一种依诺肝素钠注射液中苯甲醛的检测方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种依诺肝素钠注射液中苯甲醛的检测方法。


背景技术：

2.依诺肝素钠注射液的主要成份为依诺肝素钠，系低分子肝素钠的一种。本品系由猪小肠黏膜提取的肝素经苄基酯化后，碱降解获取的硫酸氨基葡聚糖片断的钠盐。依诺肝素钠注射液为依诺肝素钠与注射用水制成的非最终灭菌注射液。规格为0.4ml：4000a
ⅹ
aiu，其包装容器采用预灌封注射器，包装材料采用铝塑泡罩包装。临床适应症为预防静脉血栓栓塞性疾病(预防静脉内血栓形成)，特别是与骨科或普外手术有关的血栓形成。用法用量为深部皮下注射，本品为成人用药，禁止肌内注射，每毫升注射液含10000axaiu，相当于100mg依诺肝素。每毫克(0.01ml)依诺肝素约等于100axaiu。
3.依诺肝素钠结构式如下所示：
[0004][0005]
在依诺肝素钠粗品脱苄基保护的过程中，会生成一定量的苯甲醇，在精制过程中，使用双氧水进行脱色，粗品中的苯甲醇会被双氧水氧化为苯甲醛。因此需要对产品中的苯甲醛进行检测，以监测依诺肝素钠产品中苯甲醛的含量，精确控制产品质量。但是依诺肝素钠注射液中苯甲醛的检测方法却鲜有报道。因此很有必要提供一种依诺肝素钠注射液中苯甲醛的检测方法，以保证产品质量，确保用药安全。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术尚未有成熟的应用于依诺肝素钠中检测苯甲醛的方法的问题，本发明提供了一种依诺肝素钠注射液中苯甲醛的检测方法。该方法可以快速准确的检测苯甲醛
的含量，且具有较好的适用性。
[0007]
本发明的具体发明内容如下：
[0008]
一种依诺肝素钠注射液中苯甲醛的检测方法，所述方法使用高效液相色谱法进行分析检测；具体方案包括：
[0009]
高效液相色谱法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以磷酸水溶液-甲醇为流动相进行分离；以紫外检测器检测。
[0010]
优选地，所述方法中，色谱柱选自ymc triart c18、agilent zorbax sb-c18、agilent eclipse xdb-c18或ultimate xb-c18。
[0011]
优选地，所述方法中，检测波长250nm。
[0012]
优选地，所述色谱柱规格为4.6mm
×
250mm，3μm。
[0013]
优选地，所述方法中，待测样品的进样体积为5μl～20μl；优选为10μl。
[0014]
优选地，所述方法中，流动相流速为0.8～1.2ml/min；优选为0.9～1.1ml/min；进一步优选为1ml/min。
[0015]
优选地，所述方法中，柱温为25～35℃；优选为30℃。
[0016]
优选地，所述方法中，磷酸水溶液-甲醇体积比为(60～70)：(40～30)；优选为(63～67)：(37～33)；进一步优选为65:35。
[0017]
更加优选地，所述方法中，磷酸水溶液浓度为0.05％～0.5％；优选为0.1％。
[0018]
更加优选地，所述方法中，流动相洗脱的方式为等度洗脱。
[0019]
在一个优选的试验方案中，该检测方法包括如下步骤：
[0020]
(1)对照品溶液配制
[0021]
精密称取苯甲醛适量，置100ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照储备液。精密量取储备液适量置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得每1ml中含苯甲醛10ug的对照溶液。
[0022]
(2)供试品溶液的配制
[0023]
精密量取依诺肝素钠注射液0.5ml，置5ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
[0024]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0025]
精密量取依诺肝素钠注射液1ml，置10ml量瓶中，加苯甲醛储备液0.5ml，用水定容至刻度，摇匀，得供试品溶液和对照品溶液的混合溶液。
[0026]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相为0.1％磷酸水溶液-甲醇(63:37～67:33)；进样量为5μl～20μl；检测波长，250nm；柱温，25～35℃；流速，0.9～1.1ml/min。
[0027]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛。
[0028]
本发明的检测方法，能够快速有效检测依诺肝素钠注射液中苯甲醛的含量，线性关系良好，精密度高，准确度良好，重复性和耐用性好，整个操作非常简单，快捷检测得到的苯甲醛含量非常精确，提供了依诺肝素钠注射液中苯甲醛含量测定方法。
附图说明
[0029]
图1.实施例1对照品溶液hplc色谱图。
[0030]
图2.实施例1供试品溶液hplc色谱图。
[0031]
图3.实施例1供试品+对照品溶液hplc色谱图。
[0032]
图4.实施例8供试品溶液hplc色谱图。
具体实施方式
[0033]
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述，应当理解的是以下实施例仅用于例证的目的，并不用来限制本发明，一些本领域中显而易见的替换也在本发明保护范围之内。
[0034]
本发明不限制依诺肝素钠注射液的来源，可以市售所得也可以是自行制备所得。以下实施例所用的依诺肝素钠注射液是由山东新时代药业提供，含有苯甲醛。其他原料如无特殊说明均可通过商业途径获得。
[0035]
实施例1
[0036]
(1)对照品溶液配制
[0037]
精密称取苯甲醛适量，置100ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照储备液。精密量取储备液适量置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得每1ml中含苯甲醛10μg的对照溶液。
[0038]
(2)供试品溶液的配制
[0039]
精密量取依诺肝素钠注射液0.5ml，置5ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
[0040]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0041]
精密量取依诺肝素钠注射液1ml，置10ml量瓶中，加苯甲醛储备液0.5ml，用水定容至刻度，摇匀，得供试品溶液和对照品溶液的混合溶液。
[0042]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇65：35；进样量为10μl；检测波长，250nm；柱温，30℃；流速，1.0ml/min。
[0043]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛含量为1.86μg/ml。对照品、供试品和供试品+对照品混合溶液的hplc谱图分别如图1、图2和图3所示。
[0044]
实施例2
[0045]
(1)对照品溶液配制
[0046]
同实施例1中的方法。
[0047]
(2)供试品溶液的配制
[0048]
同实施例1中的方法。
[0049]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0050]
同实施例1中的方法。
[0051]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇
(63:37)；进样量为10μl；检测波长，250nm；柱温，30℃；流速，1.0ml/min。
[0052]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.77μg/ml。
[0053]
实施例3
[0054]
(1)对照品溶液配制
[0055]
同实施例1中的方法。
[0056]
(2)供试品溶液的配制
[0057]
同实施例1中的方法。
[0058]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0059]
同实施例1中的方法。
[0060]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇(67:33)；进样量为10μl；检测波长，250nm；柱温，30℃；流速，1.0ml/min。
[0061]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.78μg/ml。
[0062]
实施例4
[0063]
(1)对照品溶液配制
[0064]
同实施例1中的方法。
[0065]
(2)供试品溶液的配制
[0066]
同实施例1中的方法。
[0067]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0068]
同实施例1中的方法。
[0069]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇(65:35)；进样量为10μl；检测波长，250nm；柱温，35℃；流速，1.0ml/min。
[0070]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.81μg/ml。
[0071]
实施例5
[0072]
(1)对照品溶液配制
[0073]
同实施例1中的方法。
[0074]
(2)供试品溶液的配制
[0075]
同实施例1中的方法。
[0076]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0077]
同实施例1中的方法。
[0078]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇(65:35)；进样量为10μl；检测波长，250nm；柱温，30℃；流速，0.9ml/min。
[0079]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.87μg/ml。
[0080]
实施例6
[0081]
(1)对照品溶液配制
[0082]
同实施例1中的方法。
[0083]
(2)供试品溶液的配制
[0084]
同实施例1中的方法。
[0085]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0086]
同实施例1中的方法。
[0087]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇(65:35)；进样量为10μl；检测波长，250nm；柱温，30℃；流速，1.1ml/min。
[0088]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.74μg/ml。
[0089]
实施例7
[0090]
(1)对照品溶液配制
[0091]
同实施例1中的方法。
[0092]
(2)供试品溶液的配制
[0093]
同实施例1中的方法。
[0094]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0095]
同实施例1中的方法。
[0096]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇(65:35)；进样量为10μl，检测波长，250nm；柱温，25℃；流速，1.0ml/min。
[0097]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.74μg/ml。
[0098]
实施例8
[0099]
(1)对照品溶液配制
[0100]
同实施例1中的方法。
[0101]
(2)供试品溶液的配制
[0102]
同实施例1中的方法。
[0103]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0104]
同实施例1中的方法。
[0105]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇(60:40)；进样量为5μl；检测波长，250nm；柱温，20℃；流速，1.0ml/min。
[0106]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.66μg/ml，其峰型不好，不能完全有效分离，检测结果如图4所示。
[0107]
实施例9
[0108]
(1)对照品溶液配制
[0109]
同实施例1中的方法。
[0110]
(2)供试品溶液的配制
[0111]
同实施例1中的方法。
[0112]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0113]
同实施例1中的方法。
[0114]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.1％磷酸水溶液-甲醇(70:30)；进样量为20μl；检测波长，250nm；柱温，30℃；流速，1.0ml/min。
[0115]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.63μg/ml，其峰型不好，分离度差，检测结果与图4相似。
[0116]
实施例10
[0117]
(1)对照品溶液配制
[0118]
同实施例1中的方法。
[0119]
(2)供试品溶液的配制
[0120]
同实施例1中的方法。
[0121]
(3)供试品+对照品混合溶液的配制
[0122]
同实施例1中的方法。
[0123]
(4)采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱ymc triart c18，4.6mm
×
250mm，3μm，以十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相，0.5％磷酸水溶液-甲醇(65:35)；进样量为10μl；检测波长，250nm；柱温，30℃；流速，1.0ml/min。
[0124]
(5)记录色谱图，由对照品溶液中苯甲醛保留时间定性，按外标法以峰面积计算供试品中的苯甲醛为1.62μg/ml，其峰型不好，分离度很差，检测结果与图4相似。
[0125]
验证实施例
[0126]
1、系统适用性试验
[0127]
取专属性项下混合溶液作为系统适用性溶液。精密量取10μl，注入液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件连续测定6次，记录色谱图，结果见表1。
[0128]
表1.系统适用性试验结果
[0129]
序号保留时间(min)峰面积与后杂分离度系统适用性-116.0476624795.09系统适用性-216.0516586595.14系统适用性-316.0536544625.07系统适用性-416.0546509905.17系统适用性-516.0526495635.40系统适用性-616.0546459794.99平均值
±
sd16.052
±
0.003653689
±
6104—rsd％0.020.93—
[0130]
结论：苯甲醛的保留时间均值为16.052min，峰面积均值为653689，rsd％分别为0.02、0.93，苯甲醛与后杂分离度在5.0左右，均符合要求。
[0131]
2、线性与检测范围测定
[0132]
精密称取苯甲醛40.71mg置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为苯甲
醛储备液；取储备液250μl置10ml量瓶中，用水定容混匀后取100μl置100ml量瓶中，用水定容混匀得定量限溶液，另分别量取该储备液25μl、50μl、125μl置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成每lml分别含有0.010μg、1.013μg、2.025μg、5.063μg苯甲醛的线性溶液。再称取苯甲醛20.27mg置100ml量瓶中，用水定容混匀，作为储备液，分别取该储备液0.4ml、0.5ml、0.6ml置10ml量瓶中，用水定容混匀，制成每lml分别含有8.067μg、10.084μg、12.101μg苯甲醛的线性溶液。精密量取上述7个线性溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件检测，记录色谱图，结果见表2。
[0133]
表2.线性与范围试验结果
[0134][0135][0136]
结果表明，苯甲醛浓度在0.010μg/ml～12.101μg/ml范围内线性关系良好。
[0137]
3、重复性试验
[0138]
称取苯甲醛21.24mg、21.79mg各置100ml量瓶中，加水溶解并定容，取该溶液500μl置10ml量瓶中，用水定容，摇匀，作为对照溶液。取依诺肝素钠注射液1ml置10ml量瓶中，用水定容，摇匀，作为重复性供试品溶液，同法平行配制6份，按照实施例1的色谱条件依法测定，记录色谱图，计算苯甲醛含量平均值及相对标准偏差，结果见表3。
[0139]
表3.重复性试验结果
[0140]
[0141]
结果表明，本法对依诺肝素钠注射液苯甲醛测定的重复性良好。
[0142]
4、准确度试验
[0143]
称取苯甲醛20.70mg、20.71mg各置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀后取该溶液0.5ml置10ml量瓶中，用水定容混匀，作为对照品溶液。
[0144]
称取苯甲醛22.95mg置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀后取该溶液0.35ml置10ml量瓶中，再加入依诺肝素钠注射液1ml，用水定容混匀，作为80％加样回收率溶液。同法配制3份，临用新配。
[0145]
称取苯甲醛20.90mg置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀后取该溶液0.5ml置10ml量瓶中，再加入依诺肝素钠注射液1ml，用水定容混匀，作为100％加样回收率溶液。同法配制3份，临用新配。
[0146]
称取苯甲醛21.97mg置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀后取该溶液0.55ml置10ml量瓶中，再加入依诺肝素钠注射液1ml，用水定容混匀，作为120％加样回收率溶液。同法配制3份，临用新配。
[0147]
取上述溶液，按照实施例1的色谱条件依法测定，记录色谱图，用外标法以峰面积计算回收率，并计算相对标准偏差，结果见表4。
[0148]
表4.回收率试验结果
[0149][0150]
结果表明，本法测定苯甲醛，回收率范围为98.25％～100.29％，平均回收率为99.05％，rsd为1.30％，准确度良好。
[0151]
5、检测限与定量限
[0152]
检测限溶液：称取苯甲醛20.42mg置100ml量瓶中，用水溶解定容，摇匀；取该溶液0.5ml置10ml量瓶中，用水定容，摇匀；再取该溶液100μl置100ml量瓶中，用水定容，摇匀；最后取该溶液3ml置10ml量瓶中，用水定容，摇匀。精密量取10μl，注入液相色谱仪，s/n≈4.2，此时苯甲醛的浓度为3.05ng/ml，检测限为0.0305ng。
[0153]
定量限溶液：称取苯甲醛20.36mg置100ml量瓶中，用水溶解定容，摇匀，作为苯甲醛储备液；取该溶液0.5ml置10ml量瓶中，用水定容，摇匀；再取该溶液100μl置100ml量瓶中，用水定容，摇匀；精密量取10μl，注入液相色谱仪，s/n≈14.6，此时苯甲醛的浓度为10.13ng/ml，定量限为0.1013ng。