用作胃肠癌症生物标志物的特征蛋白、细胞外囊泡、用途及诊断和治疗靶点的制作方法

本发明属于细胞外囊泡研究和应用领域，特别涉及一种用作胃肠癌症生物标志物的特征蛋白、细胞外囊泡、用途及诊断和治疗靶点。

背景技术：

1、根据世界卫生组织国际癌症研究机构（iarc）发布了 2020年全球最新癌症负担数据，结直肠癌在全球癌症中发病率居第三位（10%）、死亡率居第二位（9.4%），胃癌在全球癌症中发病率居第五位（5.6%）、死亡率居第四位（7.7%）。癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低患者死亡率的主要策略。目前在早期胃肠癌筛查方面，尚无便捷有效的诊断方法来进行全体人群普查。结直肠癌（crc）是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。当诊断患有crc时，约70.4%的患者有外周转移，主要是淋巴结转移，而12.5%的患者存在癌症的远处转移，包括肝转移。局部原发性crc患者的5年生存率为90%，但周围转移性crc患者的5年生存率为71%，远处器官转移性crc患者的5年生存率为14%。crc转移严重降低了术后生存率，然而，先进的crc筛查、诊断和治疗方法仍在研究中。胃癌在全球发病率在恶性肿瘤中居第五位，死亡率居第三位，男性发病率是女性的两倍以上。胃癌的转移途径主要以淋巴转移为主，进展期胃癌的淋巴转移率高达70%左右，早期胃癌也可有淋巴转移。此外还可出现直接浸润、血行转移、腹膜转移，最常转移到肝脏，，易扩散至网膜、结肠、胰腺等邻近器官。早期胃癌术后的5年生存率可达到90.9%~100%，然而晚期胃癌5年的生存率现仍不足30%。但是，胃癌早期时难以被诊断出来，大多数患者都是在癌细胞从胃扩散转移到肝脏、淋巴结或其他器官后才得到确诊，只有扩散后，患者才有体征，难以引起足够的重视。最终胃癌确诊还需依赖根据活组织检查活细胞学检查结果诊断。

2、目前临床上针对大肠癌的检测主要有粪便检查（隐血和脱落的dna检查）和结构检查（乙状结肠镜检查、结肠镜检查和计算机断层扫描结肠造影），结直肠镜检查虽然是“肠癌检查的金标准”，但存在肠道穿孔及出血风险，受检率低，由于其侵入性、设备成本及操作人员的技术水平因素，结直肠镜检查没有被广泛用作一线筛查工具。目前临床最常用的大肠癌肿瘤标志物为癌胚抗原(cea)、ca19-9等，血清cea水平仍经常用作监测术后复发的标志物，很少用作预测肠癌的标志物，因其特异性和敏感性较低，在乳腺癌和肺癌中也升高；ca19-9对crc诊断的灵敏度为36％，特异性为97％。临床上胃癌的诊断主要依靠病理活检和内镜检查，这些检查方法属于侵入性检查，不仅操作复杂，而且增加患者的痛苦。临床上用于早期检测gc的最常见肿瘤标志物包括癌胚抗原（cea）、糖类抗原（ca）系列的抗原、胃蛋白酶原和α-甲胎蛋白（afp），然而这些血清生物标志物的特异性和敏感性差，到目前为止，没有一个可用于gc诊断。鉴于上述这些临床挑战，迫切需要新的方法来迅速有效地诊断和监测肠胃癌患者的预后。

3、由于其日益被认可的物理和病理作用以及在诊断和治疗应用中的潜力，外泌体已引起研究领域和生物医学行业的极大关注。外泌体是一种被膜的胞外囊泡子类，直径为30-150 nm，几乎可从所有类型的细胞中释放出来，以介导胞间通讯。已有证据表明，外泌体可能对癌症从原发性肿瘤向转移部位的扩散起作用，因此是一种很有前景的用于液体活检的组织特异性生物标志物。在一些研究中，外泌体在调控crc的增殖、转移、化疗耐药和复发中起关键作用。源自sw640和sw680 crc细胞系的外泌体可刺激肿瘤血管系统的发育。此外，源自crc小鼠细胞系ct26的外泌体显著促进肿瘤生长并降低crc存活率。此外，作为crc预后不良的独立预测因子，血清外泌体mir-203通过在癌中诱导肿瘤相关的巨噬细胞活化来促进肝转移。另一项在先研究显示，癌基因mir-21富集在癌相关成纤维细胞（caf）的外泌体中，其导致在转移到crc细胞后akt磷酸化增加，并与奥沙利铂的化疗耐药性密切相关。

4、由于源细胞、微环境刺激等原因，外泌体在分子组成上具有高度异质性。外泌体的膜蛋白反映了其亚细胞起源和供体细胞类型，有助于外泌体囊泡的特异性靶向性，以在其受体细胞上发挥生理或病理作用。就液体活检或治疗应用的目的对体液进行外泌体分析而言，外泌体的异质性尤其重要。然而，由于外泌体在elisa或质谱等批量分析中丧失了异质性，因此，对所获取的多个外泌体进行精准分析，甚至逐个分析，是很重要的。

5、

技术实现思路

1、鉴于上述问题，本技术利用一种用于单个外泌体分析的新型高通量方法即邻近编码技术（pba）对细胞囊泡、尤其是外泌体上的200多种表面蛋白进行了分析，识别了其中对胃肠癌症诊断和治疗有效的外泌体，从而为有效地诊断和监测肠胃癌患者的预后提供了明确的生物标志物，这对于胃肠癌的诊断、监测和预后将起到重大的推动作用。

2、在第一方面，本技术提供了一种用作胃肠癌症生物标志物的细胞外囊泡的特征蛋白，所述特征蛋白为选自itgam、itgal和itgb2的的一种或几种的组合。通过确定该生物标志物的组合，能够有效且快捷地对患者的胃肠癌疾病进行诊断、检测和预后，从而有利于提升患者治疗的成功几率。

3、在一些实施方案中，所述胃肠癌症包括胃癌、肠癌、结肠癌、直肠癌。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡表达itgam、itgal、itgb2蛋白中的一种或几种。在一些实施方案中，所述itgam、itgal、itgb2阳性细胞外囊泡为免疫细胞来源。在一些实施方案中，所述itgam、itgal、itgb2阳性细胞外囊泡为单核细胞或巨噬细胞来源。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是人体血液中存在的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述特征蛋白能够用于判断胃肠癌症发生风险及癌症是否存在。在一些实施方案中，所述特征蛋白能够用于胃肠癌症的早期筛查、诊断、进展评估、治疗效果评估、复发监测。在一些实施方案中，所述特征蛋白能够用于抑制胃肠癌症的进展和转移。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是健康人体血液中存在的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是免疫细胞培养中生产的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述免疫细胞是单核细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述特征蛋白具有用于制备治疗胃肠癌症的试剂和试剂盒的用途。

4、在第二方面，提供了一种用作胃肠癌症生物标志物的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡携带根据前述第一方面所述的特征蛋白。

5、在第三方面，提供了根据前述第一方面所述的特征蛋白或根据前述第二方面所述的细胞外囊泡用于制备治疗胃肠癌症的试剂和试剂盒的用途。

6、在第四方面，提供了一种用作胃肠癌症生物标志物的细胞外囊泡的特征蛋白，所述特征蛋白为选自erbb2、epcam、itgb1、itga6 、itgb3、adam10、cd9和cd151中的一种或多种的组合。

7、 在一些实施方案中，所述胃肠癌症包括胃癌、肠癌、结肠癌和直肠癌。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡表达erbb2 /epcam/itgb1/ itga6 /itgb3 /adam10 /cd9 /cd151蛋白中的一种或几种。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡为癌细胞来源。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡为癌前病变细胞来源。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡为组织异常增生或息肉来源。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是人体血液中存在的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是健康人体组织中存在的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述特征蛋白能够用于判断胃肠癌症发生风险及癌症是否存在。在一些实施方案中，所述特征蛋白能够用于胃肠癌症的早期筛查、诊断、进展评估、治疗效果评估、复发监测。在一些实施方案中，所述特征蛋白能够用于抑制胃肠癌症的进展和转移。

8、在第五方面，提供了一种用作胃肠癌症生物标志物的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡携带根据前述第四方面所述的特征蛋白。

9、在第六方面，提供了根据前述第四方面所述的特征蛋白或根据前述第五方面所述的细胞外囊泡用于制备治疗胃肠癌症的试剂和试剂盒的用途。

10、在第七方面，提供了一种胃肠癌症治疗靶点，所述胃肠癌症治疗靶点为erbb2、epcam、itgb1、itga6、itgb3、adam10、cd9和cd151阳性细胞外囊泡，通过降低itgb3阳性细胞外囊泡的表达来治疗胃肠癌症。在一些实施方案中，通过药物阻滞细胞外囊泡的生物学作用来治疗胃肠癌症，降低癌症增殖和转移。

11、在第九方面，供了一种用作胃肠癌症生物标志物的细胞外囊泡的特征蛋白，所述特征蛋白为ccr2。在一些实施方案中，所述胃肠癌症包括胃癌、肠癌、结肠癌和直肠癌。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡表达ccr2蛋白。在一些实施方案中，所述ccr2阳性细胞外囊泡为免疫细胞来源。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是人体血液中存在的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡是健康人体血液中存在的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡能够用于判断胃肠癌症发生风险及癌症是否存在。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡能够用于胃肠癌症的早期筛查、诊断、进展评估、治疗效果评估、复发监测。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡能够用于抑制胃肠癌症的进展和转移。在一些实施方案中，所述细胞外囊泡可以是免疫细胞培养中生产的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述免疫细胞可以是单核细胞或巨噬细胞。

12、在第十方面，提供了一种用作胃肠癌症生物标志物的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡携带根据前述第九方面所述的特征蛋白。

13、在第十一方面，提供了一种根据第九方面所述的特征蛋白或根据第十方面所述的细胞外囊泡用于制备治疗胃肠癌症的试剂和试剂盒的用途。

14、在第十二方面，提供了一种用作crc早期筛查的生物标志物的外泌体，所述外泌体为itgam阳性外泌体。在一些实施方案中，所述itgam阳性外泌体为免疫细胞来源。进一步地，在一些实施方案中，所述itgam阳性外泌体为单核细胞或巨噬细胞来源。进一步地，在一些实施方案中，所述外泌体为血浆外泌体。在一些实施方案中，所述外泌体能够抑制crc的进展和转移。

15、在前述技术方案中，通过分析受试者血液样品中的itgam阳性外泌体及含量，能够对受试者进行早期crc筛查，从而尽早发现crc并进行针对性的治疗。

16、在第十三方面，本发明提供了一种用作检测crc增殖和转移的生物标志物的外泌体，所述外泌体为itga6-itgb3阳性外泌体。在一些实施方案中，所述外泌体为癌细胞来源。

17、在前述技术方案中，通过分析受试者血液样品中的itga6-itgb3阳性外泌体及含量，能够检测受试者的crc增殖和转移情况，从而采取针对性的治疗措施。

18、在第十四方面，本发明提供了一种用于crc早期筛查、预测转移和治疗的外泌体组合，其包括itgam阳性外泌体和itgb3阳性外泌体。在一些实施方案中，所述itgb3阳性外泌体为癌细胞来源。在一些实施方案中，所述itgam阳性外泌体为免疫细胞来源。

19、在第十五方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的外泌体用于制备治疗crc的试剂和试剂盒的用途。

20、在第十六方面，提供了一种crc治疗靶点，所述crc治疗靶点为itgb3阳性外泌体，通过降低itgb3阳性外泌体的表达来治疗crc。

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