用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法与流程

本发明属于生物与新医药，尤其涉及一种用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法。

背景技术：

1、细胞外囊泡，是一类由细胞分泌到细胞外的能够被受体细胞摄取的膜性囊泡小体，具有磷脂双分子层，几乎所有的真核生物和原核生物都能够分泌。根据大小及形成方式的不同，目前细胞外囊泡大致可分外泌体，微囊泡以及凋亡小体三类。外泌体是由细胞质膜多次内陷形成多泡体，最后与细胞膜融合形成直径为30-150nm的小囊泡。微囊泡是由细胞膜直接出芽形成的直径为200-1000nm的囊泡。凋亡小体是细胞在调往过程中，细胞萎缩碎裂形成的有膜结构的500-2000nm的小体。对于细胞外囊泡的研究，研究者们多数集中在外泌体及微囊泡上(以下统称为细胞外囊泡)，且由于细胞外囊泡特殊的形成方式，具有携带本源细胞遗传信息的特殊性质，同时因为本源细胞的差异性，细胞外囊泡个体之间存在着高度的异质性和多样性，因此如何对其进行准确的表征分析是一个亟需解决的难题。

2、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,tem)是在细胞外囊泡形态和粒径表征中使用较为广泛的纳米显微镜成像技术，细胞外囊泡在tem下观察为茶托样结构，其成像原理是将电子束投射到细胞外囊泡样本上，电子与细胞外囊泡中的原子发生碰撞，由于细胞外囊泡物理性质的差异性(例如厚度，密度等)，在穿过细胞外囊泡时电子束改变方向，从而产生立体角散射，形成大小不同的散射角，进而可形成明暗不同的影像，影像在放大，聚焦后在荧光屏幕上投影出来。tem具有分辨率高且能够将单个细胞外囊泡与类似大小的非细胞外囊泡颗粒区分开来等优点，是目前监测含细胞外囊泡样本质量和纯度使用最为广泛的仪器，通常用来证明样本是否质量保证，是否具有足够的纯度，以便于下游治疗应用及分析。

3、目前，细胞外囊泡tem形貌表征主要分为两大类，固定和不固定。其中，固定方法中，实施效果好的实验流程包括以下：多聚甲醛固定，铜网碳膜滴样，pbs洗样，戊二醛再次固定，去离子水洗样，草酸铀酰负染，样品与甲基纤维素-乙酸双氧铀冰上成膜静置，去除铜网碳膜上过多的溶液，室温干燥，tem电镜观察。此类方法细胞外囊泡形貌完整，同一视野范围内囊泡数量多，样本保存稳定性好，但操作繁琐，重复性差，技术要求高。第二种不固定方法实施流程主要为：铜网碳膜滴样，样本负染，样本干燥及后续电镜观察。这个方法虽然简单快速，对操作者要求较低，但最后细胞外囊泡tem成像结果往往很差，囊泡数量少，重复性差且无法长期保存，所拍样本形貌及数据缺乏统计代表性。

4、目前，虽然tem能够清晰的表征出细胞外囊泡的形貌，但也存在制备繁琐，粒径分布缺乏统计代表性等缺点。例如，tem拍摄过程中，图像往往是操作者通过挑选后，在细胞外囊泡存在且清晰可见的位置拍摄图像，这往往会使整体样本质量的可比性降低。另外，有些方法制备的细胞外囊泡tem样本比较好，能拍出完整的囊泡结构，且分布均匀，但通过调查发现，这种方法前期样本制作困难，步骤繁琐，对实验人员的熟练度及技术要求极高，往往会带来重复性差，样本制作不均一等影响。除此之外，还有一些实验方法操作简单，但最后所获得的细胞外囊泡形貌往往会有所破损，呈现结果比较差，且在同一视野中，囊泡数量极少，数据严重缺乏统计代表性。

技术实现思路

1、有鉴如此，有必要针对现有技术存在的制备缺陷，提供一种能获得良好的细胞外囊泡形貌表征图，便于细胞外囊泡样本形貌及统计等性能表征的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法。

2、为解决上述技术问题，本申请采用下述技术方案：

3、本申请提供了一种用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，包括下述步骤：

4、用固定液将提取的细胞外囊泡进行固定；

5、将固定后的细胞外囊泡滴于铜网碳膜上；

6、洗涤所述铜网碳膜上的固定液；

7、对所述铜网碳膜上的细胞外囊泡进行负染处理；

8、对所述铜网碳膜进行干燥处理，完成所述细胞外囊泡样品的制样。

9、在其中一些实施例中，在用固定液将提取的细胞外囊泡进行固定的步骤中，具体包括下述步骤：

10、将固定液与细胞外囊泡混合后并于2～37℃固定，其中，所述固定液包括多聚甲醛溶液、戊二醛溶液、四氧化锇溶液高锰酸钾溶液或乙醇溶液，所述固定液的浓度为0％-5％，固定时间为0min-6000min。

11、在其中一些实施例中，所述固定液的浓度为0.1％-1％，固定时间为120min-1200min。

12、在其中一些实施例中，在将固定后的细胞外囊泡滴于铜网碳膜上的步骤中，具体包括下述步骤：吸取固定后的细胞外囊泡并滴于铜网碳膜上，室温静置3min-90min，其中，滴样次数为1-6次。

13、在其中一些实施例中，所述滴样次数为1-3次，静置时间为10min-50min。

14、在其中一些实施例中，在洗涤所述铜网碳膜上的固定液的步骤中，具体包括下述步骤：用无尘滤纸吸干所述铜网碳膜上多余水分，再用过滤水滴于所述细胞外囊泡上以洗涤所述细胞外囊泡表面残留固定液，其中，洗涤次数为0-5次。

15、在其中一些实施例中，在对所述铜网碳膜上的细胞外囊泡进行负染处理的步骤中，具体包括下述步骤：吸取负染液滴于所述细胞外囊泡上，室温静置，其中，所述负染液包括锇酸溶液、乙酸氧铀溶液或者磷钨酸溶液，所述负染液的浓度为1％-5％(w/v)，室温静置时间为3min-90min。

16、在其中一些实施例中，所述负染液的浓度为2％～3％，负染时间为10min～50min。

17、在其中一些实施例中，在对所述铜网碳膜进行干燥处理，完成所述细胞外囊泡样品的制样的步骤中，具体包括下述步骤：

18、吸干多余的负染液，无尘静置干燥，其中，静置时间为30min-1200min。

19、在其中一些实施例中，干燥时间为480min-960min。

20、本申请采用上述技术方案，具有以下有益效果：

21、本发明提供的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，用固定液将提取的细胞外囊泡进行固定，将固定后的细胞外囊泡滴于铜网碳膜上，洗涤所述铜网碳膜上的固定液，对所述铜网碳膜上的细胞外囊泡进行负染处理，对所述铜网碳膜进行干燥处理，完成所述细胞外囊泡样品的制样，本申请提供的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其操作简单，步骤简易，无损伤，可重复性好及样本保存稳定，能获得良好的细胞外囊泡形貌表征图，便于细胞外囊泡样本形貌及统计等性能表征。

技术特征：

1.一种用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，在用固定液将提取的细胞外囊泡进行固定的步骤中，具体包括下述步骤：

3.根据权利要求2所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，所述固定液的浓度为0.1％-1％，固定时间为120min-1200min。

4.根据权利要求1所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，在将固定后的细胞外囊泡滴于铜网碳膜上的步骤中，具体包括下述步骤：吸取固定后的细胞外囊泡并滴于铜网碳膜上，室温静置3min-90min，其中，滴样次数为1-6次。

5.根据权利要求4所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，所述滴样次数为1-3次，静置时间为10min-50min。

6.根据权利要求1所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，在洗涤所述铜网碳膜上的固定液的步骤中，具体包括下述步骤：用无尘滤纸吸干所述铜网碳膜上多余水分，再用过滤水滴于所述细胞外囊泡上以洗涤所述细胞外囊泡表面残留固定液，其中，洗涤次数为0-5次。

7.根据权利要求1所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，在对所述铜网碳膜上的细胞外囊泡进行负染处理的步骤中，具体包括下述步骤：吸取负染液滴于所述细胞外囊泡上，室温静置，其中，所述负染液包括乙酸氧铀溶液、锇酸溶液或者磷钨酸溶液，所述负染液的浓度为1％-5％(w/v)，室温静置时间为3min-90min。

8.根据权利要求7所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，所述负染液的浓度为2％～3％，负染时间为10min～50min。

9.根据权利要求8所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，在对所述铜网碳膜进行干燥处理，完成所述细胞外囊泡样品的制样的步骤中，具体包括下述步骤：

10.根据权利要求9所述的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其特征在于，干燥时间为480min-960min。

技术总结
本发明提供的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，用固定液将提取的细胞外囊泡进行固定，将固定后的细胞外囊泡滴于铜网碳膜上，洗涤所述铜网碳膜上的固定液，对所述铜网碳膜上的细胞外囊泡进行负染处理，对所述铜网碳膜进行干燥处理，完成所述细胞外囊泡样品的制样，本申请提供的用于制备透射电镜中细胞外囊泡样本的方法，其操作简单，步骤简易，无损伤，可重复性好及样本保存稳定，能获得良好的细胞外囊泡形貌表征图，便于细胞外囊泡样本形貌及统计等性能表征。

技术研发人员：杨慧,胡师,郝锐
受保护的技术使用者：深圳先进技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15