一种小鼠粪便中羰基代谢物的检测方法

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于液相色谱高分辨质谱联用的小鼠粪便中羰基代谢物的检测分析方法，利用提取、衍生等前处理过程，液相色谱分离，高分辨质谱全扫描结合dd-ms2扫描模式检测的分析化学技术手段，对小鼠粪便中羰基代谢物进行检测分析方法。

背景技术：

1、在大肠内，没有被肠黏膜吸收的食物残渣经过细菌的发酵和腐败作用变成粪便。粪便含有丰富的肠道微生物群衍生代谢物，其成分和变化不仅反映了肠道微生物群落的状态，而且反映了宿主生理健康状况。因此建立检测粪便样本中具有功能性的羰基代谢物如有机酸、氨基酸、脂肪酸、吲哚类、苯环类等化合物具有十分重要的意义。

2、羰基代谢物多数极性强，色谱保留弱，质谱检测的离子化效率低，常需要经过化学衍生结合色谱质谱联用技术检测。xianfu gao等人利用氯甲酸乙酯衍生结合气相色谱质谱联用技术，能够检测到73种代谢物，该检测方法采用两步衍生，方法较为繁琐，由于需要衍生活泼氢，实验过程水的介入可能会影响实验结果。guoxiang xie等人利用3nph衍生，建立了同时检测324种代谢物的试剂盒，但是只能针对已知化合物进行检测，对未知化合物的代谢变化却难以进行监测。

技术实现思路

1、本发明针对现有粪便样本中羰基代谢物色谱保留弱，检测灵敏度低，种类覆盖面窄等技术不足，提出了利用提纯、衍生，液相色谱分离及高分辨质谱全扫描结合dd-ms2扫描模式检测粪便样本中羰基代谢物的方法，该方法可以提高羰基代谢物的液相保留，提升质谱检测灵敏度，扩大可检测的羰基代谢物范围，适用于粪便样本中羰基代谢物的检测分析及代谢变化研究。

2、本发明的技术方案如下：

3、(1)收集癌症小鼠和健康对照小鼠各9例样本，分别称量20mg，加入200μl含50％乙腈水溶液，经研磨离心，得到含羰基代谢物上清液。

4、(2)取每例样本上清液40μl，分别依次加入25μl浓度为200mm 3nph溶液(50％乙腈水溶液配置)及25μl浓度为120mm edc溶液(含2.5％pyridine，50％乙腈水溶液配置)，50℃水浴衍生80min；

5、(3)另取每例样本上清40μl，混合，涡旋混匀后加入4mg 13c6-3nph，再加入500μl浓度为120mm edc溶液(含2.5％pyridine)，50℃水浴衍生80min。

6、(4)分别取经3nph衍生所得每例样本上清40μl，加入40μl经13c6-3nph衍生所得校正液，再利用80μl 10％乙腈水溶液稀释后备uhplc-ms分析。每个羰基代谢物经3nph衍生后利用其对应的13c6-3nph内标校正，保证了羰基代谢物检测的准确性。

7、液相色谱条件为：c18色谱柱，规格为100mm×2.1mm×1.7μm，流速0.35ml/min，柱温40℃，进样体积为5μl。流动相a相为含0.1％甲酸水溶液，b相为含0.1％甲酸乙腈溶液，采用梯度程序，初始流动相为15％b相，随后在4min内线性升高到27％b，接着在4min内继续升高到42％b，随后在0.5min内迅速升高到100％b并冲洗2.5min，在0.5min内恢复至初始流动相15％b平衡2.5min。

8、质谱采用高分辨质谱，质谱检测条件为：质谱采用esi源负离子扫描模式。full msscan range 100～800m/z，resolution 12e4，dd-ms2 resolution 3e4，选择质谱响应前10化合物自动打二级，碰撞能40，主要离子源参数为capillary temp 300℃，aux gas heatertemp 350℃，sheath gas flow rate 45arb，aux gas flow rate 10arb，spray voltage3kv，已知羰基化合物采用标准样品m/z及rt定性，未知化合物采用二级质谱产生137.0357特征碎片，并且与12c羰基衍生物相同rt下同时检测到13c羰基衍生物确定为羰基代谢物。

9、本方法综合利用了分析化学的提纯，衍生技术，并采用了uhplc-ms检测技术，改善了羰基化合物的液相保留，提高了其质谱响应。经3nph衍生所得每个羰基衍生物可利用其对应的13c6-3nph衍生物校正，保证了羰基代谢物检测的准确性。对46种已经化合物进行方法学考察发现，该方法灵敏度高，检测限达到0.0002-0.1μmol/l；以配置浓度作为横坐标，以各羰基衍生物峰面积与13c内标峰面积的比值作为纵坐标，制作标准曲线，线性相关系数r2>0.99。与文献报道方法相比，方法简单，灵敏度高，准确性好，覆盖面广，可以为粪便样本中羰基代谢物变化规律的研究提供帮助。

10、本发明具体步骤为，取新鲜样本，加入乙腈水溶液提取羰基代谢物，经过离心后一份上清利用3-nitrophenylhydrazine(3nph，3-硝基苯肼)衍生，另取上清混合后利用13c6-nitrophenylhydrazine(13c6-3nph)衍生，衍生后将经两种试剂衍生的产物等量混合，进行液相色谱高分辨质谱联用仪器(uhplc-ms)检测，数据结果采用12c/13c相对值进行统计学分析。本发明的检测方法能够快速地对粪便样品中羰基代谢物进行检测分析。

技术特征：

1.一种小鼠粪便中羰基代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下流程步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中乙腈水溶液为含乙腈体积含量10-50％，优选45％-55％。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中3nph溶液浓度为5-400mm，优选180-220mm，加入量为上清液体积1/4-3/4(优选2/4-2.5/4)；edc溶液浓度为3-240mm，优选100-130mm，edc溶液中含有体积浓度0-10％pyridine(吡啶)，优选2-2.5％，加入量为上清液体积1/4-3/4(优选2/4-2.5/4)。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中13c6-3nph加入量为0.5-2mg(优选0.8-1.2mg)每200μl混合上清液；edc溶液浓度为3-240mm，优选100-130mm，edc溶液中含有体积浓度0-10％pyridine(吡啶)，优选2-2.5％，加入量为上清液体积1/4-3/4(优选2/4-2.5/4)。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中水浴衍生温度为30℃-70℃(优选48-52℃)，衍生时间为20–100min(优选70-90min)。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中，取步骤(2)每例衍生所得样本20-60μl(优选38-42μl)，分别加入步骤(3)20-60μl(优选38-42μl)内标校正液，再加入40-100μl(优选75-85μl)乙腈水溶液稀释后，加入乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为10％-50％(优选8％-12％)。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)中两种或三种以上羰基代谢物采用其对应13c衍生产物校正，即每种羰基代谢物的质谱峰面积除以其对应的13c衍生产物的质谱峰面积，然后对癌症小鼠和健康小鼠两组相对值进行偏最小二乘判别分析(pls-da)并通过非参数检验筛选两组小鼠样本之间的差异代谢物进行分析。

9.根据权利要求1或2或7所述的检测方法，其特征在于：所述羰基代谢物包括含有可衍生的羰基基团的代谢物；与标准样品一级、二级质谱精确质量数(m/z)及保留时间(rt)吻合的确定为已知化合物(未确定的即为未知化合物)，涵盖有机酸、氨基酸、脂肪酸、吲哚和苯环类羰基化合物中的一种或二种以上；质谱数据[m-h]-列表中能够产生137.0357特征子离子，并且与[m-h]-相同rt下存在[m-h+6.018]-确定是未知的羰基化合物。

技术总结
本发明公开了一种基于液相色谱质谱联用快速检测小鼠粪便样本中羰基代谢物进行分析的方法，涉及分析化学在临床医学研究中的应用。具体步骤为，取新鲜样本，加入乙腈水溶液提取羰基代谢物，经过离心后一份上清利用3‑nitrophenylhydrazine(3NPH，3‑硝基苯肼)衍生，另取上清混合后利用<supgt;13</supgt;C<subgt;6</subgt;‑nitrophenylhydrazine(<supgt;13</supgt;C<subgt;6</subgt;‑3NPH)衍生，衍生后将经两种试剂衍生的产物等量混合，进行液相色谱高分辨质谱联用仪器(UHPLC‑MS)检测，数据结果采用<supgt;12</supgt;C/<supgt;13</supgt;C相对值进行统计学分析。本发明的检测方法能够快速地对粪便样品中羰基代谢物进行检测分析。

技术研发人员：王晓琳,李琦,许国旺,赵欣捷,于迪,赵莹,李艳丽,叶耀睿,张华,王婷
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15