1.本发明涉及果蔬泥中农药残留的检测方法，尤其涉及一种超高效合相色谱法快速测定果蔬泥中甲氰菊酯对映体残留的方法。
背景技术：
：：2.甲氰菊酯(fenpropathrin)，化学名称为α-氰基-3-苯氧基苄基-2,2,3,3-四甲基环丙烷酸酯，是一种重要的拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，中等毒性，杀虫谱广，常被广泛用于柑橘、苹果、荔枝等果蔬的病害防治，其大量的使用对食品和环境污染问题也引起人们的广泛重视。研究表明，甲氰菊酯具有1个手性碳原子，存在一对对映体，其结构为(-)-甲氰菊酯和(+)‑ꢀ甲氰菊酯[1-3]如图1所示。[0003]甲氰菊酯不同对映体之间杀虫活性和降解速度差异较大，其中(+)-甲氰菊酯的杀虫活性高于(-)-甲氰菊酯，且降解速度更快[1]。在农业生产过程中，若使用单一高活性(+)‑ꢀ甲氰菊酯，将有助于降低甲氰菊酯的使用量，减少农药对生态环境的污染，目前甲氰菊酯仍然是以外消旋体的形式生产和使用。为了控制甲氰菊酯的规范使用，各国制定了该类农药在果蔬中的最大残留限量标准，表1列出了常见的婴幼儿辅食果蔬泥中所添加果蔬的甲氰菊酯残留限量。但这些法规均只是规定了甲氰菊酯的外消旋体使用安全限量，并未精确规定(+)‑ꢀ甲氰菊酯和(-)-甲氰菊酯的残留限量。[0004]表1甲氰菊酯农药在苹果、草莓、番茄的残留限量要求[0005][0006]目前，毛细管电泳色谱法(cec)[4,5]、气相色谱法(gc)[6,7]、气相色谱-质谱法(gc-ms)[8,9]、高效液相色谱法(hplc)[10-12]、液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)[13-15]等方法在手性化合物分离领域均发挥着重要作用。其中cec色谱峰形良好，但分析时间长；gc和gc-ms灵敏度高，分离效果好，但主要分析沸点较低，热稳定性好的化合物；hplc分离度好，但有机试剂消耗量大；lc-ms/ms准确性高，但仪器昂贵、成本高。超高效合相色谱技术(upc2)作为一种新型高效的色谱分离技术受到了广泛的关注，该技术的主体流动相为超临界状态co2，可通过调整系统背压、色谱柱温度及有机溶剂的比例，使流动相的密度和极性发生改变，从而达到精密控制目标物分离效果的目的[16]，在手性分离的应用中具有明显优势[17-20]。目前，upc2技术应用于甲氰菊酯对映体的分离及残留测定未见有报道。20mg/l，线性相关系数大于0.9992，在0.2，0.4和2.0mg/kg3个加标水平下的回收率范围为80.6％-105％，相对标准偏差为2.6％-7.7％。[0027]本发明由于采用了上述的技术方案，建立了超高效合相色谱法分离和测定主要婴幼儿辅食果蔬泥(苹果泥、草莓泥、番茄泥)中两种甲氰菊酯对映体残留的方法。使用乙腈对样品进行提取，通过hlb柱对样品进行净化后，采用chiralpakad-3手性色谱柱分离，以超临界co2-甲醇为流动相梯度洗脱，外标法定量。定量限为0.2mg/kg，加标回收率范围为80.6％-105％，rsd为2.6％-7.7％。采用该方法对30份市场采购的果蔬泥样品中的甲氰菊酯对映体残留进行测定，检出量为0.21mg/kg-0.24mg/kg。附图说明[0028]图1甲氰菊酯不同对映体的结构式。[0029]图2甲氰菊酯对映体标准溶液的光谱图。[0030]图3不同色谱柱对(-)甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯对映体分离效果的影响图。[0031]图4不同系统背压对(-)甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯对映体分离效果的影响图。[0032]图5不同定溶剂对(-)-甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯分离效果的影响图。[0033]图6甲氰菊酯外消旋体的拆分图。[0034]图7阳性番茄泥样品的色谱图。具体实施方式[0035]1.1仪器、材料与试剂[0036]超高效合相色谱仪(美国沃特世公司，配有pda检测器)；台式离心机(美国thermo公司)；n-1210bv旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；jj500电子天平(美国双杰天平公司)；ae260电子天平(瑞士mettler公司)；wh-861涡旋混匀器(太仓市华利达实验设备有限公司)；synergy185超纯水仪(美国millipore公司)；氮吹仪(日本东京理化公司)；微孔过滤膜(0.22μm，有机相)；色谱柱chiralpakad-3、oj-h、ic(大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)；色谱柱acquitytrefoilcel1(美国waters公司)。[0037]异丙醇、丙酮、甲醇、正庚烷、乙腈(色谱纯，德国merck公司)；氯化钠(分析纯，上海试四赫维化工有限公司)；聚合物固相萃取小柱hlb柱(oasis，200mg，6ml)(使用前用6ml甲醇、6ml水依次活化)；c18柱(cnw，500mg，3ml)；弗罗里硅土(florisil)柱(cnw，1g，6ml)；水为超纯水；其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。[0038]标准品：甲氰菊酯外消旋体(cas号：39515-41-8，纯度≥98.4％，德国drehrenstorfergmbh公司)。甲氰菊酯对映体：(-)-甲氰菊酯、(+)-甲氰菊酯(纯度≥97％，上海勤路生物技术有限公司)。[0039]1.2标准储备液及工作液的配置[0040]1.2.1外消旋体标准储备液[0041]准确称取甲氰菊酯外消旋体标准品0.01g(精确至0.1mg)，用异丙醇准确定容至10ml容量瓶中，配成1.0g/l的外消旋体标准储备液。[0042]甲氰菊酯外消旋体的标准中间溶液：准确吸取一定量的外消旋体标准储备液，用正庚烷/异丙醇(9∶1,v/v)稀释至20.0mg/l的标准中间溶液。[0043]1.2.2对映体标准储备液[0044]分别准确称取(-)-甲氰菊酯、(+)-甲氰菊酯标准品0.01g(精确至0.1mg)，用异丙醇溶解并定容至10ml容量瓶中，配成1.0g/l的对映体标准储备液。[0045]两种菊酯对映体的混合标准工作溶液：分别准确移取一定量的(-)-甲氰菊酯和(+)‑ꢀ甲氰菊酯对映体标准储备液，用正庚烷/异丙醇(9∶1,v/v)逐级稀释至1.0、2.0、4.0、10.0、20.0mg/l的系列标准工作溶液。[0046]1.3样品前处理[0047]1.3.1样品提取[0048]称取试样5g(精确至0.01g)于50ml离心管中，加入20ml乙腈，均质提取，再加入3.0g氯化钠，涡旋混匀，4000r/min离心5min后，转移上清液至浓缩瓶中；下层残渣中加入20ml乙腈，重复提取1次，合并2次上清液，用旋转蒸发仪浓缩至近干，用10ml乙腈∶水(1∶1，v/v)溶解，待净化。[0049]1.3.2净化[0050]将待净化液于活化好的hlb柱中，上样后，用5ml水淋洗，弃去淋洗液，抽干后，用10ml丙酮洗脱，收集洗脱液，于40℃水浴中氮吹干至近干，加入1ml正庚烷/异丙醇(9∶1，v/v)溶解定容，定容液经0.22μm滤膜过滤，待测。[0051]1.4色谱条件[0052]色谱柱：chiralpakad-3(150mm×3.0mm，3μm)；流动相：a为co2，b为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.2min(3％b)，0.2～0.21min(3％～10％b)，0.21～2min(10％b)，2～2.5min(10％～3％b)，2.5～3min(3％b)。系统背压：17.2mpa；检测波长230nm；流速1.5ml/min；柱温31℃；进样量5μl。[0053]2结果与讨论[0054]2.1检测波长的选择[0055]通过pda检测器扫描后，从色谱图上提取甲氰菊酯对映体标准溶液的紫外光谱图。如图2所示，在203、230、275nm处均有明显的吸收峰，其中203nm处的吸收最强，灵敏度相对较高，但在该波长下干扰物的吸收也很强；230nm处吸收较强，甲氰菊酯对映体出峰处干扰峰较少；275nm处吸收最低。综合考虑，对甲氰菊酯化合物检测而言，用吸光度较高且杂质较少的230nm波长检测更具有优势，故本实验选择230nm作为检测波长。[0056]2.2色谱柱的优化[0057]基于直链淀粉-三(3.5-二甲基苯基氨基甲酸酯)与纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的手性固定相是应用最为广泛的两类色谱分离固定相，具有良好的手性识别能力和拆分能力，在手性识别能力方面互为补充[21]。本实验选择chiralpakad-3(150mm×3.0mm，3μm，填料为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、chiralpakoj-h(100mm×4.6mm，5μm，纤维素衍生物手性柱，表面涂敷了手性多聚物(直链淀粉或纤维衍生物)的球形硅胶)、chiralpakic(100mm×4.6mm，5μm，硅胶表面交联结合有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)和acquitytrefoilcel1(150mm×3.0mm，2.5μm，纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))共4种手性分离色谱柱对两种甲氰菊酯对映体的拆分效果进行考察。结果表明，采用ic和cel1手性色谱柱分离时，两种甲氰菊酯对映体的色谱峰完全重叠；采用oj-h手性色谱柱分离时，两种甲氰菊酯对映体的色谱峰能实现一定的分离，但分离度较差，无法实现基线完全分离，且色谱峰峰形展宽明显；而采用ad-3手性色谱柱分离时，分离度良好，且色谱峰形尖锐(图3)。因此本实验选择ad-3手性色谱柱对甲氰菊酯对映体进行分离。[0058]2.3系统背压的选择[0059]upc2采用超临界状态的co2作为流动相，实验过程中通过控制系统背压可有效改变流动相的粘度和密度，从而调节流动相的溶解能力和洗脱能力。流动相的粘度和密度会随着系统背压的升高而增加。由于co2压力超过7.38mpa且温度超过31℃时，co2才会达到超临界状态。因此本实验考察了10.3、12.1、13.8、17.2mpa4种系统背压对两种甲氰菊酯对映体分离的影响。如图4所示，当实验逐渐提高系统背压，目标物的保留时间提前，峰形变得更尖锐。4种条件下，两种甲氰菊酯对映体在系统背压17.2mpa时色谱峰形达到最佳。考虑ad-3手性色谱柱的最高推荐系统背压，本研究选择17.2mpa作为最佳系统背压。[0060]2.4不同定容试剂[0061]使用5种upc2常用的定容试剂：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、正庚烷对10mg/l的甲氰菊酯对映体进行拆分，结果表明，采用正庚烷的色谱峰形最佳。考虑到后续样品前处理步骤中使用正庚烷作为定容液时，正庚烷的溶解能力较差，从而降低甲氰菊酯对映体的回收率，实验采用了正庚烷和异丙醇混合溶液。同时本实验考察了不同比例的正庚烷和异丙醇混合溶液对甲氰菊酯色谱峰形的影响。结果如图5所示，随着异丙醇的比例增加，(-)甲氰菊酯的峰形逐渐尖锐，(+)-甲氰菊酯的峰形逐渐变差。综合考虑目标化合物的色谱峰形和溶解能力，最后确定正庚烷/异丙醇(9∶1,v/v)为本实验定容试剂。[0062]2.5外消旋体标准品的拆分[0063]采用本发明建立的方法对所采购的甲氰菊酯外消旋体标准品进行拆分及测定。如图6所示，两种甲氰菊酯对映体的分离效果良好，在1.4min内实现了有效拆分，分离度为1.7，符合r≥1.5完全分离的要求[22]。按照色谱峰的保留时间顺序，依次为：(-)-甲氰菊酯、(+)-甲氰菊酯。相比文献[1，2]报道的hplc法，该方法的分析时间短，分离度更高。根据上述所绘制的标准曲线，采用外标定量法计算1.2.1节甲氰菊酯外消旋体标准中间溶液20.0mg/l中的两种甲氰菊酯对映体含量，其中(-)-甲氰菊酯的含量为9.3mg/l,(+)-甲氰菊酯的含量为10.7mg/l。甲氰菊酯外消旋体中(-)-甲氰菊酯与(+)-甲氰菊酯的含量比值与文献[2]报道的采用hplc法分离的比例一致。[0064]2.6净化条件的优化[0065]实验比较了hlb[23-25]、c18[26]和florisil[27]等不同种类固相萃取柱对果蔬泥样品提取溶液的净化效果。在不含甲氰菊酯的苹果泥、草莓泥、番茄泥样品中分别加入两种甲氰菊酯对映体标准溶液，用乙腈均质提取2次，提取液浓干复溶后，分别采用3种不同固相萃取柱进行净化。实验结果显示，采用florisil柱净化时，(-)-甲氰菊酯存在干扰峰，且回收率为29.2％；采用hlb柱净化时，两种甲氰菊酯对映体的平均回收率均可达95.5％以上。使用hlb柱样品测定的重复性比c18柱好，与文献报道现象相符[23]，因此，实验最终选择hlb固相萃取柱作为净化柱。[0066]2.7方法学考察[0067]2.7.1线性范围和定量限[0068]选择“1.2.2节”中的1.0、2.0、4.0、10.0、20.0mg/l的甲氰菊酯对映体系列标准工作溶液，按照优化后的色谱条件进行测定，以对应峰面积为纵坐标(y)，标准溶液的质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，进行线性回归，如表2所示。通过在不含有甲氰菊酯的果蔬泥空白样品中添加标准品，按照优化后的方法进行测定，以信噪比(s/n)＝10计算方法的定量限(loq)，得到(-)-甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯的loq均为0.2mg/kg。在表2所列的线性范围内，线性良好，相关系数(r2)均大于0.9992。[0069]表2甲氰菊酯对映体的线性范围、线性方程、相关系数和定量限[0070][0071]2.7.2回收率和精密度[0072]采用分别在不含有甲氰菊酯的果蔬泥空白样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率和方法的精密度测定，(-)-甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯的添加水平分别为0.2，0.4，2.0mg/kg，平行测定6次，计算加标回收率及rsd，结果见表3。两种目标化合物的回收率范围为80.6％-105％，rsd(n＝6)范围为2.6％-7.7％。该回收率和精密度符合sante/12682/2019[28]的要求，能够满足苹果泥、草莓泥、番茄泥样品的分析要求，可用于日常分析的检测。[0073]表3苹果泥、草莓泥、番茄泥样品中2种甲氰菊酯对映体的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)[0074][0075]2.8实际样品的测试[0076]为了考察本发明的有效性和实用性，应用所建立的方法对随机抽取的30份市售苹果泥、草莓泥、番茄泥样品(其中苹果泥10份、草莓泥6份、番茄泥14份)中两种甲氰菊酯对映体进行检测。结果显示，1份番茄泥样品中检出两种甲氰菊酯对映体成分，其中(-)-甲氰菊酯含量为0.21mg/kg，(+)-甲氰菊酯含量为0.24mg/kg(见图7)，该情况与文献[2]报道工业品甲氰菊酯外消旋体中(-)-甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯的比例基本相符。[0077]3结论[0078]本发明建立了超高效合相色谱法分离和测定主要婴幼儿辅食果蔬泥(苹果泥、草莓泥、番茄泥)中两种甲氰菊酯对映体残留的方法。使用乙腈对样品进行提取，通过hlb柱对样品进行净化后，采用chiralpakad-3手性色谱柱分离，以超临界co2-甲醇为流动相梯度洗脱，外标法定量。定量限为0.2mg/kg，加标回收率范围为80.6％-105％，rsd为2.6％-7.7％。采用该方法对30份市场采购的果蔬泥样品中的甲氰菊酯对映体残留进行测定，检出量为0.21mg/kg-0.24mg/kg。[0079]以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本发明中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本发明所示的这些实施列，而是要符合与本发明所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。[0080]参考文献[0081]1.朱美娜，李朝阳，李巧玲，等.土壤中甲氰菊酯对映体选择性降解的研究.江苏农业科学.2011,39(6):481-483[0082]2.高如瑜,祝凌燕,陈志远.手性菊酯类农药甲氰菊酯、氟胺氰菊酯光学异构体在hplc上的分离.农药.1998,37(9):22-24.[0083]3.s-氰醇和s-甲氰菊酯的手性合成及产业化.(2016-03-16).[2021-12-19].http://www.dicp.ac.cn/kycg_1/yyyjcg/201809/t20180906_5064992.html[0084]4.balinta,carjeag,munteandl,imres.researcharticle.theinfluenceofsomeparametersonchiralseparationofibuprofenbyhigh-performanceliquidchromatographyandcapillaryelectrophoresis.actamedicamarisiensis.2017,63:36-40[0085]5.storchj,kalíkovák,tesaováe,maierv,vacekj.developmentofseparationmethodsforthechiralresolutionofhexahelicenes.jchromatogra.2016,1476:130-134.[0086]6.shindw,kobj,cheongjc,leew,kims,kimjy.impurityprofilingandchemometricanalysisofmethamphetamineseizuresinkorea.analyticalscience&technology.2020,33:98-107.[0087]7.motokow,hidehikow,deveniera,wolfgange,heinzek.analyticalandsensorycharacterizationofthestereoisomersof3-mercaptocycloalkanonesand3-mercaptocycloalkanols.jagrfoodchem.2020,68:7184-7193.[0088]8.duellak,kerberpj,luowt,peytondh,determinationof(r)-(+)-and(s)-(-)-nicotinechiralityinpuffbare-liquidsby1hnmrspectroscopy,polarimetry,andgaschromatography-massspectrometry.chemrestoxicol.2021,34:1718-1720.[0089]9.casillia,decorzante,jaquiera,delorte,multidimensionalgaschromatographyhyphenatedtomassspectrometryandolfactometryforthevolatileanalysisofcitrushybridpeelextract.jchromatogra.2014,1373:169-178.[0090]10.gurupadayyab,reddym,prabhakarp,raikarp,mandalsp.chiralseparationofoxomemazineenantiomersbyhplctechniqueandenantiomericseparationmechanismviadockingstudies.currpharmanal.2021,17:222-30.[0091]11.sutharsk,rauschera,winternitzm,gyimesim,málnásica,chiralhplcseparationofenantiomericblebbistatinderivativesandracemizationanalysisinvertebratetissues.jpharmaceutbiomed.2021,204:114-246.[0092]12.jingx,huangx,wanghh,xuehy,wubq,wangxw,jialy,poppingcandy-assisteddispersiveliquid-liquidmicroextractionforenantioselectivedeterminationofprothioconazoleanditschiralmetaboliteinwater,beer,baijiu,andvinegarsamplesbyhplc.foodchem.2021,348:129-147.[0093]13.karakkakalak,karatttk,philipm,meissirs,nalakathj,separationanddeterminationoftheenantiomericlevamisoleanddexamisoleinequineplasmasamplesusingchiralpolysaccharidecolumn/lc-ms/ms.curranalchem.2020,16:761-7.[0094]14.yoshiyukio,masahitot,togos,torua,lc-ms/msandchiropticalspectroscopicanalysesofmultidimensionalmetabolicsystemsofchiralthalidomideanditsderivatives.chirality.2017,29:282-293.[0095]15.singhsp,dwivedin,rajuksr,tanejai,wahajuddinm.validationofarapidandsensitiveuplc-ms-msmethodcoupledwithproteinprecipitationforthesimultaneousdeterminationofsevenpyrethroidsin100μlofratplasmabyusingammoniumadductasprecursorion.janaltoxicol.2016,40:213-221.[0096]16.ultra-performanceconvergencechromatography(upc2):newcategoriesofchromatographyhaveempoweredscientistswithnewimaginations.(2012-05-15)[2021-12-20].https://www.antpedia.com/index.php？action-viewnews-itemid-212253-php-1[0097]17.张文华,谢文,侯建波,等.超高效合相色谱法对6种三唑类农药对映体的拆分及其在黄瓜中的残留分析.色谱.2019,37(12):1356-1362[0098]18.jiangh,yangl,xingxd,yanml,guoxy,yangby,wangqh,kuanghx.developmentofananalyticalmethodforseparationofphenolicacidsbyultry-performanceconvergencechromatography(upc2)usingacolumnpackedwithasub-2-μmparticle.jpharmaceutbiomed.2018,153:117-125.[0099]19.yuws,liux,zhangyz,linyn,qiuj,kongfy.simultaneousdeterminationofpigmentsinteabyultra-performanceconvergencechromatography(upc2).anallett.2020,53:1654-1666.[0100]20.zhangwh,xiew,houjb,huxl,wangp,zhangyq,xudm.analyticalresearchontheseparationandresidueofchiralpesticidetriadimenolinfruitandvegetablepuree.jsepsci.2021,44:3516-3523.[0101]21.okamotoy,yashimae.polysaccharidederivativesforchromatographicseparationofenantiomers.angewcheminted.1998,37:1020-1243[0102]22.中国药典[s].一部.2020.[0103]23.董盛月.蜂王浆中氟胺氰菊酯与氟氯苯氰菊酯残留的提取净化及超高效液相色谱测定方法研究.食品科学.2009,30(8):272-274.[0104]24.吴飞,邵爱梅,徐晓培.高效液相色谱法测定饮用水中莠去津、三氯杀螨醇、氰戊菊酯、甲氰菊酯和二氯苯醚菊酯.现代预防医学.2020,47(19):3619-3622.[0105]25.罗钰.固相萃取-gc-ecd法检测土壤中的腐霉利、氰戊菊酯、甲氰菊酯和五氯硝基苯残留量.化学工程师.2020,299(8):28-30.[0106]26.李敏青,安文佳,李菊,等.固相萃取_气相色谱法测定禽蛋中19种农药残留.分析测试学报.2020,39(4):520-525.[0107]27.李盛丽.固相萃取-gc-ecd检测沃柑中的腐霉利、五氯硝基苯和甲氰菊酯残留.轻工科技,2020,36(7):125-126.[0108]28.sante/12682/2019guidancedocumentonanalyticalqualitycontrolandmethodvalidationproceduresforpesticideresiduesanalysisinfoodandfeed.当前第1页12当前第1页12