血液样本中中性粒细胞CD64的测定方法与流程

血液样本中中性粒细胞cd64的测定方法
技术领域
1.本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种血液样本中中性粒细胞cd64的测定方法。


背景技术：

2.cd64又称作fc-gamma受体蛋白1(fcyri)。cd64在外周血中性粒细胞表面呈现低表达，当机体受到感染后细菌细胞壁脂多糖、粒细胞集落刺激因子以及干扰素等刺激因子可引起中性粒细胞表面cd64由低表达迅速转变为高表达，并活化中性粒细胞，因此被作为一种感染指标。不同病原体引起的活化程度具有差异，研究发现其对细菌和病毒感染有一定的鉴别能力。cd64的测定对临床感染性疾病的诊断意义重大，但由于其荧光强度的测定受到仪器、试剂、电压等因素的影响，检测不准确，导致未被临床广泛应用。


技术实现要素：

3.基于此，有必要针对以上问题，提供一种血液样本中中性粒细胞cd64的测定方法，其能够提高中性粒细胞cd64检测准确性。
4.本发明的目的在于提供一种血液样本中中性粒细胞cd64的测定方法，包括以下步骤：
5.采用流式细胞仪对经cd45抗体、cd14抗体和cd64抗体共孵育过的血液样本进行圈门，根据光学信息分别圈出所述血液样本中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，所述cd45抗体、所述cd14抗体和所述cd64抗体分别用不同的荧光基团进行标记；
6.分别获取所述中性粒细胞、所述淋巴细胞和所述单核细胞的中的所述cd64抗体的荧光强度的平均值；
7.采用如下公式对cd64指数进行计算：
8.cd64指数＝(中性粒细胞cd64抗体的荧光强度平均值－淋巴细胞cd64抗体的荧光强度平均值)
÷
(单核细胞cd64抗体的荧光强度平均值－淋巴细胞cd64抗体的荧光强度平均值)。
9.在其中一个实施例中，获取所述中性粒细胞、所述淋巴细胞和所述单核细胞的中的所述cd64抗体的荧光强度的平均值的步骤包括：
10.分别获取所述中性粒细胞、所述淋巴细胞和所述单核细胞上cd64抗体的荧光强度峰图，然后计算平均值。
11.在其中一个实施例中，按照所述cd45抗体、所述cd14抗体和所述cd64抗体的浓度各为1μg/μl计，所述血液样本按照采集后未稀释计，所述cd45抗体、所述cd14抗体、所述cd64抗体与所述血液样本的体积比分别为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2):10。
12.在其中一个实施例中，所述圈门的步骤包括：
13.用侧向散射光和cd45荧光检测经cd45抗体、cd14抗体和cd64抗体共孵育过的血液样本，圈出样本中的白细胞；
14.在圈出的白细胞中，用cd45荧光分别圈门中性粒细胞和淋巴细胞；
15.在圈门的白细胞中，用cd14荧光圈门单核细胞。
16.在其中一个实施例中，所述孵育为避光孵育。
17.在其中一个实施例中，避光孵育的时间为15min～30min。
18.在其中一个实施例中，还包括在圈门之前去除抗体共孵育后的所述血液样本中的红细胞的步骤。
19.在其中一个实施例中，除去血液样本中的红细胞的方法为用溶血剂孵育。
20.在其中一个实施例中，所述溶血剂中含有氯化镁、氯化钙、柠檬酸钠、甘油和甲醛。
21.在其中一个实施例中，用溶血剂孵育的时长为14min～16min。
22.本发明采用流式细胞术检测血液样本中中性粒细胞的cd64含量。目前测定中性粒细胞cd64的计算方法没有标准化，经过大量的数据计算发现现有方法的特异性偏低，准确性偏低，且有的公式的灵敏度也较低。发明人经大量数据研究发现，本发明的检测方法相对于其他方法能够有效提高检测的敏感度和特异性。
23.本发明提高检测准确度的方法主要是通过提高圈门准确性和提高计算准确性来实现。本发明用cd14、cd45、cd64三种抗体联合进行圈门，集合了单抗、双抗的所有优点，不仅以cd45通道将白细胞群与碎片区分，能够将淋巴细胞和中性粒细胞圈出来，还可以用cd14通道将单核细胞圈出来，淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的三圈更为独立，相互之间影响、重叠部分较少，圈门结果更为准确。本发明的流式圈门方法不会过度依赖技术人员的经验，保证了检测的一致性，使圈门方式更为精准也更加简单明了。在圈门准确的基础上，发明人发现，采用本发明的计算公式，把淋巴细胞表达的cd64荧光强度当作背景强度给予去除，可以更有效提高检测的敏感度及特异性。
附图说明
24.图1为本发明一实施例的前侧向圈门的结果，通过细胞大小和复杂程度可以来圈门看出白细胞(wbc)所占百分比；
25.图2为以cd45荧光通道圈门白细胞(wbc)所占比值；
26.图3为在图2圈出的wbc中以cd45荧光通道圈门中性粒细胞和淋巴细胞；
27.图4为在图2圈出的wbc中以cd14荧光通道圈门单核细胞；
28.图5以图3圈门的中性粒细胞和淋巴细胞和图4圈门的单核细胞，通过由荧光抗体标记的cd64抗体在淋巴、中性粒细胞和单核上表达的荧光强度峰图以及得到的一个平均值。
具体实施方式
29.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
30.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具
体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
31.本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
32.用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
33.当描述一个可测量的值，例如参数，量，时间期限等时，本文中所使用的术语“约”意欲涵盖与指定值相差+/-20％或更少、优选+/-10％或更少、更优选+/-5％或更少、更优选+/-1％或更少，更优选+/-0.1％或更少的变化，此类变化适宜在所披露的发明中使用。
34.cd14：即lps(lipopolysaccharide)受体，最初是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原。cd14(包括mcd14和scd14)的化学结构为糖蛋白，其生物学功能主要是识别、结合lps或lps/lbp复合物，介导lps所致的细胞反应，在lps性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。
35.cd45：分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原(leukocyte common antigen,lca)。cd45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物p56lck和p59fyn上酪氨酸脱磷酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用，cd45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义，cd45的分布可作为某些t细胞亚群的分类标志。
36.cd64：能识别免疫球蛋白、对igg单体具有高亲和力、介导体液免疫和细胞免疫、对感染性疾病具有早期诊断价值的igg fc片段受体1(fcγrⅰ)。正常情况下，cd64主要表达于巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞表面，中性粒细胞表面几乎不表达cd64。当机体患感染性疾病(例如：绝大多数的上呼吸道感染，乙肝、丙肝病毒感染引起的病毒病肝炎，脓毒血症，eb病毒感染，传染性单核细胞增多症，乙型脑炎，败血症等)时，中性粒细胞表面cd64表达迅速升高。cd64作为感染性疾病良好的诊断指标，在临床上具有广泛的应用前景。
37.因此，将中性粒细胞单独筛选出来，并对其上的cd64表达进行检测，可用于作为感染性疾病良好的诊断指标。
38.需要说明的是，本发明属于非疾病诊断目的的检测方法，cd64指数并不能够100％直接判断感染性疾病的发生，需要配合其他临床诊断方法进行综合判定。
39.可选地，所述感染性疾病包括上呼吸道感染、病毒病肝炎、脓毒血症、eb病毒感染、传染性单核细胞增多症、乙型脑炎和败血症。
40.本发明实施例提供一种血液样本中中性粒细胞cd64的测定方法，包括以下步骤：
41.采用流式细胞仪对经cd45抗体、cd14抗体和cd64抗体共孵育过的血液样本进行圈门，根据光学信息分别圈出所述血液样本中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，所述cd45抗体、所述cd14抗体和所述cd64抗体分别用不同的荧光基团进行标记；
42.分别获取所述中性粒细胞、所述淋巴细胞和所述单核细胞的中的所述cd64抗体的荧光强度的平均值；
43.采用如下公式对cd64指数进行计算：
44.cd64指数＝(中性粒细胞cd64抗体的荧光强度平均值－淋巴细胞cd64抗体的荧光
强度平均值)
÷
(单核细胞cd64抗体的荧光强度平均值－淋巴细胞cd64抗体的荧光强度平均值)。
45.本发明采用流式细胞术检测血液样本中中性粒细胞的cd64含量。目前测定中性粒细胞cd64的计算方法没有标准化，经过大量的数据计算发现现有方法的特异性偏低，准确性偏低，且有的公式的灵敏度也较低。发明人经大量数据研究发现，本发明的检测方法相对于其他方法能够有效提高检测的敏感度和特异性。
46.本发明提高检测准确度的方法主要是通过提高圈门准确性和提高计算准确性来实现。本发明用cd14、cd45、cd64三种抗体联合进行圈门，结果表明该圈门方法可以使得淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的三圈更为独立，相互之间影响、重叠部分较少，圈门结果更为准确。在圈门准确的基础上，发明人发现，采用本发明的计算公式，把淋巴细胞表达的cd64荧光强度当作背景强度给予去除，可以更有效提高检测的敏感度及特异性。
47.在一些实施方式中，所述圈门的步骤包括：
48.用侧向散射光和cd45荧光检测经cd45抗体、cd14抗体和cd64抗体共孵育过的血液样本，圈出样本中的白细胞；
49.在圈出的白细胞中，用cd45荧光分别圈门中性粒细胞和淋巴细胞；
50.在圈门的白细胞中，用cd14荧光圈门单核细胞。
51.流式细胞技术：(flow cytometry,fcm):是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。广泛应用于免疫表型分析、dna含量及细胞周期分析、定量分析、细胞功能分析、凋亡研究以及其它多方面。
52.设门(圈门)(gating)：是指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。通过“设门”得到不同的区域(region)，从而对其中的细胞进行单参数或多参数分析。
53.流式细胞术数据分析目的就是需要确定所要研究的目的细胞器，这就涉及到设门。设门就是划定某一区域的细胞群体，对其单独加以分析或分选。门的形状可任意，方法有如下几种：
54.(1)阙值设门。fsc(前向散射光)是最常用的阈值参数。fsc和细胞的大小正相关。用fsc设阈值，可以使低于该阈值的细胞碎片等其他杂质的信号不被处理。
55.(2)散射光设门。以fsc和ssc(侧向散射光)联合设门较常用。其最大优点是可以排除碎片或噪声的干扰。可以根据fscvsssc散点图上不同细胞分布不同来设门目的细胞群。
56.另外还有荧光设门、反向设门和组合设门。流式细胞术的数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。应该注意到设门是一个主观行为，是人为做出的决定，不同的人设门会存在很大差异，它是流式细胞术中最难掌握的技术。因此，对设门有2点需要把握:首先，设门尽可能客观:其次，应该认识到设门需要主观决策。为了尽量减少主观判断带来的误差，最好分选一些细胞用显微镜观察来进一步确认门的客观性和准确性。
57.流式细胞术的设门的注意事项:
58.通过流式细胞术分析细胞样品时，欲获得更加准确的分析结果，应用最优化的设门策略非常重要。要考虑的因素包括:
59.1)排除细胞碎片；
60.2)应用合适的荧光阴性对照；
61.3)排除死细胞；
62.4)如果合适，使用一种共享标记物(比如cd45白细胞标记或与之等效的泛细胞群标记)染色；
63.5)设置必需的荧光分析点图。
64.总的来说，设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。为了正确地识别目的细胞，需要综合生物知识和流式操作经验，才能正确的圈出表示最终的目的区域。设门是一个全有或全无数据减少处理。将门内细胞移动到下一个分析要点，而同时门外的细胞，也会被排除在外。
65.圈门的准确是实现后续特定细胞(中性粒细胞)中特定靶标(cd64)检测准确的先决条件。
66.本发明用cd14、cd45、cd64三种抗体联合进行圈门，集合了单抗、双抗的所有优点，不仅以cd45通道将白细胞群与碎片区分，能够将淋巴细胞和中性粒细胞圈出来，还可以用cd14通道将单核细胞圈出来，淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的三圈更为独立，相互之间影响、重叠部分较少，圈门结果更为准确。本发明的流式圈门方法不会过度依赖技术人员的经验，保证了检测的一致性，使圈门方式更为精准也更加简单明了。
67.在一些实施方式中，获取所述中性粒细胞、所述淋巴细胞和所述单核细胞的中的所述cd64抗体的荧光强度的平均值的步骤包括：
68.分别获取所述中性粒细胞、所述淋巴细胞和所述单核细胞上cd64抗体的荧光强度峰图，然后计算平均值。
69.在一些实施方式中，按照所述cd45抗体、所述cd14抗体和所述cd64抗体的浓度各为1ug/ul计，所述血液样本按照采集后未稀释计，所述cd45抗体、所述cd14抗体、所述cd64抗体与所述血液样本的体积比分别为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2):10。优选的，所述cd45抗体、所述cd14抗体、所述cd64抗体的质量相等。
70.在一些实施方式中，所述cd45抗体、cd14抗体和cd64抗体共孵育为避光孵育。
71.在一些实施方式中，避光孵育的时间可以为15min～30min，例如15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min。
72.在一些实施方式中，还包括在圈门之前去除抗体共孵育后的所述血液样本中的红细胞的步骤。
73.在一些实施方式中，除去血液样本中的红细胞的方法为用溶血剂孵育。
74.在一些实施方式中，所述溶血剂中含有氯化镁、氯化钙、柠檬酸钠、甘油和甲醛。所述溶血剂可以由氯化镁、氯化钙、柠檬酸钠、甘油和甲醛可按不同比例加超纯水配置而成。在一些实施方式中，所述溶血剂与所述血液样本的体积比为1:(0.8～1.2)。
75.在一些实施方式中，用溶血剂孵育的时长为14min～16min，例如14min、14.5min、15min、15.5min、16min。
76.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
77.实施例1
78.方法步骤如下：
79.标本采集：采用edta-k2或肝素抗凝管进行空腹采血不少于2ml；
80.样本要求：
81.1.采集不少于200μl的外周血样本用edta-k2或肝素抗凝后室温存放。
82.2.样本要存放于室温且避免震摇，采集后24小时内使用。
83.3.样品染色后避光保存于2～8℃，需要配合血细胞分析用溶血剂使用，裂解样品中的红细胞，24小时内上机检测。
84.4.样本如有微生物污染、脂血、凝血及细胞活力不佳，则应避免使用，除非样本具有不可替代性，请在结果报告时标注。对于慢性肝病或高脂血症等患者标本，溶血剂无法完全裂解红细胞，可采用密度梯度离心法处理。
85.检验原理：实验检测样本加入试剂时，试剂中的荧光标记抗体特异性与白细胞表面抗原相结合，之后使用血细胞分析用溶血剂处理染色样本，裂解红细胞。在获取过程中，细胞穿过激光光束并使激光发生散射，同时染色细胞发出荧光。通过这些有仪器检测到的散射的荧光信号，我们能了解关于细胞的大小、内部复杂程度和相应抗原表达强度等信息。
86.操作步骤如下：
87.1.取经过充分消毒的流式管进行编号且与样本编号一致；
88.2.各取cd45、cd14、cd64的单克隆荧光抗体(标记荧光如下：cd14-fitc，cd45-percp，cd45-pe)5μl进行充分混匀，加入步骤1内，采用反向移液技术吸取50ul反混匀的外周血样本，加入管底，避免样本碰到管壁上部；如果是单抗体或者双抗体则同样是取相应抗体各5μl与50ul反混匀的外周血样本混合；
89.3.室温避光孵育20min；
90.4.向流式管内加入500μl的1*溶血素，进行充分混匀，室温避光孵育15min取出；
91.5.充分混匀等待流式上机。
92.流式圈门过程如图1～4所示。其中lym为淋巴细胞，pmn为粒细胞，mono为单核细胞。图1中通过细胞大小和复杂程度可以来圈门看出白细胞(wbc)所占百分比。图2中通过三系细胞细胞表面cd45表达圈门白细胞(wbc)所占比值，圈门p1。图3为在图2圈出的wbc中，通过三系细胞细胞表面cd45表达圈门中性粒细胞和淋巴细胞。可以看出目标细胞在图2所设门的wbc中所占比值。分别圈门淋巴细胞p2，中性粒细胞p3。图4为在图2圈出的wbc中，通过单核细胞表面cd14表达圈门单核细胞，可以看出单核细胞在图2所设门的wbc中所占比值。
93.荧光强度计算入图5所示。图5为以图3中性粒细胞和淋巴细胞、图4单核细胞圈门，通过由荧光抗体标记的cd64抗体在淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞上表达的荧光强度峰图，得到一个平均值。从三抗体的整体图可以看出，三抗体的图集合了单抗双抗所有的优点，不仅以cd45通道将wbc群与碎片区分，还以cd14通道将单核细胞单独出来，三群更为独立，相互之间影响较小，重叠部分较少，所以结果更为准确可靠，可以为我们各个计算公式提供更准确稳定的pmn、lym、mono的荧光强度，减少误差。
94.以上为该实施例的样本的圈门方法。
95.将采用以上圈门方法圈出的样本，采用不同的计算方法进行计算。结果如下表1和表2所示。
96.算法1：
97.98.算法2：
[0099][0100]
算法3：
[0101][0102]
本专利算法：
[0103][0104]
其中：pmn为中性粒细胞，lym为淋巴细胞，mono为单核细胞，mfi为平均荧光强度。
[0105]
所有样本均来源于翔宇医学检验实验室收集的临床样本。
[0106]
表1不同算法和细胞计数在感染性疾病血液样本中提示感染数、灵敏度比较
[0107][0108][0109]
参考值范围的确定方法为：首先采用流式细胞仪对经cd45抗体、cd14抗体和cd64抗体共孵育过的血液样本进行圈门，根据光学信息分别圈出所述血液样本中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞；而后采用相应的算法公式对cd64指数进行计算；收集所有检测样本的数值，而后采用统计学方法，即可得到一个参考值(例如本实施例《15)。算法1，算法2和算法3是则采用不同的公式计算后得到的参考值。
[0110]
表2不同算法和细胞计数在正常人血液样本中提示感染数、灵敏度比较
[0111][0112]
根据上述实验数据发现，本实施例算法的灵敏度较高，且在保证灵敏度高的情况下，最大程度地提高了特异性。可以有效地降低误诊率(假阳性)，并且增加检出率(假阴性)，能更好地为临床服务作指导。
[0113]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0114]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。