1.本发明涉及微生态制剂领域，尤其涉及一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
2.叶酸是人体必需的b族维生素，在细胞增生过程中发挥非常重要的作用。缺乏叶酸会引起贫血、发育迟缓和白血球下降等疾病，孕妇缺乏叶酸会导致神经管畸形婴儿的发生。由于人体自身不能合成叶酸，需从外界中摄取，天然食物(绿色蔬菜为主)中叶酸以多元谷氨酸形式为主，烹饪过程中遇热易分解，稳定性差，且多元谷氨酸叶酸必须由肠道中的叶酸水解酶水解成单谷氨酸形态再参与代谢，导致生物利用率不高，仅50％左右。目前以服用人工合成叶酸的膳食补充剂作为主要形式，但叶酸在人体代谢过程中，需要5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶的参与，而世界上10％的人口受亚甲基四氢叶酸还原酶多态性的影响，无法充分利用叶酸。
3.目前，以生产叶酸营养鸡蛋作为安全且高生物利用率的叶酸获得新途径。蛋鸡可从饲料中吸收代谢合成叶酸，并富集在蛋黄中，合成叶酸(氧化型单谷氨酸叶酸)在蛋鸡体内代谢过程中会转变为5-甲基四氢叶酸(5-mthf)的单谷氨酸形式，并富集到鸡蛋中。富含这种形式叶酸的化鸡蛋不仅天然安全，而且其叶酸生物利用率高。但对于家禽而言，虽然饲料中含有叶酸，但主要是多元谷氨酸形式的叶酸，家禽对这类叶酸的利用率有限，据报道只有20％-30％，且叶酸均是合成叶酸(fa)，过量摄入fa会对人体产生负面影响。目前报道的鸡蛋5-mthf最高含量比较低，普遍在41-52μg/蛋之间，远达不到人体有效补充叶酸的水平，因此，开发更高效的叶酸鸡蛋是非常必要的。
技术实现要素：
4.本发明提供了一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂及其制备方法和应用，提供的富含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，应用于饲料时可以饲养生产出富集5-甲基四氢叶酸的叶酸鸡蛋，使5-甲基四氢叶酸的生物利用率高。
5.为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，包括以下重量份组分：抗氧剂：10-30份、b型明胶：2-10份、解淀粉芽孢杆菌发酵产物：30-105份、丁酸梭菌：20-55份、海藻酸钠：1-12份、魔芋甘露聚糖：0.1-1份、l-阿拉伯糖：3-11份、果聚糖：0.1-5份、壳聚糖：0.5-7份、分散剂：0.2-5份；其中解淀粉芽孢杆菌发酵产物由解淀粉芽孢杆菌经液体发酵制备得到，解淀粉芽孢杆菌发酵产物中5-甲基四氢叶酸的含量≥0.53wt％,活菌含量≥1.5*10
10
cfu/g；丁酸梭菌的浓度≥5*109cfu/g。
6.作为优选方案，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌boen-305，保藏编号为gdmcc no:62024。
7.作为优选方案，所述解淀粉芽孢杆菌发酵产物的制备方法包括以下步骤：
8.(1)种子液制备：将解淀粉芽孢杆菌boen-305接种到种子培养基中，于30℃-40℃
培养14-20h，得到种子液；
9.(2)发酵液制备：将步骤(1)的种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为1％～7％，培养温度30℃-40℃，风量0.5-1.0vvm，搅拌速度150-300r/min，发酵时间24-48h，得所述解淀粉芽孢杆菌发酵液；
10.(3)浓缩：将解淀粉芽孢杆菌发酵液离心收集沉淀，按沉淀：1％氯化钠溶液＝1：0.5混合搅拌均匀，得到解淀粉芽孢杆菌发酵产物，低温保存。
11.作为优选方案，所述种子培养基包括：蛋白胨3-10g/l，酵母膏0.2-1.5g/l，葡萄糖8-25g/l，硫酸镁0.05-0.5g/l，硫酸铁0.05-0.15g/l。
12.作为优选方案，所述液体发酵培养基包括：糖蜜12-25g/l，酵母粉5-18g/l，氯化钙1.2-3.5g/l，无水硫酸镁0.1-1g/l，硫酸锰0.01-0.5g/l，氯化钠2-5g/l，磷酸氢二钠0.1-5g/l，磷酸二氢钾0.01-0.5g/l，维生素c 0.05-0.2g/l。
13.作为优选方案，所述种子培养基的ph为7.0-7.5；所述液体发酵培养基的ph为7.2-7.5。
14.作为优选方案，还包括有重量份为0.5-10份的氯化钙。
15.作为优选方案，所述抗氧剂为亚铁盐。
16.作为优选方案，所述分散剂为微晶纤维素。
17.作为优选方案，所述亚铁盐为富马酸亚铁、硫酸亚铁、乳酸亚铁、葡萄糖酸亚铁中的一种或多种。
18.作为优选方案，包括以下重量份组分：抗氧剂：16-24份、b型明胶：3-7份、解淀粉芽孢杆菌发酵产物：65-95份、丁酸梭菌：28-45份、海藻酸钠：3-8份、魔芋甘露聚糖：0.3-0.7份、l-阿拉伯糖：5-9份、果聚糖：1-3份、壳聚糖：1-3份、分散剂：1-3份、氯化钙：3-7份。
19.作为优选方案，微生态制剂中的5-甲基四氢叶酸含量为0.5-1wt％。
20.作为优选方案，微生态制剂中的丁酸梭菌活菌含量为8*10
8-109cfu/g。
21.作为优选方案，微生态制剂中的解淀粉芽孢杆菌活菌含量为5*10
9-10
10
cfu/g。
22.作为优选方案，所述微生态制剂为颗粒、粉剂、微胶囊、片剂或丸剂。
23.为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
24.(1)将亚铁盐、b型明胶、抗氧化剂、b型明胶、海藻酸钠、魔芋甘露聚糖、l-阿拉伯糖、果聚糖加入解淀粉芽孢杆菌发酵产物浓缩液中搅拌混合，得到多糖与解淀粉芽孢杆菌发酵产物混合液；
25.(2)将丁酸梭菌加入多糖与解淀粉芽孢杆菌发酵产物混合液中，得到含菌混合液；
26.(3)将氯化钙、分散剂加入到含菌混合液中，离心后保留沉淀；
27.(4)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，调节ph得到壳聚糖溶液；
28.(5)将步骤(3)所得沉淀加入到壳聚糖溶液中，恒温搅拌，离心收集沉淀，进行冷冻干燥，得到微生态制剂。
29.为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂在制备饲料中的应用，该饲料用于饲养蛋鸡以生产叶酸鸡蛋。
30.相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
31.1、本技术采用解淀粉孢杆菌boen-305菌株发酵生产高5-甲基四氢叶酸含量和高
解淀粉芽孢杆菌活菌量的解淀粉芽孢杆菌发酵产物，同时添加丁酸梭菌，使制备的微生态制剂富含有5-甲基四氢叶酸和多种活菌，加入鸡饲料中，可以有效提高蛋鸡对饲料中叶酸的吸收和利用效率，快速在鸡蛋中富集，相比于其他的叶酸鸡蛋中含量增加了一倍多，可以高效补充人体叶酸水平，绿色环保，易于工业化生产。
32.2、本技术利用b型明胶的高粘度值使组合物形成紧密结合的固体组合物，从而对解淀粉芽孢杆菌发酵产物中5-甲基四氢叶酸形成保护效应，同时b型明胶为碱性明胶，能够改变微生态制剂的酸碱微环境，有利于增强解淀粉芽孢杆菌发酵产物的稳定性，从而使得该微生态制剂使用贮存过程中长效保持稳定，解决了微生态制剂在使用、运输过程中5-甲基四氢叶酸发生降解的问题。
33.3、本技术采用海藻酸钠、魔芋甘露聚糖、l-阿拉伯糖、果聚糖、壳聚糖作为包埋剂，各组分相互协同作用，使晶体间互相渗透、互相包埋，由于晶体结构致密，对活菌有良好的保护作用，可以稳定和延续体系中活菌的活性，同时被包埋的5-甲基四氢叶酸具有较高的生物利用率。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.本技术实施例或对比例方案中使用的丁酸梭菌购买于浙江惠嘉生物科技有限公司，丁酸梭菌的浓度≥5*109cfu/g。
36.本技术实施例或对比例方案中使用的解淀粉芽孢杆菌发酵产物，采用播恩基团自主筛选的解淀粉芽孢杆菌boen-305菌株发酵生产获得的浓缩菌液，该菌株于2021年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmcc no:62024，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，发酵方法包括以下步骤：
37.(1)种子液制备：将解淀粉芽孢杆菌boen-305接种到种子培养基中，于35℃培养18h，得到种子液；种子培养基包括：蛋白胨5g/l，酵母膏1g/l，葡萄糖16g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸铁0.1g/l，种子培养基采用蒸馏水配制而成，其ph为7.2；
38.(2)发酵液制备：将步骤(1)的种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为5％，培养温度35℃，风量0.8vvm，搅拌速度180r/min，发酵时间37h，得所述解淀粉芽孢杆菌发酵液；液体发酵培养基包括：糖蜜15g/l，酵母粉8g/l，氯化钙2.5g/l，无水硫酸镁0.5g/l，硫酸锰0.01g/l，氯化钠2g/l，磷酸氢二钠2g/l，磷酸二氢钾0.04g/l，维生素c0.1g/l，液体发酵培养基采用蒸馏水配制而成，其ph为7.3；
39.(3)浓缩：
40.将发酵液10000r/min，4℃离心15min，弃上清，收集沉淀，按沉淀：1％氯化钠溶液＝1：0.5混合搅拌均匀，得到解淀粉芽孢杆菌发酵产物浓缩液，低温保存，备用。上述解淀粉芽孢杆菌发酵产物的5-甲基四氢叶酸的含量(质量分数计)≥0.53％,活菌含量≥1.5*10
10
cfu/g。
41.实施例一
42.一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，包括以下原料重量份组分：亚铁盐21份、b型明胶5kg、解淀粉芽孢杆菌发酵产物88份、丁酸梭菌32份、海藻酸钠6份、魔芋甘露聚糖0.5份、l-阿拉伯糖8份、果聚糖1份，壳聚糖2份，微晶纤维素2份、氯化钙5份，其中氯化钙为食品级，亚铁盐为富马酸亚铁。
43.该微生态制剂包括如下制备步骤：
44.(1)将亚铁盐、b型明胶、海藻酸钠、魔芋甘露聚糖、l-阿拉伯糖、果聚糖按重量份加入解淀粉芽孢杆菌发酵产物浓缩液中搅拌混合，得到多糖与解淀粉芽孢杆菌发酵产物混合液；
45.(2)将丁酸梭菌按重量份加入上述混合液中，得到含菌混合液；
46.(3)将氯化钙、微晶纤维素按重量份加入上述含菌混合液中，放于冷冻离心机中离心，离心温度为4℃，离心转速8000rpm/min，离心时间18min，离心后去滤液，留沉淀；
47.(4)将壳聚糖按重量份溶于适量的0.1mol/l醋酸溶液中，用氢氧化钠调节ph为6.5，得到壳聚糖溶液。
48.(5)将步骤(3)所得沉淀加入到壳聚糖溶液中，在30℃下，180r/min恒温搅拌25min后，离心收集沉淀，进行冷冻干燥，获得富含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，剂型可根据实际应用来制作：颗粒、粉剂、微胶囊、片剂、丸剂等。
49.检测得到微生态制剂中5-甲基四氢叶酸含量以质量分数计为0.9％；解淀粉芽孢杆菌活菌含量为8*109cfu/g；丁酸梭菌活菌含量为9.2*108cfu/g。
50.实施例二
51.一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，包括以下原料重量份组分：亚铁盐16份、b型明胶3份、解淀粉芽孢杆菌发酵产物65份、丁酸梭菌45份、海藻酸钠3份、魔芋甘露聚糖0.3份、l-阿拉伯糖5份、果聚糖1份、壳聚糖1份、微晶纤维素1份、氯化钙3份，其中氯化钙为食品级，亚铁盐为硫酸亚铁。
52.该微生态制剂包括如下制备步骤：
53.(1)将亚铁盐、b型明胶、海藻酸钠、魔芋甘露聚糖、l-阿拉伯糖、果聚糖按重量份加入解淀粉芽孢杆菌发酵产物浓缩液中搅拌混合，得到多糖与解淀粉芽孢杆菌发酵产物混合液；
54.(2)将丁酸梭菌按重量份加入上述混合液中，得到含菌混合液；
55.(3)将氯化钙、微晶纤维素按重量份加入到上述含菌混合液中，放于冷冻离心机中离心，离心温度为4℃，离心转速8000rpm/min，离心时间15min，离心后去滤液，留沉淀；
56.(4)将壳聚糖按重量份溶于适量的0.1mol/l醋酸溶液中，用氢氧化钠调节ph为6.5，得到壳聚糖溶液；
57.(5)将步骤(3)所得沉淀加入到壳聚糖溶液中，在30℃下，180r/min恒温搅拌20min后，离心收集沉淀，进行冷冻干燥，获得富含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，剂型可根据实际应用来制作：颗粒、粉剂、微胶囊、片剂、丸剂等。
58.检测得到微生态制剂中5-甲基四氢叶酸含量以质量分数计为0.5％；解淀粉芽孢杆菌活菌含量为5*109cfu/g；丁酸梭菌活菌含量为8*108cfu/g。
59.实施例三
60.一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，包括以下原料重量份组分：亚铁盐24份、b
型明胶7份、解淀粉芽孢杆菌发酵产物95份、丁酸梭菌28份、海藻酸钠8份、魔芋甘露聚糖0.7份、l-阿拉伯糖9份、果聚糖3份、壳聚糖3份、微晶纤维素3份、氯化钙7份，其中氯化钙为食品级，亚铁盐为乳酸亚铁。
61.该微生态制剂包括如下制备步骤：
62.(1)将亚铁盐、b型明胶、海藻酸钠、魔芋甘露聚糖、l-阿拉伯糖、果聚糖按重量份加入解淀粉芽孢杆菌发酵产物浓缩液中搅拌混合，得到多糖与解淀粉芽孢杆菌发酵产物混合液；
63.(2)将丁酸梭菌按重量份加入上述混合液中，得到含菌混合液；
64.(3)将氯化钙、微晶纤维素按重量份加入到上述含菌混合液中，放于冷冻离心机中离心，离心温度为4℃，离心转速8000rpm/min，离心时间30min，离心后去滤液，留沉淀；
65.(4)将壳聚糖按重量份溶于适量的0.1mol/l醋酸溶液中，用氢氧化钠调节ph为6.5，得到壳聚糖溶液；
66.(5)将步骤(3)所得沉淀加入到上述壳聚糖溶液中，在30℃下，180r/min恒温搅拌35min后，离心收集沉淀，进行冷冻干燥，获得富含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，剂型可根据实际应用来制作：颗粒、粉剂、微胶囊、片剂、丸剂等。
67.检测得到的微生态制剂中5-甲基四氢叶酸含量以质量分数计为1％；解淀粉芽孢杆菌活菌含量为10
10
cfu/g；丁酸梭菌活菌含量为8*108cfu/g。
68.对比例一
69.某公司市售饲用级叶酸补充剂(维生素vb6含量≥98％)。
70.对比例二
71.某公司叶酸鸡蛋专用饲料添加剂(维生素vb6≥98,vb12含量≥98％)。
72.对比例三
73.一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，其制备方法各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，丁酸梭菌的添加量为0。检测得到的微生态制剂中5-甲基四氢叶酸含量以质量分数计为0.8％；解淀粉芽孢杆菌活菌含量为9*109cfu/g；丁酸梭菌活菌含量为0cfu/g。
74.对比例四
75.一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，其制备方法各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，b型粘胶采用淀粉替代。检测得到的微生态制剂中5-甲基四氢叶酸含量以质量分数计为0.6％；解淀粉芽孢杆菌活菌含量为7*107cfu/g；丁酸梭菌活菌含量为5*106cfu/gcfu/g。
76.对比例五
77.一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂，其制备方法各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，魔芋甘露聚糖和果聚糖的添加量为0。检测得到的微生态制剂中5-甲基四氢叶酸含量以质量分数计为
‑‑
；解淀粉芽孢杆菌活菌含量为6.3*107cfu/g；丁酸梭菌活菌含量为9*106cfu/gcfu/g。
78.性能检测试验
79.1、将实施例1-3和对比例1-5获得的产品应用于叶酸鸡蛋的生产，试验地在播恩集团广东省肇庆市怀集蛋鸡养殖基地，共选用3000羽蛋鸡参与试验，加入饲料中，添加量按每
公斤饲料中含有叶酸10mg，蛋鸡为285天的海蓝白，自由采食和饮水，单笼饲养，养鸡场温度控制在18-31℃。实验周期均为6周，分别在第2周、第3周、第4周、第5周和第6周最后一天随机收集鸡蛋测定5-mthf含量，同时以常规饲料作为对照组，最终试验结果如表1所示。
80.表1-实施例1-3和对比例1-5应用于生产叶酸鸡蛋第6周的试验结果
81.检测项目鸡蛋中5-甲基四氢叶酸含量(μg/蛋)实施例1102实施例299实施例3101对比例147对比例249对比例353对比例458对比例555常规饲料对照13
82.结合表1中实施例1-3和对比例1-2的性能检测结果可知，本技术采用解淀粉孢杆菌boen-305菌株发酵生产高5-甲基四氢叶酸含量和高解淀粉芽孢杆菌活菌量的解淀粉芽孢杆菌发酵产物，使制备的微生态制剂富含有5-甲基四氢叶酸和活菌，加入鸡饲料中，可以有效提高蛋鸡对饲料中叶酸的吸收和利用效率。以生产富含5-甲基四氢叶酸的鸡蛋，鸡蛋中5-mthf的含量在100μg左右，相比于其他的叶酸鸡蛋中含量增加了一倍多，可以高效补充人体叶酸水平。
83.结合表1中实施例1和对比例3的性能检测结果可知，本技术添加丁酸梭菌在微生态制剂中，使微生态制剂中含有丁酸梭菌活菌，可以保护5-甲基四氢叶酸的活性并促进其吸收利用效率。
84.结合表1中实施例1和对比例4的性能检测结果可知，利用b型明胶的高粘度值使组合物形成紧密结合的固体组合物，从而对解淀粉芽孢杆菌发酵产物中5-甲基四氢叶酸形成保护效应，同时b型明胶为碱性明胶，能够改变微生态制剂的酸碱微环境，使5-甲基四氢叶酸处于一个偏碱性环境，有利于增强解淀粉芽孢杆菌发酵产物的稳定性，从而使得该微生态制剂使用贮存过程中长效保持稳定，使最终叶酸鸡蛋中含有大量5-甲基四氢叶酸。
85.结合表1中实施例1和对比例5的性能检测结果可知，本技术采用海藻酸钠、魔芋甘露聚糖、l-阿拉伯糖、果聚糖、壳聚糖作为包埋剂，各组分相互协同作用，使晶体间互相渗透、互相包埋，由于晶体结构致密，对活菌有良好的保护作用，可以稳定和延续体系中活菌的活性，被包埋的5-甲基四氢叶酸具有较高的生物利用率。
86.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。