基于MnCo@CNCs类酶活性快速比色分析总抗氧化能力的方法及其应用

基于mnco@c ncs类酶活性快速比色分析总抗氧化能力的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于比色传感技术领域，涉及一种总抗氧化能力的比色分析方法，具体涉及基于mnco@c ncs类酶活性快速比色分析总抗氧化能力的方法及其在食品安全检测中应用。


背景技术：

2.超氧自由基阴离子、过氧化氢、羟基自由基、半醌自由基、单线态氧等细胞内活性氧(reactive oxygen species；ros)的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联，研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害。总抗氧化能力(tac)用来描述不同食物中抗氧化剂清除血液和细胞中有害自由基的能力，而抗氧化剂通常存在于水果、蔬菜、草药和茶，因此测定食品中的总抗氧化能力具有非常重要的意义。目前测定tac的方法包括：ferric reducing ability of plasma(frap)法、cupric reducing antioxidant capacity(cuprac)法等等，这些方法中存在检测试剂多、操作繁琐、检测成本较高或检测时间长等问题。因此，迫切需要开发一种低成本、简单、快速、高灵敏度的方法来定量分析食品tac。
3.基于类酶活性纳米材料的比色分析由于其简单、成本效益、可视化以及可现场应用等优点引起了人们广泛的关注。具有模拟酶特性的纳米材料，成本低、制备简便、稳定性高。尤其是具有类氧化物酶活性的复合纳米材料，包括贵金属、金属氧化物、碳材料等，可以在空气条件下催化一些显色底物氧化而显色，如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)等。但是，获得高催化活性的类酶活性纳米材料仍然是一个挑战，这极大限制了它们的广泛应用。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种低成本、操作简便、肉眼可见、高灵敏度的基于mnco@c ncs类酶活性快速比色分析总抗氧化能力的方法，该方法具有所需试剂量低、响应快速、抗干扰能力强等优点，并可应用于食品总抗氧化能力的测定。
5.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。
6.一种基于mnco@c ncs类酶活性快速比色分析总抗氧化能力的方法，，所述mnco@c ncs为核壳结构，所述内核为mnco双金属氧化物，所述外壳为多孔碳壳c ncs，所述方法包括以下步骤：
7.(1)mnco@c ncs复合纳米材料的制备：
8.(1.1)将乙酸锰、pvp分散在乙醇和水混合溶液中并搅拌，随后，加入钴氰化钾水溶液，室温孵育，得到mnco前驱体；
9.(1.2)将mnco前驱体重新分散到水溶液中，然后加入多巴胺水溶液，室温反应，得到聚多巴胺(pda)涂覆的mnco前驱体；
10.(1.3)将上述所得pda涂覆的mnco前驱体进行高温热解，得到核壳结构的mnco双金属氧化物多孔碳复合纳米材料，即mnco@c ncs；
11.(2)测试mnco@c ncs复合纳米材料类氧化物酶活性：将上述所得mnco@c ncs复合纳米材料加入含tmb的醋酸钠-醋酸缓冲液中孵育，然后记录反应后的溶液在652nm波长处的吸光度值a，验证mnco@c ncs是否具备类氧化物酶活性；
12.(3)将上述测试具有类氧化物酶活性的mnco@c ncs复合纳米材料分别加入到多个含有不同浓度抗坏血酸(aa)的醋酸钠-醋酸缓冲液样品中，然后加入显色底物tmb进行反应，得到混合体系，记录反应后空白与加标样品在652nm波长处的吸光度值a0和a，得到aa浓度与吸光度差值δa(a
0-a)的检测线性关系；
13.(4)根据上述所得aa浓度与吸光度值δa的检测线性关系，以及含抗氧化性的待测样品的吸光度值，得到待测样品中aa的浓度。以aa作为抗氧化模式化合物，并用mm/l aa为单位表征总抗氧化能力(tac)，分析待测样品的tac。
14.优选的，步骤(2)中，当mnco@c ncs复合纳米材料加入到含有显色底物tmb的醋酸钠-醋酸缓冲液样品中进行反应，得到混合体系时，混合体系呈深蓝色，由此验证mnco@c ncs复合纳米材料是否具有类氧化物酶活性。
15.优选的，步骤(3)中，当mnco@c ncs复合纳米材料加入到不含aa的醋酸钠-醋酸缓冲液(空白样品)中进行孵育，然后加入显色底tmb进行反应，得到混合体系时，混合体系呈深蓝色。当加入含aa的待测样品(加标样品)时，混合体系蓝色变浅，由此定性检测待测样品中是否含有aa。
16.优选的，所述aa浓度与吸光度差值δa的检测线性回归方程为：
17.δa＝0.034c
aa
+0.0094
ꢀꢀꢀ
(1)
18.式(1)中，δa表示吸光度差值，c
aa
为待测溶液中aa的浓度值，该浓度值对应的单位为μm，式(1)的相关系数r2＝0.997，aa的检测线性范围为0～25μm，检测限为0.29μm。
19.优选的，步骤(1.1)中，所述乙酸锰与pvp的质量比为1∶5～10，mn与co的摩尔比为1：1～3。
20.优选的，步骤(1.2)中，所述多巴胺与mnco前驱体的质量比为1∶1～3。
21.优选的，步骤(2)中，所述孵育是在室温下孵育3min～10min。步骤(2)和步骤(3)中，所述醋酸钠-醋酸缓冲液的浓度为0.1m～0.2m。
22.作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的mnco@c ncs类酶活性快速比色分析总抗氧化能力的方法在检测食品总抗氧化能力中的应用。
23.需要说明的是，本发明中，单位m指mol/l。
24.本发明中，乙酸锰、pvp、钴氰化钾在水中的浓度不做限定，溶解于水中即可。
25.本发明中，醋酸钠-醋酸缓冲液主要由醋酸钠与醋酸按照一定比例配制而成，优选醋酸钠与醋酸的摩尔浓度比为1∶5～6，但不限于此，该醋酸钠-醋酸缓冲液也可商购。
26.本发明的检测原理主要在于：本发明制备的mnco@c ncs复合纳米材料表现出优异的类氧化物酶活性，能够在空气条件下催化tmb氧化显色为蓝色。在抗氧化剂(如抗坏血酸aa)存在时，由于aa具有强还原性，能够与tmb竞争消耗反应过程中产生的自由基，同时还原已经氧化的tmb，导致蓝色变浅，且随着aa浓度增加而趋向无色，并体现在吸光度值的降低。基于aa抑制mnco@c ncs复合纳米材料催化tmb氧化策略，实现aa的检测。另外，以aa作为抗
氧化模式化合物，用mm/l aa为单位来表征总抗氧化能力(tac)，从而达到比色分析食品tac目的。
27.与现有技术相比，本发明的优点在于：
28.本发明提供了一种基于复合纳米材料用于总抗氧化能力的快速比色分析方法，mnco@cncs复合纳米材料特殊的核壳(蛋黄-蛋壳)多孔结构，以双金属mnco氧化为核，外层包覆多孔碳为壳，为mnco@c ncs提供了更大的比表面积和催化活性位点。该材料制备方法具有制备工艺简单、成本低、稳定性高、环境友好等优点，适合于大规模制备。同时，mn和co协同作用和可逆的多价态赋予了其具有高的类氧化物酶活性，即在空气条件下，无需添加其他试剂就能将tmb显色试剂催化氧化生成蓝色产物，提高了检测灵敏度。另外，加入mnco@c ncs复合纳米材料催化剂含量极低，仅在μg/ml级别就可以高效催化，大大降低检测成本。同时，响应迅速，该比色分析方法在3min之内就能观察到肉眼可见的颜色变化，极大缩短检测时间。
29.本发明的比色传感策略基于aa抑制mnco@c ncs类氧化物酶活性催化tmb氧化显色，具有操作简便、低成本、可视化和现场应用等优点，通过在比色传感体系中加入不同浓度的aa，建立aa浓度与吸光度差值的检测线性关系，aa的检测线性范围为0～25μm，检测限为0.29μm，根据该检测线性回归方程计算待测样品中aa的浓度，可实现对总抗氧化能力的快速分析，有着很好的使用价值和市场前景。
附图说明
30.图1为本发明实施例1中制备的mnco@c ncs复合纳米材料的透射电镜图。
31.图2为本发明实施例1制备的mnco@c ncs以及mnco前驱体的uv-vis图。
32.其中，a为tmb溶液的uv-vis吸收曲线(tmb)，b为mnco前驱体加入到tmb溶液的uv-vis吸收曲线(tmb-mnco前驱体)，c为加入到tmb溶液的uv-vis吸收曲线(tmb-)，d为mnco@c ncs加入到tmb溶液的uv-vis吸收曲线(tmb-mnco@c ncs)，e为tmb-mnco@c ncs体系中利用n2处理。
33.图3为本发明实施例1中不同浓度aa与吸光度值变化的检测线性回归图。
34.图4为本发明实施例1中验证该比色分析方法的可靠性。
35.图5为采用实施例1中的基于复合纳米材料用于总抗氧化能力的快速比色分析方法在测定实际样品tac的应用，其中，a为新鲜草莓汁，b为新鲜橙汁，c为新鲜柠檬汁，d为新鲜番茄汁，e-g为三种商业饮料。
36.图6为评估实施例1中基于复合纳米材料用于总抗氧化能力的快速比色分析方法的抗干扰性。其中，blank为空白样品，其他组分别为添加葡萄糖、果糖、k
+
、na
+
、ca
2+
、mg
2+
、谷氨酸、酒石酸、赖氨酸、组氨酸、柠檬酸、半胱氨酸和aa。
37.图7为本发明实施例1制备的mnco@c ncs复合纳米材料的10次重复性评估图。
具体实施方式
38.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售。
39.实施例1
40.基于mnco@c ncs类酶活性快速比色分析总抗氧化能力的方法，包括以下步骤：
41.(1)mnco@c ncs复合纳米材料的制备：
42.(1.1)将乙酸锰、pvp(k-30)分散在乙醇和水混合溶液中并搅拌，随后，加入钴氰化钾水溶液，乙酸锰与pvp的质量比为1∶5，mn与co的摩尔比为1：1，在室温下孵育，得到mnco前驱体；
43.(1.2)将制备的mnco前驱体重新分散到水溶液中，随后加入多巴胺水溶液，多巴胺与mnco前驱体的质量比为1∶1，得到；
44.(1.3)将步骤(1.2)得到的在高温热解中，得到mnco@c ncs。
45.如图1所示，对mnco@c ncs进行电镜成像分析，其结果表明，mnco@c ncs呈现核壳结构，直径250nm左右，且可以看到表面有许多孔，这些孔将增大其比表面积，提供更多的活性位点。由此说明，独特核壳结构的mnco@c ncs制备成功。
46.(2)测试mnco@c ncs复合纳米材料类氧化物酶活性，将mnco@c ncs加入含tmb的0.2m醋酸钠-醋酸缓冲液中孵育3min。
47.如图2所示，发现mnco@c ncs参与反应溶液在652nm有明显的吸收峰，该吸收峰为tmb氧化产物的特征吸收峰，而对比mnco前驱体和，则没有表现出吸收峰，说明热解之后，mnco@c ncs具备高催化活性。此外，在tmb-mnco@c ncs体系中通n2，吸光度值明显下降，说明mnco@c ncs具备类氧化物酶活性。
48.(3)将mnco@c ncs复合纳米材料分别加入到空白以及多个含有不同浓度aa的0.2m醋酸钠-醋酸缓冲液中，aa的浓度分别为1μm、2μm、5μm、8μm、10μm、15μm、20μm和25μm，然后加入显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应3min，得到混合体系。记录反应后空白样品及加标样品在652nm波长处的吸光度值a0和a，得到aa浓度与吸光度差值δa(a
0-a)的检测线性关系。
49.图3为本实施例中不同浓度aa与吸光度差值δa的检测线性回归图。由图3可知，吸光度差值δa随着aa浓度的增加而增加，且吸光度差值δa与aa浓度呈现良好的线性关系。检测线性回归方程为：
50.δa＝0.034c
aa
+0.0094(1)
51.式(1)中，δa表示吸光度差值，c
aa
为待测溶液中aa的浓度值，该浓度值对应的单位为μm，式(1)的相关系数r2＝0.997，aa的检测线性范围为0～25μm，检测限为0.29μm。
52.(4)根据上述所得aa浓度与吸光度值δa的检测线性关系，以及含抗氧化性的待测样品的吸光度值，得到待测样品中aa的浓度。以aa作为抗氧化模式化合物，并用mm/l aa为单位表征总抗氧化能力(tac)，分析待测样品的tac。
53.本实施例中，吸光度的测定方法为：将样品放置于紫外可见分光光度计中，测定652nm处的吸光度值。
54.本实施例中，在进行步骤(3)时，当mnco@c ncs复合纳米材料加入到不含aa的醋酸钠-醋酸缓冲液(空白样品)中进行孵育，然后加入显色底物tmb进行反应，得到混合体系时，混合体系呈深蓝色。当加入含aa的待测样品(加标样品)时，混合体系蓝色变浅，由此定性检测待测样品中是否含有aa，且由混合体系蓝色变浅的程度可定性判断aa浓度变化趋势，进而可以评估样品的tac。
55.实施例2
56.其中，步骤(1)中，乙酸锰与pvp的质量比为1∶10，mn与co的摩尔比为1：3，在室温下孵育，得到mnco前驱体；多巴胺与mnco前驱体的质量比为1∶3。
57.其余同实施例1。
58.需要说明的是，实施例2所制得的mnco@c ncs的性质与实施例1所制备的mnco@cncs的性质相同，同样具有较好的类氧化酶活性。
59.由此可见，本发明的基于mnco@c ncs复合纳米材料的类氧化酶活性用于总抗氧化能力的快速比色分析方法可以用来定性和定量检测aa浓度，并可根据线性回归方程分析食品的tac。
60.实际样品分析
61.评估实施例1的基于复合纳米材料用于总抗氧化能力的快速比色分析方法在实际样品检测的可靠性，选用市场售卖的已知规格的维生素c片，利用该比色检测方法检测维生素c片中的aa浓度，并进一步分析水果蔬菜以及商业饮料中tac。
62.(1)采用实施例1的比色检测方法分别检测3种不同厂家生产的维生素c片中aa含量，其中，三种维生素c片规格均为100mg/片。具体步骤为：将3中不同维生素c片经研磨成粉并分散到水溶液中，残渣过滤，取上清液利用0.2m醋酸钠-醋酸缓冲溶液稀释到aa线性检测范围内浓度，采用实施例1的比色检测方法测定3种维生素c片中的aa浓度。测定结果如图4所示，发现利用该比色方法检测到3种维生素c片中的aa浓度与规格含量接近一致，证明了此比色分析方法的可靠性。同时，利用该比色分析方法进一步评估了水果(草莓、橙子、柠檬)、蔬菜(番茄)以及3种商业饮料的tac，如图5所示，发现，新鲜草莓汁的tac最高，为4.08mm aa，所有水果蔬菜中tac均高于商业饮料，证明了该比色分析方法的实际应用能力。
63.抗干扰能力考察
64.评估实施例1的基于复合纳米材料用于总抗氧化能力的快速比色分析方法的抗干扰能力，用实施例1中的比色检测方法对食品中常见的干扰物(葡萄糖、果糖、k
+
、na
+
、ca
2+
、mg
2+
、谷氨酸、酒石酸、赖氨酸、组氨酸、柠檬酸、半胱氨酸)以更高浓度a进行吸光度测定，分别编号为blank、glu、fru、k
+
、na
+
、ca
2+
、mg
2+
、glut、ta、lys、his、ca、cys和aa，检测结果如图6所示。由图可知，本发明的基于复合纳米材料用于总抗氧化能力的快速比色分析方法对aa具有强的特异性，加入其它干扰物吸光度几乎不发生变化，除了半胱氨酸，在实际检测过程中，可通过添加n-乙基马来酰亚胺掩蔽剂，屏蔽半胱氨酸的干扰。这说明本发明的比色检测方法具有良好的抗干扰能力。
65.重复性考察
66.评估实施例1的mnco@c ncs复合纳米材料的重复性，将实施例1的mnco@c ncs复合纳米材料进行独立重复10次测试，结果如图7所示。由图7可知，10次独立性酶活测试几乎没有发生明显变化，说明本发明的mnco@c ncs复合纳米材料具有良好的重复性和稳定性。
67.由上述检测结果表明，本发明的基于核酸适配体调控复合纳米材料催化活性对抗生素的比色检测方法具有稳定性高、抗干扰能力强、高灵敏度等优点。
68.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，
凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。