一种脂质精细结构分析流程和控制处理系统的制作方法

1.本技术涉及分析化学的技术领域，更具体地说，它涉及一种脂质精细结构分析流程和控制处理系统。


背景技术：

2.脂质是细胞膜的重要组成部分，其参与诸如能量存贮、信号传导等生物体的重要生理过程。不同生物体之间，以及同一生物体的不同个体之间，脂质组成存在较大差异。根据脂质脂肪酸链组成是否含有碳碳双键，脂质可以分类为饱和脂质(不含有碳碳双键)和不饱和脂质(含有碳碳双键)。
3.脂质的异常代谢会引起生物体的多种生理疾病；同样，生物体的生理异常和疾病也会影响脂质的组成和代谢。因此，脂质精细结构的鉴定不仅对生命体生理过程的研究有重要作用，还能够为疾病的表征提供信息和依据。相关研究表明，在分泌途径涉及的相关细胞器中、以及一些分化结构如神经轴突中，不饱和脂质的分布呈现规律性变化；同时，在卵巢癌干细胞中能明显看到脂质不饱和度的增加，故不饱和脂质可作为癌症治疗的靶点；另外，碳碳双键位置异构体比例在多种疾病组织与正常组织中会存在差异性变化，也是潜在的疾病生物标志物指标。因此，脂质精细结构鉴定具有重要的生物学意义和临床价值。
4.质谱(ms)方法可以提供高灵敏度和结构表征能力的无标记检测，其高选择性以及高通量的特征使得它在脂质组学上的应用受到越来越多的关注。但是，质谱分析在脂质结构的高通量分析方面，普遍只能做到脂质亚类和脂肪酸链的鉴定，无法深入到精细结构(如碳碳双键位置异构)的分析。
5.截至目前，已有多种质谱(ms)和化学衍生化方法被开发，如臭氧诱导解离(ozid)、紫外光解离(uvpd)、环氧化衍生(expoxidation)-质谱碰撞诱导解离(cid)等。但是，由于仪器改装较为复杂，且反应时间较长，难以满足高通量检测的需求，上述方法并未在脂质组学中广泛应用。光化学衍生(patern
ò‑bü
chi反应，pb反应)可以利用含有羰基的双键反应试剂或其对应的衍生物，将脂质中碳碳双键衍生为化学上相对稳定的氧杂环丁烷，且该结构很容易通过低能cid选择性碎裂，所产生的定性定量离子的相对丰度高，便于脂质的定量和定性分析。但是基于pb反应的脂质精细结构解析过程，存在方法设置及数据处理专业度高、难度大、耗时长等问题，难以普适应用。
6.因此，亟待开发并建立一种系统化的高效、快速地对复杂脂质体系中的不同脂质组分进行精准分析的高效易用的新工具。


技术实现要素：

7.为了深入脂质精细结构的分析，并进一步系统、简易流程化确定不饱和脂质中的碳碳双键位置和相对定量信息，本技术提供一种脂质精细结构分析流程和控制处理系统。
8.本技术利用光化学反应与质谱联用技术分析脂质精细结构的方法，通过简化或智能化仪器控制或数据转化、数据分析和报告输出，建立了相应的分析流程并开发了配套的
控制处理系统，可以降低对操作人员专业要求和简化分析流程工序。本技术提供的分析流程可高效、快速、系统、简易地对复杂脂质体系中的不同脂质组分进行精准分析，包括碳碳双键位置的定位，并进一步实现对碳碳双键位置异构体的相对定量，为脂质异构体生物学研究提供了一种高效易用的新工具。
9.本技术提供的一种脂质精细结构分析流程和控制处理系统，采用如下的技术方案：
10.一种脂质精细结构分析流程和控制处理系统，所述控制处理系统具备仪器控制功能，且兼具数据转化、数据分析和报告输出的处理功能。
11.所述分析流程经控制处理系统执行且具体包括以下步骤：
12.(1)利用液相色谱分离-一级质谱对样品进行检测，获得一级质谱图；
13.解读一级质谱图的数据，获得脂质一级质谱的精确离子质荷比；
14.根据获得的精确离子质荷比，与数据库a比对，结合脂质保留时间信息，确定脂质亚类信息，并根据脂质亚类信息，确定下一步液相色谱-质谱采集方法；
15.(2)根据步骤(1)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-二级质谱对样品进行检测，获得二级质谱图；
16.解读二级质谱图的数据，获得脂质二级质谱的精确离子质荷比；
17.根据获得的精确离子质荷比，与数据库b比对，确定脂肪酸链组成，并根据脂肪酸链组成，确定下一步液相色谱-质谱采集方法；
18.(3)根据步骤(2)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-光化学衍生-二级质谱对光化学衍生产物进行检测，获得光化学衍生-二级质谱图；
19.解读光化学衍生-二级质谱图的数据，获得光化学衍生产物的二级质谱的精确离子质荷比；
20.根据获得的精确离子质荷比，与数据库c比对，确定脂质中碳碳双键的位置；
21.并根据不饱和脂质光化学衍生产物的质谱碎片强度比或强度和之比，确定脂质碳碳双键位置异构体的相对定量信息。
22.通过采用上述技术方案，本技术对脂质进行三步分析：第一步，对样品进行一级质谱分析，输出脂质亚类结果，并完成第二步方法的创建；第二步，触发运行第二步方法，对样品进行二级质谱分析，输出脂肪酸链组成结果，并完成第三步方法的创建；第三步，触发运行第三步方法，对光化学衍生产物进行二级质谱分析，分析特征碎片离子，输出脂质精细结构。光化学衍生(patern
ò‑bü
chi反应，pb反应)可以将脂质中碳碳双键衍生为化学上相对稳定的氧杂环丁烷，且该结构很容易通过低能cid选择性碎裂，所产生的定性定量离子的相对丰度高，便于脂质的定量和定性分析。利用本技术提供的脂质精细结构分析流程，能够获得脂质精细结构的全部数据。脂质精细结构的全部数据包括但不限于脂质亚类、脂肪酸链组成、碳碳双键位置及相对定量信息。
23.本技术提供的脂质精细结构分析流程中，可选用自动模式或者辅助手动模式。自动模式下，技术方案中所有操作均可自动实现，包括样品检测(如全流程方法自动创建和触发运行、仪器控制等)，以及含有结果比对、分析、确定和输出的数据自动解析。辅助手动模式支持全流程引导、二级质谱采集方法参数生成和数据自动解析，仅流程方法创建与触发运行需要手动操作。当分析流程使用的是辅助手动模式时，全流程引导过程会提供流程方
法的主要参数，包括但不限于二级质谱的前体离子信息，从而辅助工作人员创建流程方法。
24.本技术的脂质分析流程中，可预先校准脂质的保留时间，使后续分析流程可使用保留时间信息。具体操作为：按照液相色谱-一级质谱方法对指定样品进行检测，通过提取指定样品中已知脂质精确离子质荷比的色谱图，获得不同类型脂质的保留时间，并对保留时间进行校正。其中，保留时间校正完成后，可进行一次或多次脂质精细结构的分析。
25.本技术提供的脂质精细结构分析流程中，支持全流程方法的自动创建和触发运行，同时也支持数据的自动解析。通过自动解析结果、并自动生成仪器流程方法或辅助工作人员设置仪器分析方法，从而能够快速分析复杂样品中的脂质成分，在实现对脂质中碳碳双键位置的的精准自动化分析及相对定量的基础上，大大提升了工作人员的工作效率。
26.优选的，所述样品为包含脂质或脂质类似物的样品。
27.优选的，所述样品为中药、生物组织、食品、人体或动物体的离体检测样本、人工合成生物组织中的任意一种。
28.本技术中，所述样品可以是中药。具体的，所述样品可以是虫草。
29.本技术中，所述样品可以是生物组织。具体的，所述样品可以是牛肝。
30.本技术中，所述样品可以是人体或动物体的离体检测样本。具体的，所述样品可以是血清。
31.本技术中，所述样品可以是食品。具体的，所述样品可以是鱼肉。
32.优选的，所述步骤(1)中的脂质保留时间信息，可用于区分有相同或相似精确离子质量但属于不同种类的脂质。
33.优选的，所述步骤(1)中的脂质保留时间信息可预先校准，使后续分析流程可使用脂质保留时间信息。
34.优选的，所述步骤(3)中用到的光化学衍生试剂为含有羰基的双键反应试剂或其对应的衍生物。
35.优选的，所述步骤(3)中用到的光化学衍生试剂混合在流动相中，可实现在线衍生和检测。
36.优选的，所述步骤(3)中的光化学衍生的波长为190-760nm。
37.优选的，所述数据库a、所述数据库b、所述数据库c指向含有所需对应信息的同一数据库或不同数据库。
38.通过采用上述技术方案，当数据库a、数据库b、数据库c指向同一数据库时，该数据库包含但不限于脂质及其类似物的保留时间、脂质及其类似物光化学衍生产物的保留时间、脂质及其类似物的一级质谱精确离子质荷比、脂质及其类似物光化学衍生产物的一级质谱精确离子质荷比、脂质及其类似物的二级质谱精确离子质荷比、脂质及其类似物光化学衍生产物的二级质谱精确离子质荷比、脂质及其类似物的三级质谱精确离子质荷比、脂质及其类似物光化学衍生产物的三级质谱精确离子质荷比等信息。当数据库a、数据库b、数据库c指向不同数据库时，三个数据库分别包含但不限于其所需的对应信息。
39.优选的，流动相溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇、缓冲盐、有机酸、无机酸、有机碱、无机碱中的一种或几种的混合。
40.优选的，光化学衍生试剂与样品的摩尔比可以是1
×
10-9
～1
×
109。
41.优选的，质谱分析中采用的仪器为飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪或三重四级杆
质谱仪。
42.优选的，所述质谱分析中采用碎裂能量为1～200ev，或仪器上所对应的类似能量。
43.优选的，所述步骤(3)中的光照反应时间为0.1～1200s。
44.优选的，所述分析流程使用自动模式或辅助手动模式中的任意一种。
45.其中，自动模式下，技术方案中所有操作均可自动实现。辅助手动模式支持全流程引导、二级质谱采集方法参数生成和数据自动解析，仅流程方法创建与触发运行需要手动操作。
46.当分析流程使用的是辅助手动模式时，全流程引导过程会提供流程方法的主要参数，包括但不限于二级质谱的前体离子信息，从而辅助工作人员创建流程方法。
47.综上所述，本技术具有以下有益效果：
48.1、本技术首次提出利用光化学反应与质谱联用技术自动或辅助手动分析脂质精细结构的方法，并建立了利用光化学反应与质谱联用技术分析脂质精细结构的分析流程。
49.2.本技术提供的分析流程可高效、快速地对复杂脂质体系中的不同脂质组分进行精准分析，包括碳碳双键位置的定位，及碳碳双键位置异构体的相对定量，为脂质异构体生物学研究提供了一种高效易用的新工具。
50.3.利用本技术提供的脂质精细结构分析流程，能够获得脂质精细结构的全部数据。脂质精细结构的全部数据包括但不限于脂质亚类、脂肪酸链组成、碳碳双键位置及相对定量信息。
51.4.本技术提供的脂质精细结构分析流程中，支持全流程方法的自动创建和触发运行，同时也支持数据的自动解析。通过自动解析结果、并自动生成仪器流程方法或辅助工作人员设置仪器分析方法，从而能够快速分析复杂样品中的脂质成分，在实现对脂质中碳碳双键位置的精准自动化分析及相对定量的基础上，大大提升工作人员的工作效率。
附图说明
52.图1为磷脂酰乙醇胺(pe)类脂质的一级质谱图。
53.图2为磷脂酰胆碱(pc)类脂质的一级质谱图。
54.图3为控制处理系统的脂质亚类信息结果界面展示图。
55.图4为控制处理系统的脂质脂肪酸链组成结果界面展示图。
56.图5为pe(16:0/18:1)的二级质谱图。
57.图6为控制处理系统的脂质中碳碳双键位置结果界面展示图。
58.图7为pe(16:0/18:1(δ9))的光衍生反应产物二级质谱图。
具体实施方式
59.本技术提供了一种脂质精细结构分析流程和控制处理系统，控制处理系统具备仪器控制功能，且兼具数据转化、数据分析和报告输出的处理功能。
60.该分析流程经控制处理系统执行且具体包括以下步骤：
61.(1)利用液相色谱分离-一级质谱对样品进行检测，获得一级质谱图；
62.解读一级质谱图的数据，获得脂质一级质谱的精确离子质荷比；
63.根据获得的精确离子质荷比，与数据库a比对，结合脂质保留时间信息，确定脂质
亚类信息，并根据脂质亚类信息，确定下一步液相色谱-质谱采集方法。
64.所述样品为包含脂质或脂质类似物的样品。
65.所述样品为中药、生物组织、食品、人体或动物体的离体检测样本、人工合成生物组织中的任意一种。
66.其中，脂质保留时间信息可用于区分有相同或相似精确离子质量但属于不同种类的脂质。
67.其中，脂质保留时间信息可预先校准，使后续分析流程可使用脂质保留时间信息。
68.(2)根据步骤(1)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-二级质谱对样品进行检测，获得二级质谱图；
69.解读二级质谱图的数据，获得脂质二级质谱的精确离子质荷比；
70.根据获得的精确离子质荷比，与数据库b比对，确定脂肪酸链组成，并根据脂肪酸链组成，确定下一步液相色谱-质谱采集方法；
71.(3)根据步骤(2)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-光化学衍生-二级质谱对光化学衍生产物进行检测，获得光化学衍生-二级质谱图；
72.解读光化学衍生-二级质谱图的数据，获得光化学衍生产物的二级质谱的精确离子质荷比；
73.根据获得的精确离子质荷比，与数据库c比对，确定脂质中碳碳双键的位置；
74.并根据不饱和脂质光化学衍生产物的质谱碎片强度比或强度和之比，确定脂质碳碳双键位置异构体的相对定量信息。
75.所述步骤(3)中用到的光化学衍生试剂为含有羰基的双键反应试剂或其对应的衍生物。
76.本技术中，所用的光化学衍生试剂为丙酮。
77.本技术中，步骤(3)中的光化学衍生的波长为190-760nm。
78.其中，流动相溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇、缓冲盐、有机酸、无机酸、有机碱、无机碱中的一种或几种的混合。
79.本技术中，光化学衍生试剂与样品的摩尔比可以是1
×
10-9
～1
×
109。
80.质谱分析中采用的仪器为飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪或三重四级杆质谱仪。
81.本技术中，所述质谱分析中采用碎裂能量为1～200ev，或仪器上所对应的类似能量。
82.本技术中，所述步骤(3)中的光照反应时间为0.1～1200s。
83.其中，所述数据库a、所述数据库b、所述数据库c指向含有所需对应信息的同一数据库或不同数据库。
84.本技术提供的上述脂质精细结构分析流程可以使用自动模式，也可以使用辅助手动模式。
85.当分析流程采用自动模式时，步骤(1)之前还包括以下步骤：指定样品保留时间的自动校正。具体为：采用指定的样品，按照液相色谱-一级质谱方法进行采集；提取指定种类脂质的保留时间，并对保留时间自动校正。
86.本技术首次提出利用光化学反应与质谱联用技术自动解析或辅助手动脂质精细结构的方法，并建立了利用光化学反应与质谱联用技术分析脂质精细结构的分析流程。本
申请提供的分析流程可高效、快速、系统、简易地对复杂脂质体系中的不同脂质组分进行精准分析，包括碳碳双键位置的定位及碳碳双键位置异构体的相对定量，为脂质-生物学研究提供了一种高效易用的新工具。利用本技术提供的脂质精细结构分析流程和控制处理系统，能够获得脂质精细结构的全部数据。脂质精细结构的全部数据包括但不限于脂质亚类、脂肪酸链组成、碳碳双键位置及同分异构体相对定量信息。
87.以下结合附图1-7、实施例1-4、对比例1对本技术作进一步详细说明。
88.实施例
89.实施例1
90.本实施例提供了一种脂质精细结构分析流程。
91.具体地，本实施例采用自动模式，系统由实验人员操作，使用hilic液相色谱分离和飞行时间质谱检测，以市售虫草为检测对象，鉴定市售虫草的脂质精细结构。
92.其中，质谱平台为waters uplc-qtof。
93.色谱系统：acquity uplc i-class(超高液相色谱)；色谱柱：acquity uplc hilic(100
×
2.1mm，1.7μm)，流动相为丙酮/乙腈(5/3，v/v)(a)-乙酸铵水溶液(10mm)(b)，流速：0.4ml/min，梯度洗脱：0min 88％a，0.5min 85％a，2.5min 85％a，4.5min 88％a，6min 88％a；进样体积1μl，柱温：30℃。
94.质谱系统：waters xevo g2-xs qtof(高分辨质谱)；采集模式：灵敏度模式esi+，mse，毛细管电压：2.5kv；锥孔电压：40v；源温度：120℃；雾化气温度：500℃；雾化气流速：800l/h；锥孔气流速：50l/h；采集质量范围：50-1200；lock mass：亮氨酸脑啡肽(le)400ng/ml；扫描时间：0.2s；碰撞能量：low ce 6ev,high ce 10-45ev。
95.该分析流程具体包括以下步骤：
96.一、指定样品保留时间的自动校正
97.以pc(磷脂酰胆碱)、pe(磷脂酰乙醇胺)、pg(磷脂酰甘油)、pi(磷脂酰肌醇)、ps(磷脂酰丝氨酸)、sm(鞘磷脂)类脂质作为指定样品，按照液相色谱-一级质谱方法进行采集；提取上述各种脂质的保留时间，并对保留时间自动校正。
98.获得不同脂质的保留时间，如表1所示。
99.表1不同脂质的保留时间
100.脂质类型保留时间(min)脂质类型保留时间(min)pc3.8-4.2pi1-1.5pe2.3-2.7ps4.5-6.0pg1-1.5sm4.1-4.6
101.二、脂质组分分析
102.在进行脂质分析前，需要进行样品预处理。
103.样品预处理：取市售虫草5g，粉碎后过200目筛，取粉末50mg，加入ch2cl
2-ch3oh(2:1，v/v)(0℃)混合溶剂1ml，涡旋并静置，加入水1ml，离心后移取有机相氮气吹干，加入乙腈-异丙醇(ch3cn-ipa，1:1，v/v)混合溶剂500μl复溶，10000r/min离心10min后取上清，获得样品处理液；
104.(1)利用液相色谱分离-一级质谱对样品处理液进行检测，自动进样并进行一级质谱扫描，获得一级质谱图；
105.解读一级质谱图的数据：通过表1以及图1(pe类脂质的一级质谱图)、图2(pc类脂质的一级质谱图)，获得不同脂质一级质谱的精确离子质荷比。
106.根据获得的精确离子质荷比，与数据库a比对，结合脂质保留时间信息，确定脂质亚类，输出脂质亚类结果，控制处理系统的结果界面如图3所示，全部结果见表2。
107.表2实施例1-虫草中脂质亚类检测结果
108.[0109][0110]
如表2所示，该样品包含30种pc、33种pe、41种pg、17种pi、13种ps、8种sm的脂质亚类信息。根据上述获得的脂质亚类信息，自动获得第二步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数，并生成第二步液相色谱-质谱采集方法。
[0111]
(2)根据步骤(1)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-二级质谱对样品进行检测，自动进样并进行二级质谱扫描，获得二级质谱图。
[0112]
解读二级质谱图的数据，获得脂质二级质谱的精确离子质荷比。
[0113]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库b比对，从二级质谱图中自动得到脂肪酸链组成信息，控制处理系统的结果界面如图4所示，全部结果见表3。
[0114]
表3实施例1-虫草中脂肪酸链组成信息
[0115]
[0116][0117]
以序号为41的pe(34:1)为例，结合图5(pe(16:0_18:1)的二级质谱图)，经软件自动解析，可得到该pe的2条脂肪酸链分别为16:0和18:1。
[0118]
如表3所示，软件自动解析得到共28种pc，35种pe，18种pg，17种pi，8种ps的脂肪酸链组成信息。根据上述获得的脂肪酸链组成信息，自动获得第三步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数，并生成第三步液相色谱-质谱采集方法。
[0119]
(3)软件自动使光衍生设备进入pb反应模式，并根据步骤(2)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-光化学衍生-二级质谱对光衍生反应后脂质产物的光化学衍生产物进行扫描，获得光化学衍生-二级质谱图；
[0120]
解读光化学衍生-二级质谱图的数据：从光化学衍生-二级质谱图中自动获得光化学衍生产物的二级质谱的精确离子质荷比；
[0121]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库c比对，确定脂质中碳碳双键的位置，控制处理系统的结果界面如图6所示，全部结果见表4。
[0122]
表4实施例1-虫草中碳碳双键位置及离子强度信息
[0123][0124][0125]
以序号为10的pe(34:1)为例，经软件自动解析，结合图7(pe(16:0/18:1(δ9)))的光衍生反应产物二级质谱图)，可得到该脂质精细结构为pe(16:0/18:1(δ9))。
[0126]
如表4所示，通过上述分析流程，最终获得虫草脂质提取物中的8种pc、10种pe、4种pg、7种pi和3种ps，结构信息可精确到碳碳双键位置信息。
[0127]
实施例2
[0128]
本实施例提供了一种脂质精细结构分析流程。
[0129]
具体地，本实施例采用辅助手动模式，系统经实验人员操作，使用hilic液相色谱分离和飞行时间质谱检测，以市售牛肝极性脂质提取物为检测对象，鉴定市售牛肝极性脂质提取物的脂质精细结构。
[0130]
其中，质谱平台为ab-4500qtrap液相色谱-质谱串联质谱仪(美国ab sciex公司)。
[0131]
色谱系统：色谱柱：hilic column(150mm
×
2.1mm，silica spheres，2.7μm)(sigma-aldrich)；流动相为丙酮/乙腈(50/50，v/v)(a)-乙酸铵水溶液(10mm)(b)，流速：0.2ml/min，梯度洗脱：0min 90％a，5min 85％a，8min 80％a，8
–
15min 80％a，16min 70％a，20min 70％a；进样体积2μl，柱温：30℃。
[0132]
质谱系统：1.nls和pis：电喷雾离子源(esi)正离子模式；gas1、gas2为30psi，气帘气为40psi，碰撞气：高，电喷雾电压4500v，气化温度400℃，射入电压10v，去簇电压150v，碰撞能40ev；2.lc-msms：电喷雾离子源(esi)负离子模式；gas1、gas2为30psi，气帘气为40psi，碰撞气：高，电喷雾电压4500v，气化温度400℃，碰撞能40ev；3.lc-pb-msms：电喷雾离子源(esi)正离子模式；电喷雾离子源(esi)正离子模式；gas1、gas2为30psi，气帘气为40psi，碰撞气：高，电喷雾电压4500v，气化温度400℃，射入电压10v，去簇电压150v，碰撞能42ev。
[0133]
该分析流程具体包括以下步骤：
[0134]
一、指定样品保留时间的自动校正
[0135]
同实施例1中“一、指定样品保留时间的自动校正”，获得不同脂质的保留时间。
[0136]
二、脂质组分分析
[0137]
在进行脂质分析前，需要进行样品预处理。
[0138]
样品预处理：将市售牛肝极性脂质提取物100mg溶解于1ml甲醇中，制得待测溶液；使用时，对待测溶液进行稀释，获得100mg/l的样品处理液；
[0139]
(1)利用液相色谱分离-一级质谱对样品处理液进行检测，研究人员在液相色谱-质谱仪器上设置液相进样和一级质谱扫描的方法，并触发检测，获得一级质谱图；
[0140]
待完成数据采集时，研究人员将一级质谱的结果数据导入辅助手动分析的软件中，操作软件对比不同脂质的保留时间以及一级质谱的结果，获得脂质一级质谱的精确离子质荷比。
[0141]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库a比对，结合脂质保留时间信息，确定脂质亚类，输出脂质亚类结果，如表5所示。
[0142]
表5实施例2-牛肝极性脂质提取物中脂质亚类检测结果
[0143]
[0144][0145]
如表5所示，该样品包含34种pc、28种pe、22种pg、25种pi、7种ps、19种sm的脂质亚类信息。根据上述获得的脂质亚类信息，自动获得第二步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数。
[0146]
(2)根据步骤(1)确定的液相色谱-质谱采集方法，设置液相色谱-质谱的方法，而后控制液相进样和质谱的二级扫描，触发检测，获得二级质谱图。
[0147]
待完成数据采集时，研究人员将数据导入辅助手动分析的软件中，软件自动解读二级质谱图的数据，获得脂质二级质谱的精确离子质荷比。
[0148]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库b比对，从二级质谱图中自动得到脂肪酸链组成信息。如表6所示。
[0149]
表6实施例2-牛肝极性脂质提取物中脂肪酸链组成信息
[0150]
[0151][0152]
[0153]
如表6所示，软件自动解析得到共43种pc、47种pe、28种pg、34种pi、7种ps、1种sm的脂肪酸链信息。根据上述获得的脂肪酸链组成信息，自动生成第三步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数。
[0154]
(3)研究人员手动使光衍生设备进入pb反应模式，并根据步骤(2)确定的液相色谱-质谱采集方法，设置液相色谱-质谱的方法，控制液相进样和质谱对-光化学衍生样品进行扫描，触发检测，获得光化学衍生-二级质谱图；
[0155]
待完成数据采集时，研究人员将二级质谱的结果数据导入辅助手动分析的软件中，软件从光化学衍生-二级质谱图中自动获得光化学衍生产物的二级质谱的精确离子质荷比；
[0156]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库c比对，确定脂质中碳碳双键的位置，如表7所示。
[0157]
表7实施例2-牛肝极性脂质提取物中碳碳双键位置及离子强度信息
[0158]
[0159][0160]
如表7所示，通过上述分析流程，最终获得牛肝极性脂质提取物中的17种pc、11种pe、1种pi和1种sm，结构信息可精确到碳碳双键位置信息。
[0161]
实施例3
[0162]
本实施例提供了一种脂质精细结构分析流程。
[0163]
具体地，本实施例采用自动模式，系统经实验人员操作，使用hilic液相色谱分离和四极杆飞行时间质谱检测，以糖尿病病人的血清为检测对象，鉴定糖尿病病人的血清的脂质精细结构。
[0164]
其中，质谱平台为waters uplc-qtof。
[0165]
色谱系统：acquity uplc i-class；色谱柱：acquity uplc hilic(100
×
2.1mm，1.7μm)，流动相为丙酮/乙腈(5/3，v/v)(a)-乙酸铵水溶液(10mm)(b)，流速：0.4ml/min，梯度洗脱：0min 88％a，0.5min 85％a，2.5min 85％a，4.5min 88％a，6min 88％a；进样体积1μl，柱温：30℃。
[0166]
质谱系统：waters xevo g2-xs qtof；采集模式：灵敏度模式esi+，mse，毛细管电压：2.5kv；锥孔电压：40v；源温度：120℃；雾化气温度：500℃；雾化气流速：800l/h；锥孔气流速：50l/h；采集质量范围：50-1200；lock mass：亮氨酸脑啡肽(le)400ng/ml；扫描时间：0.2s；碰撞能量：low ce 6ev,high ce 10-45ev。
[0167]
该分析流程具体包括以下步骤：
[0168]
一、指定样品保留时间的自动校正
[0169]
同实施例1中“一、指定样品保留时间的自动校正”，获得不同脂质的保留时间。
[0170]
二、脂质组分分析
[0171]
在进行脂质分析前，需要进行样品预处理。
[0172]
样品预处理：取30μl于4℃下解冻的糖尿病病人的血清，加入ch2cl
2-ch3oh(2：1，v/
v)(含0.1g/l 2,6-二叔丁基-4-甲基酚，0℃)混合溶剂600μl，涡旋并静置，加入水200μl，离心后移取有机相氮气吹干，加入乙腈-异丙醇(ch3cn-ipa，1：1，v/v)混合溶剂500μl复溶，10000r/min离心10min后取上清，获得样品处理液；
[0173]
(1)利用液相色谱分离-一级质谱对样品处理液进行检测，自动进样并进行一级质谱扫描，获得一级质谱图；
[0174]
解读一级质谱图的数据：软件对比不同脂质的保留时间以及一级质谱的结果，获得不同脂质一级质谱的精确离子质荷比。
[0175]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库a比对，结合脂质保留时间信息，确定脂质亚类信息，输出脂质亚类结果，如表8所示。
[0176]
表8实施例3-血清中脂质亚类检测结果
[0177]
[0178][0179]
如表8所示，该样品包含37种pc、13种pe、27种pg、20种pi、16种ps、31种sm的脂质亚类信息。根据上述获得的脂质亚类信息，自动获得第二步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数，并生成第二步液相色谱-质谱采集方法。
[0180]
(2)根据步骤(1)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-二级质谱对样品进行检测，自动进样并进行二级质谱扫描，获得二级质谱图。
[0181]
解读二级质谱图的数据：获得脂质二级质谱的精确离子质荷比。
[0182]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库b比对，得到脂肪酸链组成信息，如表9所示。
[0183]
表9实施例3-血清中脂肪酸链组成信息
[0184]
[0185][0186][0187]
如表9所示，软件自动解析得到共71种pc，15种pe，6种pg，14种pi，1种ps和11种sm的脂肪酸链组成信息。根据上述获得的脂肪酸链组成信息，自动获得第三步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数，并生成第三步液相色谱-质谱采集方法。
[0188]
(3)软件自动使光衍生设备进入pb反应模式，并根据步骤(2)确定的液相色谱-质谱采集方法，利用液相色谱分离-光化学衍生-二级质谱对光衍生反应后脂质产物的光化学
衍生产物进行扫描，获得光化学衍生-二级质谱图；
[0189]
解读光化学衍生-二级质谱图的数据：从光化学衍生-二级质谱图中自动获得光化学衍生产物的二级质谱的精确离子质荷比；
[0190]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库c比对，确定脂质中碳碳双键的位置。并根据脂质碳碳双键位置异构体光化学衍生产物的质谱碎片强度比或强度和之比，确定脂质碳碳双键位置异构体的相对定量信息，如表10所示。
[0191]
表10实施例3-血清中碳碳双键位置及离子强度信息
[0192]
[0193][0194]
如表10所示，通过上述分析流程，最终获得糖尿病病人的血清脂质提取物中的32种pc、6种pe、1种pg、1种pi、1种ps和10种sm，结构信息可精确到碳碳双键位置。如表10所示，在血清样品中检出3组双键位置异构体，以pc(16:0_18:1)为例，pc(16:0_18:1(δ9))与pc(16:0_18:1(δ11))定性离子强度和之比为2.40。
[0195]
实施例4
[0196]
本实施例提供了一种脂质精细结构分析流程和控制处理系统。
[0197]
具体地，本实施例采用辅助手动模式，系统经实验人员操作，使用hilic液相色谱分离和飞行时间质谱检测，以鱼肉脂质提取物为检测对象，鉴定鱼肉脂质提取物的脂质精细结构。
[0198]
其中，质谱平台为ab-4500qtrap液相色谱-质谱串联质谱仪(美国ab sciex公司)。
[0199]
色谱系统：色谱柱：hilic column(150mm
×
2.1mm，silica spheres，2.7μm)(sigma-aldrich)；流动相为丙酮/乙腈(50/50,v/v)(a)-乙酸铵水溶液(10mm)(b)，流速：0.2ml/min，梯度洗脱：0min 90％a，5min 85％a，8min 80％a，8
–
15min 80％a，16min 70％a，20min 70％a；进样体积2μl，柱温：30℃。
[0200]
质谱系统：1.nls和pis：电喷雾离子源(esi)正离子模式；gas1、gas2为30psi，气帘气为40psi，碰撞气：高，电喷雾电压4500v，气化温度400℃，射入电压10v，去簇电压150v，碰撞能40ev；2.lc-msms：电喷雾离子源(esi)负离子模式；gas1、gas2为30psi，气帘气为40psi，碰撞气：高，电喷雾电压4500v，气化温度400℃，碰撞能40ev；3.lc-pb-msms：电喷雾离子源(esi)正离子模式；电喷雾离子源(esi)正离子模式；gas1、gas2为30psi，气帘气为40psi，碰撞气：高，电喷雾电压4500v，气化温度400℃，射入电压10v，去簇电压150v，碰撞能42ev。
[0201]
该分析流程具体包括以下步骤：
[0202]
一、指定样品保留时间的自动校正
[0203]
同实施例1中“一、指定样品保留时间的自动校正”，获得不同脂质的保留时间。
[0204]
二、脂质组分分析
[0205]
在进行脂质分析前，需要进行样品预处理。
[0206]
样品处理方法为：将草鱼鱼肉剁碎得到鱼肉样品，取1g鱼肉样品，加入到10ml乙醇中，在匀浆机中破碎后得到鱼肉浆液，离心后移取1ml有机相氮气吹干，加入丙酮500μl复溶，离心，移取有机相氮气吹干，即得鱼类提取物样品；将鱼类提取物样品100mg溶解于1ml甲醇中，获得样品处理液；使用时，对样品处理液进行稀释，获得100mg/l的溶液，进行检测；
[0207]
(1)利用液相色谱分离-一级质谱对样品处理液进行检测，研究人员在液相色谱-质谱仪器上设置液相进样和一级质谱扫描的方法，并触发检测，获得一级质谱图；
[0208]
待完成数据采集时，研究人员将一级质谱的结果数据导入辅助手动分析的软件中，操作软件对比不同脂质的保留时间以及一级质谱的结果，获得脂质一级质谱的精确离子质荷比。
[0209]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库a比对，结合脂质保留时间信息，确定脂质亚类，输出脂质亚类结果，如表11所示。
[0210]
表11实施例4-鱼肉脂质提取物中脂质亚类检测结果
[0211][0212]
如表11所示，该样品包含13种pc、7种pe、13种pg、12种pi、3种ps、11种sm的脂质亚类信息。根据上述获得的脂质亚类信息，自动生成第二步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数。
[0213]
(2)根据步骤(1)确定的液相色谱-质谱采集方法，设置液相色谱-质谱的方法，而后控制液相进样和质谱的二级扫描，触发检测，获得二级质谱图。
[0214]
待完成数据采集时，研究人员将数据导入辅助手动分析的软件中，软件自动解读二级质谱图的数据，获得脂质二级质谱的精确离子质荷比。
[0215]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库b比对，从二级质谱图中自动得到脂肪酸链组成信息。如表12所示。
[0216]
表12实施例4-鱼肉脂质提取物中脂肪酸链组成信息
[0217]
[0218][0219]
如表12所示，软件解析得到共21种pc、16种pe、19种pg、14种pi、4种ps脂质的脂肪酸链信息。根据上述获得的脂肪酸链组成信息，自动生成第三步液相色谱-质谱仪器所需的主要参数。
[0220]
(3)研究人员手动使光衍生设备进入pb反应模式，并根据步骤(2)确定的液相色谱-质谱采集方法，设置液相色谱-质谱的方法，控制液相进样和质谱对光化学衍生产物进行扫描，触发检测，获得光化学衍生-二级质谱图；
[0221]
待完成数据采集时，研究人员将二级质谱的结果数据导入辅助手动分析的软件中，软件从光化学衍生-二级质谱图中自动获得光化学衍生产物的二级质谱的精确离子质荷比；
[0222]
根据获得的精确离子质荷比，与数据库c比对，确定脂质中碳碳双键的位置，如表13所示。
[0223]
表13实施例4-鱼肉脂质提取物中碳碳双键位置及离子强度信息
[0224]
[0225][0226]
如表13所示，通过上述分析流程，最终获得鱼肉极性脂质提取物中的10种pc、8种pe和1种pi，结构信息可精确到碳碳双键位置信息。
[0227]
对比例1
[0228]
本对比例提供了一种脂质精细结构分析流程。
[0229]
本对比例与实施例1的区别在于“二、脂质组分分析”步骤中没有“步骤(3)：利用液相色谱分离-光化学衍生-二级质谱对光化学衍生产物进行检测”。具体如下：
[0230]
(1)利用液相色谱分离-一级质谱对样品处理液进行检测，检测获得该样品包含30种pc、33种pe、41种pg、17种pi、13种ps、8种sm的脂质亚类信息。
[0231]
(2)利用液相色谱分离-二级质谱对样品进行检测，软件自动解析得到共28种pc，35种pe，18种pg，17种pi，8种ps的脂肪酸链结构信息。
[0232]
通过实施例1和对比例1的检测结果的对比，可知对比例1提供的分析流程只能得到样品的脂质亚类信息和脂肪酸链信息，而无法精确到碳碳双键位置的信息。而本技术提供的脂质精细结构分析流程，能够获得脂质精细结构的全部数据。脂质精细结构的全部数据包括但不限于脂质亚类、脂肪酸链组成、碳碳双键位置及相对定量信息，尤其是能够精确到碳碳双键的位置信息。本技术提供的分析流程可高效、快速地对复杂脂质体系中的不同脂质组分进行精准分析，包括碳碳双键位置的定位，从而实现对碳碳双键位置异构体的相对定量，为脂质异构体生物学研究提供了一种高效易用的新工具。
[0233]
另外，本技术提供的脂质精细结构分析流程中，支持全流程方法的自动创建和触发运行，同时也支持数据的自动解析。通过自动解析结果、并自动生成仪器流程方法或辅助工作人员设置分析方法，从而能够快速分析复杂样品中的脂质成分，在实现对脂质中碳碳双键位置的精准自动化分析及相对定量的基础上，大大提升了工作人员的工作效率。而相关技术中，对于可精确到碳碳双键的方法中，所有谱图都需要人工解析，对于熟练解析谱图的人而言，解析一张质谱图需要花费3-5min，而在大量脂质分析中，有许多质谱图需要分析，通常情况下，每个样品分析需要至少1-2天。再考虑到每一步实验方法的建立需要手动分析数据后进行，更是降低了样品的分析速度。因此，利用本技术供的脂质精细结构分析流程，能将分析时间缩短到数秒到数分钟，若是以自动模式，更是省去了手动解析和方法建立
的繁琐，极大地缩短了分析脂质精细结构所要花费的时间。
[0234]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。