一种牛奶过敏原特异性IgE抗体酶联免疫检测方法与流程

一种牛奶过敏原特异性ige抗体酶联免疫检测方法
技术领域
1.本发明属于抗体检测领域，具体涉及一种牛奶过敏原特异性ige抗体酶联免疫检测方法。


背景技术：

2.酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays，elisa)自建立以来，由于具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展并在临床上得到广泛的应用。
3.由于患者样本中的ige免疫球蛋白的含量通常仅为igg免疫球蛋白的四万分之一左右，常规的过敏ige检测方法将会受到大量的igg的干扰，灵敏度和特异性均较低，且过敏原耗用量大。而采用elisa酶联免疫捕获法建立人血清中过敏原特异性ige抗体的检测方法可以大大降低igg的干扰。由于elisa酶联免疫捕获法在微孔板上包被抗ige单克隆抗体，理论上仅对样本中的ige抗体进行捕获，从而能够降低igg抗体的干扰，提高特异性ige抗体检测的灵敏度与特异性。
4.但是，现有采用elisa酶联免疫捕获法建立人血清中过敏原特异性ige抗体的检测方法并不适合用于牛奶过敏原特异性ige抗体检测。由于微孔板在包被抗人ige抗体后，需要使用牛血清白蛋白(bsa)对微孔板进行封闭，减少微孔板的非特异性吸附来减少干扰，但bsa也是牛奶过敏原中的一种成分，固定在微孔板上的bsa会与患者样本中的抗bsa的igg抗体结合，而抗bsa的igg抗体会与生物素化的牛奶过敏原结合，从而导致假阳性。此外，人血清中其它的嗜异性抗体的干扰也会导致检测结果出现假阳性。这些假阳性的检测结果基本未被重视，且一些现有的阻断剂对这些假阳性干扰没有明显的效果，例如我们尝试使用常规的鼠源性阻断剂，没有表现出明显的阻断效果。另外，由于血清样本中ige抗体含量较低，加入常规阻断剂后导致检测样本被稀释，检测结果将会降低，进而影响了检测结果的准确性。因此，对于牛奶过敏原特异性ige抗体酶联免疫检测方法中存在检测结果不准确的问题，目前没有较好的解决方案。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于牛奶过敏原特异性ige抗体酶联免疫检测的阻断剂，其能够阻断待测样本中的抗牛血清蛋白抗体和嗜异性抗体的干扰，有效避免出现假阳性结果，提高检测结果的准确性。
6.本发明的另一目的是提供一种假阳性率低的非诊断治疗目的的牛奶过敏原特异性ige抗体酶联免疫检测方法。
7.本发明的另一目的是提供一种能够提高牛奶过敏原特异性ige抗体检测结果准确性的用于检测牛奶过敏原特异性ige抗体的试剂盒。
8.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
9.一种用于牛奶过敏原特异性ige抗体酶联免疫检测的阻断剂，所述的阻断剂包括
生物素
27.进一步优选地，所述的辣根过氧化物酶-链霉亲和素结合液货号为mc00128的浩欧博辣根过氧化物酶-链霉亲和素结合液。
28.进一步优选地，所述的混合液、所述的牛奶过敏原-生物素和所述的辣根过氧化物酶-链霉亲和素结合液的投料体积之比为1：(1.8～2.2)：(1.8～2.2)。
29.根据一种具体实施方式，所述的混合液的投料量为每孔50μl，所述的牛奶过敏原-生物素的投料量为每孔100μl，所述的辣根过氧化物酶-链霉亲和素结合液的投料量为每孔100μl。
30.再进一步优选地，所述的步骤(5)中使用的显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物显色液，终止液为0.2～0.8mol/l的h2so4，检测波长为420～480nm。
31.3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物显色液简称为tmb底物显色液，加入tmb底物孵育，反应液变为蓝色，然后加入硫酸终止反应，终止后反应液变为黄色。在酶标仪450nm读数(参比波长620nm或630nm，去除非特异吸光值的影响)，待测样本中的ige抗体浓度与光密度(od值)成正比。
32.本发明还提供一种用于检测牛奶过敏原特异性ige抗体的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的阻断剂。
33.优选地，所述的试剂盒还包括包被抗人ige抗体并经牛血清蛋白封闭的微孔板、牛奶过敏原-生物素、辣根过氧化物酶-链霉亲和素结合液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物显色液、终止液以及任选地包括抗ige抗体-生物素和/或校准品。
34.本发明与现有技术相比具有如下优势：
35.本发明首次针对牛奶过敏原特异性ige抗体酶联免疫捕获检测方法中存在的问题，将牛血清蛋白和货号为11922122103的罗氏阻断剂组合制备阻断剂，在不影响牛奶过敏原特异性ige抗体被微孔板上的抗人ige抗体捕获的前提下，成功阻断了待检测样本中的抗牛血清蛋白igg抗体与微孔板上的用于封闭的牛血清蛋白的结合以及嗜异性抗体与微孔板的非特异性结合，从而减少了由抗牛血清蛋白igg抗体和嗜异性抗体的影响造成的假阳性结果。本发明采用冻干品的形式，便于存放，并减少了因待检测样本被稀释导致的检测结果偏低的问题。
附图说明
36.图1为未添加实施例1的阻抗剂的待检测样本的酶联免疫捕获法检测原理图。
37.图2为添加实施例1的阻抗剂的待检测样本的酶联免疫捕获法检测原理图。
38.图3为实施例2的四参数曲线。
39.图4为实施例2中不同程度的干扰样本的酶联免疫检测的结果图。
具体实施方式
40.下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
41.在实践中，发明人发现由于现有用于牛奶过敏原特异性ige抗体免疫检测的试剂盒中的效果较好的包被有抗人ige抗体的微孔板均使用牛血清蛋白进行封闭，而牛血清蛋白也是牛奶过敏原中的一种，因此，检测样本中的抗牛血清蛋白igg抗体(anti-bsa igg抗体)会与微孔板上的牛血清蛋白结合，从而导致牛奶过敏原特异性ige抗体检测的假阳性结果，而且样本中的嗜异性抗体与微孔板的非特异性结合也会导致牛奶过敏原特异性ige抗体检测的假阳性结果。因此，发明人进行了大量的研究，首次提出将牛血清蛋白和货号为11922122103的罗氏阻断剂联用制备阻断剂，能够在不影响牛奶过敏原特异性ige抗体被微孔板上的抗人ige抗体捕获的前提下同时阻断了抗牛血清蛋白igg抗体和嗜异性抗体，有效避免假阳性结果。进一步地，发明人将由牛血清蛋白和货号为11922122103的罗氏阻断剂配制成阻断剂缓冲液后制备成冻干品，使用时，直接加入样本中溶解即可，样本体积变化极小，基本不会稀释样本，进而能够获得更准确的检测结果。
42.根据实施例，本发明的阻断剂为主成分为牛血清蛋白和货号为11922122103的罗氏阻断剂的冻干品。
43.具体地，本发明的阻断剂的制备方法为：
44.首先配制阻断剂缓冲液，然后采用冷冻干燥得到所述的阻断剂，所述的阻断剂缓冲液为：每100ml ph值为7.0～8.0的tris-hcl缓冲液中含有0.05～10g牛血清蛋白，50～300μl货号为11922122103的罗氏阻断剂以及0.01～1ml防腐剂。
45.具体地，本发明的阻断剂的使用方法为：直接将阻断剂与检测样本混合即可，例如，可将待检测的血清样本加入含有阻断剂冻干品的试管中，该阻断剂冻干品完全溶解后，直接加入微孔板中进行酶联免疫检测。
46.1.本发明阻断了样本中anti-bsa igg抗体与微孔板上的bsa的结合，减少了由anti-bsa igg抗体的影响造成的假阳性；还阻断了样本中嗜异性抗体与微孔板的非特异性结合，减少了由嗜异性抗体的影响造成的假阳性。
47.2.本发明的阻断剂不会影响牛奶过敏原特异性ige抗体被微孔板上的抗人ige抗体捕获，也不会干扰生物素的活性。
48.3.本发明的阻断剂采用了冻干品的形式，便于存放，并减少了因为血清处理过程中体积的变化导致的检测结果偏低的问题，
49.4.本发明在使用的过程中，不影响正常的检测流程，操作简单，产品稳定，效果明显。
50.下面通过实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。
51.以下实施例中，未注明的实施条件为本行业中的常规条件，试剂均可市购获得。
52.实施例1
53.配制阻断剂缓冲液：称取0.6mg三羟甲基氨基甲烷-盐酸，溶于100ml纯化水中，调节ph 7.0～7.5，然后再加入0.05ml proclin-300、0.5g bsa、150μl货号为11922122103的罗氏阻断剂，混匀，固体物质完全溶解。
54.按50μl/支的规格分装冻干，即得到阻断剂。
55.对比例1
56.配制阻断剂缓冲液：称取0.6mg三羟甲基氨基甲烷-盐酸，溶于100ml纯化水中，调节ph 7.0～7.5，然后再加入0.05ml proclin-300、0.5g bsa、50mg货号为11939661103的罗
氏mab33 igg1/igg1多聚体阻断剂，混匀，固体物质完全溶解。
57.按50μl/支的规格分装冻干，即得到阻断剂。
58.对比例2
59.配制阻断剂缓冲液：称取0.6mg三羟甲基氨基甲烷-盐酸，溶于100ml纯化水中，调节ph 7.0～7.5，然后再加入0.05ml proclin-300、50mg货号为11939661103的罗氏mab33 igg1/igg1多聚体阻断剂，混匀，固体物质完全溶解。
60.按50μl/支的规格分装冻干，即得到阻断剂。
61.实施例2
62.分别使用实施例1和对比例1、对比例2的阻断剂进行性能验证，以无阻断剂的检测结果为对照。
63.待检测的24例样本均来自临床血清，包括16例含有不同程度的干扰的阴性样本(0.41iu/ml-86.7iu/ml)、4例无干扰的阳性样本和4例无干扰的阴性样本。
64.检测方法：
65.将24例待测样本，每例样本取50μl加入含有实施例1阻断剂冻干品的冻存管中、含有对比例1阻断剂冻干品的冻存管中、含有对比例2的阻断剂冻干品的冻存管中，待冻干品完全溶解后作为样本按照以下实验步骤进行检测：
66.步骤1：吸取50μl校准品、质控及样本，分别加入到相应微孔中。
67.步骤2：室温孵育60分钟。
68.步骤3：用洗板机(或手工)清洗3次，每次300μl清洗液。在吸水纸上将微孔板残留的液体拍干。
69.步骤4：在样本中加入100μl牛奶过敏原-生物素，在校准品中加入100μl抗ige抗体-生物素。封板，室温孵育60分钟。
70.步骤5：孵育后按步骤3进行清洗。
71.步骤6：每孔加入100μl辣根过氧化物酶-链霉亲和素结合液，封板、室温孵育30分钟。
72.步骤7：按步骤3进行清洗。
73.步骤8：每孔加入100μl tmb底物液，封板、避光、室温孵育30分钟。
74.步骤9：按照加入底物液的顺序，每孔加入100μl终止液，轻拍架子以混匀微孔中的液体。5分钟内用酶标仪在450nm波长(参考波长620nm或630nm)处读数。
75.本实施例中，使用的酶联免疫检测试剂盒来自货号为mb00141的浩欧博产品，配套的校准品试剂盒来自货号为mb00132的浩欧博产品。
76.根据校准品od值(表1)绘制四参数曲线(图3)，y轴为od值，x轴为浓度，按照四参数曲线计算样本浓度。
77.表1
[0078][0079]
16例受干扰的阴性样本(0.41iu/ml-86.7iu/ml)和4例无干扰的阳性样本及4例无干扰的阴性样本的检测结果见表2和图4。
[0080]
表2
[0081][0082]
表1和图4结果显示，16例受干扰的阴性样本经对比例1和对比例2的阻断剂处理后，无完全阻断效果，检测结果全部为阳性；而经实施例1的阻断剂处理后检测，检测结果均为阴性。4例无干扰的阳性样本及4例无干扰的阴性样本，使用阻断剂对检测结果无影响。
[0083]
实施例3
[0084]
使用实施例1进行性能验证，然后对100例临床阴性样本及36例临床阳性样本进行
检测，以无阻断剂的检测结果为对照，无阻断剂阴性符合率为78％，阳性符合率为96％，加有实施例1的阴性符合率为92％，提高了14％，阳性符合率没有变化，仍为96％。检测结果见表3。
[0085]
表3
[0086]
[0087][0088]
实施例4
[0089]
稳定性测试：
[0090]
将实施例1的冻干的阻断剂进行37℃加热破坏10天，然后使用实施例2的样本(仅使用含有实施例1的阻断剂的样本)按照实施例2的方法进行检测，以2～8℃下保存10天的冻干品作对照，检测结果见表4。
[0091]
表4
[0092][0093]
表4显示，实施例1的冻干的阻断剂具有较高的稳定性，易于贮存。
[0094]
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。