来特莫韦中间体二D-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质的分析方法与流程

来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质的分析方法
技术领域
1.本发明属于药品原料分析技术领域，具体是一种来特莫韦中间体二d-(+)
‑ꢀ
二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物的有关物质分析方法。


背景技术：

2.来特莫韦是一种巨细胞病毒(cmv)dna端酶复合物抑制剂，用于预防巨细胞病毒(cmv)感染及成人异基因造血干细胞移植(hsct)巨细胞病毒(cmv)-血清阳性受体疾病，由aicuris研发，2012年授予默沙东在全球范围内的开发和销售权，2017年11月1日最先在加拿大批准上市，2017年11月8日在美国批准上市， 2018年1月8日在欧盟批准上市，2018年5月22日在日本批准上市。该药通过抑制cmv dna末端酶复合物(pul51，pul56和pul89)的活性，阻止病毒dna 的加工和包装，而发挥抗病毒作用。随着社会的发展，进行造血干细胞移植治疗的病例将会不断增加，对相关药物的需求必将显著增加。但目前可选的药物不多，来特莫韦是最新的一种，而对其原料合成工艺过程中中间体二拆分体盐质量的控制，非常重要。来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物分子式为c
54h56
f4n4o
14
，分子量为1061.03，结构式如下式：
[0003][0004]
来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物是来特莫韦中间体二用乙酸乙酯溶解后，加入d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸进行拆分，过滤，收集滤饼，加入乙酸乙酯进行回流，降温析出，乙酸乙酯洗涤，最后真空干燥获得。
[0005][0006]
来特莫韦中间体二为消旋体，属于粘稠油状物，不适于进行质量控制，在进行拆分以后，可以由油状物变为白色固体，并将消旋体转变为s构型化合物，为确保下游的来特莫韦原料药符合杂质质量标准，可以在该步骤进行严格的质量控制。
[0007]
来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物合成路线为：
[0008][0009]
来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物杂质a为合成工艺残留稀释剂杂质a，分子式：c6h7n，分子量：93.13，化学结构式如下式：
[0010][0011]
来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物杂质b为起始原料，分子式：c
19h16
f4n2o4，分子量：412.33，化学结构式如下式：
[0012][0013]
来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物杂质c为工艺降解杂质，分子式：c
18h14
f4n2o4，分子量：398.31，化学结构式如下式：
[0014][0015]
来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物杂质d为工艺降解杂质，分子式：c
29h28
f4n4o4，分子量：572.55，化学结构式如下式：
[0016][0017]
为了控制来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物的质量，需要对杂质进行控制，因为d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸、乙酸乙酯均具有紫外吸收，同时需要关注这两者与本品中杂质a、杂质b、杂质c、杂质d 的分离度，且d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸与杂质a极性、pka差距较大，需要在同一个系统中进行合理控制，但现有的技术中没有适合于简便、全面、精准分析检测来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质的分析方法。因此，对于来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质的测定方法存在进一步的建立和优化的需求。


技术实现要素：

[0018]
鉴于现有技术中没有适合于简便、全面、精准分析检测来特莫韦中间体二 d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质的分析方法，本发明提供一种来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质的分析方法，具有简便全面、灵敏度高、准确可靠的优点。
[0019]
本发明为了解决上述技术问题采用如下技术方案：一种来特莫韦中间体二 d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质的分析方法，采用高效液相色谱法进行分离测定的步骤，其中，所述高效液相色谱的条件为：
[0020]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐溶液为流动相a、乙腈为流动相b进行梯度洗脱；梯度洗脱的程序为：
[0021][0022]
流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃；采用高效液相色谱仪对来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物的有关物质进行检测，检测波长为205～220nm。
[0023]
进一步，磷酸盐溶液的ph值为5.5～6.5，优先磷酸盐溶液ph值为6.0；由此，可以改善主峰及各杂质的保留时间；因d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸pka 为1.46，杂质apka为5.97，磷酸盐溶液的ph值为4.0～5.0时，杂质a色谱峰与稀释剂重合，色谱柱中几乎不保留，不利于杂质a的控制，ph》7时，来特莫韦中间体二柱效降低且易降解。
[0024]
磷酸盐溶液选自磷酸二氢钠溶液或磷酸二氢钾溶液，优先磷酸盐为磷酸二氢钾，磷酸盐溶液的浓度为5mmol/l～50mmol/l，优选磷酸盐溶液浓度为20mmol/l；由此，可以提高主峰与相邻未知杂质的分离度，提高主峰的峰形及柱效。
[0025]
进一步，高效液相色谱柱长度为150mm～250mm，柱内径为4.6mm；优先色谱柱长度为250mm；由此，可以提高主峰与相邻未知杂质的分离度。
[0026]
进一步，填充剂的粒径为1.8μm～5μm；优选所述填充剂的粒径为3μm；由此，可以进一步提高分离度。
[0027]
进一步，流动相流速为1.0ml/min，柱温35℃；由此，可以进一步提高分离度。
[0028]
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
[0029]
1、在本发明采用的液相色谱条件下检测的来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物的有关物质检测中，可以使d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸与乙酸乙酯的色谱峰不影响杂质a、杂质b、杂质c、杂质d的检出，可以提高主峰与相邻未知杂质的分离度，提高主峰的峰形及柱效；
[0030]
2、本发明提供一种来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物的分析方法，具有简便全面、灵敏度高、准确可靠的优点。
具体实施方式
[0031]
为了本发明的技术方案和有益效果更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明。
[0032]
本技术中，如无特别说明，所述水均为蒸馏水；所述稀释剂均为乙腈-水为 80:20(v:v)。
[0033]
溶液配制：
[0034]
杂质对照品贮备液：取杂质a对照品、杂质b对照品、杂质c对照品、杂质 d对照品对照品各约10mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0035]
系统适用性溶液：
[0036]
取来特莫韦中间体二对照品约25ml，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述50ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0037]
供试品溶液：
[0038]
取来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。
[0039]
氧化降解供试品溶液：
[0040]
取来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物约25mg，置50ml量瓶中，加入3％双氧水溶液1ml，室温放置1小时，加稀释剂溶解稀释至刻度。该溶液为验证该方法对于极端放置条件下样品有关物质的检测能力。
[0041]
碱降解供试品溶液：
[0042]
取来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物约25mg，置50ml量瓶中，加入1mol/l氢氧化钠溶液1ml，50℃加热0.5小时，加稀释剂溶解稀释至刻度。该溶液为验证该方法对于极端放置条件下样品有关物质的检测能力。
[0043]
酸降解供试品溶液：
[0044]
取来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物约25mg，置50ml量瓶中，加入1mol/l盐酸溶液1ml，50℃加热1小时，加稀释剂溶解稀释至刻度。该溶液为验证该方法对于极端放置条件下样品有关物质的检测能力。
[0045]
加热降解供试品溶液：
[0046]
取来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物约25mg，置50ml量瓶中，65℃加热6小时，加稀释剂溶解稀释至刻度。该溶液为验证该方法对于极端放置条件下样品有关物质的检测能力。
[0047]
光照降解供试品溶液：
[0048]
取来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物约25mg，置50ml量瓶中，置5500lx条件下照射约48小时，取出，加稀释剂溶解稀释至刻度。该溶液为验证该方法对于极端放置条件下样品有关物质的检测能力。
[0049]
测定：
[0050]
分别将空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液、氧化降解供试品溶液、碱降解供试品溶液、酸降解供试品溶液、加热降解供试品溶液、光照降解供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料(粒径为5μm，柱内径为4.6mm，色谱柱长度为250mm)；利用5～50mmol/l磷酸二氢钾溶液(用饱和氢氧化钠溶液调ph值至5.5～6.5)为流动相a，乙腈为流动相b；利用波长为205nm～220nm，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为30～40℃；利用上述梯度洗脱表进行检测，记录色谱图。
[0051]
结果表明：本品在光照和加热条件下强制破坏，较稳定，无明显杂质产生；在氧化强制破坏下，较不稳定，降解出未知杂质(rt＝25.000min)；在碱强制破坏下，较不稳定，降解出未知杂质(rt＝20.952min)；在酸强制破坏下，较不稳定，降解出未知杂质(rt＝20.976min)。各降解条件下，主峰与相邻杂质峰分离度均大于1.5，分离度良好，所产生的杂
质利用该色谱条均可准确检出。
[0052]
本发明方法学验证结果：
[0053]
1、专属性
[0054]
供试品溶液：取供试品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0055]
杂质a对照品贮备液：取杂质a对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0056]
同法配制杂质c、杂质b、杂质d、来特莫韦中间体二对照品贮备液。
[0057]
杂质a定位溶液：精密量取杂质a贮备液2ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0058]
同法配制杂质c、杂质b、杂质d、来特莫韦中间体二定位溶液。
[0059]
d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸定位溶液：取d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释制刻度，摇匀，即得。
[0060]
乙酸乙酯定位溶液：取乙酸乙酯约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂并稀释刻度，摇匀，精密量取2ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0061]
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0062]
系统适用性溶液：取供试品(批号：08-04-2104001)约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取加入杂质d对照品贮备液0.5ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0063]
混合溶液：取供试品(批号：08-04-2104001)约50mg，精密称定，置100ml 量瓶中，精密量取加入杂质a、杂质c、杂质b对照品贮备液各1.0ml，杂质d 对照品贮备液0.5ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。见表1。
[0064]
表1来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质分析方法验证专属性试验结果
[0065][0066]
2、仪器精密度
[0067]
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。见表2。
[0068]
表2来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质分析方法验证仪器精密度试验结果
[0069][0070]
3、定量限试验
[0071]
定量限溶液：准确配制来特莫韦原料中间体二与各杂质(对照品贮备液)，分别用稀释剂稀释若干倍，至获得信噪比(s/n)不得小于10的溶液，连续进样6次，测定峰面积的相对标准偏差(rsd)值均小于10％。见表3。
[0072]
表3来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质分析方法验证定量限试验结果
[0073]
[0074][0075]
4、检测限试验
[0076]
检测限溶液：取定量限溶液用溶剂逐步稀释。见表4。
[0077]
表4来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质分析方法验证检测限试验结果
[0078][0079]
5、重复性试验(供试品中杂质a多批次未检出，重复性中没有进行研究)
[0080]
杂质对照品贮备液：取杂质b、c、d适量，精密称定，置同一100ml量瓶中，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml约含杂质b、杂质c、杂质d分别为0.1mg、0.1mg和0.05mg的混合溶液。
[0081]
加杂供试品溶液：取供试品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取杂质对照品贮备液1.0ml，置同一100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制6份。
[0082]
对照溶液：精密量取加杂供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，摇匀，即得。见表5。
[0083]
表5来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质分析方法验证重复性试验结果
[0084]
[0085][0086]
6、准确度
[0087]
供试品溶液：取供试品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml 约含0.5mg的溶液。
[0088]
杂质c对照品贮备液：取杂质c对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0089]
杂质b对照品贮备液：取杂质b对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0090]
杂质d对照品贮备液：取杂质d对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0091]
杂质a对照品贮备液：取杂质a对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0092]
杂质混合贮备液：精密量取杂质c、杂质b、杂质a杂质贮备液10ml，杂质d杂质贮备液5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0093]
对照品溶液：精密量取混合杂质贮备液10ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0094]
定量限加杂供试品溶液：按照定量限浓度配制定量限加杂供试品。同法配制 3份。
[0095]
50％加杂供试品溶液：取供试品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取杂质混合贮备液5.0ml，置同一100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制3份。
[0096]
100％加杂供试品溶液：取供试品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取杂质混合贮备液10.0ml，置同一100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制3份。
[0097]
150％加杂供试品溶液：取供试品(批号：08-04-2104001)约50mg，精密称定，置
100ml量瓶中，精密量取杂质混合贮备液15.0ml，置同一100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制3份。见表6。
[0098]
表6来特莫韦中间体二d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸乙酸乙酯络合物有关物质分析方法验证准确度试验结果
[0099]
[0100]
[0101][0102]
应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用于理解本发明，并不用于限定本发明，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。