胞和淋巴细胞的分类可与使用试剂d时相比以同等的精度分类，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分类可与使用试剂d时相比高精度地分类。
[0128]
【实施例5】
[0129]
对试剂a和试剂d的试剂的单核细胞的集团的偏差进行比较。单核细胞的集团的偏差通过从分类为单核细胞的集团的白细胞的荧光强度的中位值(med)及标准偏差(s.d.)算出变动系数(cv)(以下，称为单核细胞的集团的变动系数)来评价。
[0130]
除了使用实施例4中调制的试剂a或试剂d，及作为受试体，腹水使用4个受试体(受试体1～4)、胸水使用1个受试体(受试体5)及关节液使用1个受试体(受试体6)、计6个受试体之外，与实施例1同样地，用流式细胞仪测定。基于测定值而算出单核细胞的集团的变动系数。结果示于表8。
[0131]
【表8】
[0132][0133]
在受试体1～6之任一者的受试体中，使用试剂a时与使用试剂d时相比，单核细胞的集团的变动系数小。另外，作为一例，受试体1的散点图示于图4。图4的散点图的被框线包围的区域是被认为出现单核细胞的标绘点的区域。再者，在图4中，x轴的ssc表示侧方散射光强度，y轴的sfl表示荧光强度。如图4所示，在散点图上也确认，与使用试剂d时相比，使用试剂a时的方在单核细胞的集团的荧光强度的偏差小。
[0134]
【符号的说明】
[0135]
10：容器
[0136]
11：第1容器
[0137]
20：第2容器
[0138]
30：试剂盒