一种基于妊娠中期失眠产妇脑脊液脂质组学代谢物预测新生儿异常体重的分析方法

1.本发明涉及生物信息技术领域，具体涉及一种基于妊娠中期失眠产妇脑脊液脂质组学代谢物预测新生儿异常体重的分析方法。


背景技术：

2.妊娠中期失眠高发，与新生儿异常体重的发生密切相关。出生时体重偏轻或巨大儿，在新生儿时易发生低血糖，低体温，易感染，呼吸窘迫综合症，伴发先天性心脏病等风险，进入儿童期后，存在认知能力低下，学习困难，行为异常，身材矮小等，成年后，出现超重、肥胖、糖脂代谢异常，高血压及糖尿病等疾病的发病率增高。新生儿异常体重的发生涉及个体的多个方面，且失眠可直接致使脂代谢异常，寻找并确定妊娠中期失眠引起新生儿异常体重的特异性靶标，同时在妊娠中期有足够的时间可干预胎儿体重，而在妊娠晚期对胎儿体重的干预时间短，治疗新生儿异常体重的效果欠佳，由此制定适合临床的预防与干预策略。
3.代谢组学是一种高灵敏度，高通量分析方法，可用于研究病理生理状态下低分子量代谢物的特征变化。脂质是一类多样化的分子，在细胞内能量的贮存、细胞结构以及信号传递方面都有着重要的作用。脂质组学是代谢组学的一个重要分支，通过鉴定并详细分析脂质代谢物对生物体、组织或细胞以及与其相互作用的分子与在生物体系中的多重作用。超高效液相色谱-质谱(lc/ms)联用技术作为脂质组学分析中广泛采用的技术之一，具有高分离度、高速度和高灵敏度的特点。
4.以往研究中，常采用交叉验证方法建立代谢物筛选模型，特点是将样本的代谢组数据分为两个部分，其中一部分用来建立模型，另一部分用来评价模型的预测能力，根据预测能力的好坏选择模型参数，从而确定最终模型。但是这种建模方法存在一定缺陷：判别模型预测能力的不是独立样本。因为在建模过程中所有样本都会被用来建立模型，所以该过程存在一定程度的非独立性，干扰了模型预测能力的判别和模型预测误差的估计。缺乏完全独立性的建模科导致过拟合的可能，这样的模型不能真实有效地反映代谢组数据的信息，从而对标记物的筛选出现偏差。
5.本方法基于使用妊娠中期失眠孕妇脑脊液(csf)代谢组学分析方法，包括收集新生儿体重正常的妊娠中期失眠孕妇csf与新生儿体重异常的妊娠中期失眠孕妇csf样本，处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，再进行lc/ms检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。对数据进行分析得到代谢组轮廓，建立双重交叉验证筛选模型，筛选新生儿体重正常与新生儿体重异常的妊娠中期失眠孕妇csf脂质差异特异性标记物。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种基于妊娠中期失眠产妇脑脊液脂质组学代谢物预测新生儿异
常体重的分析方法，解决了以上所述的技术问题。
7.本发明解决上述技术问题的方案如下：
8.一种基于妊娠中期失眠产妇脑脊液脂质组学代谢物预测新生儿异常体重的分析方法，包括以下步骤：
9.s1、样品制备：收集行剖宫产手术中孕妇进行腰椎穿刺抽取csf1ml置于生化管中，放置4℃冰箱中，当日分装，储存于-80℃低温冷冻储存箱，待样本收齐后统一后，进行处理；
10.s2、超高效液相色谱-质谱检测分析：将csf样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析；
11.s3、数据分析：提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、用于统计分析的数据，通过正交偏最小二乘判别分析和配对样本t检验对数据进行分析，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质结合已有文献报道进行初步鉴定和验证。
12.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
13.进一步，s1中处理方法为:样品前处理，向0.1ml的csf中加入1.4ml的提取液，提取液为100％异丙醇，之后转入2ml离心管中，漩涡振荡10秒以上，超声处理10分钟，然后在-20度冰箱中冷冻60分钟，取出后在室温下漩涡振荡，用冷冻离心机10000g离心10分钟，然后取上清液1ml并过0.22μm的有机相滤膜到玻璃进样瓶中，保存在冰箱中待测。
14.进一步，质量控制样品通过合并所有csf样品的等分试样代表分析中的csf样品，且每5个样品中放置空白样品和质量控制样品，空白样品中异丙醇：水为9:1。
15.进一步，s3中opls-da按照opls的vip值挖掘差异代谢物，得到失眠与睡眠正常组有差异的脂质分子，通过交叉比较，得到共有差异脂质分子；再对共有脂质分子与妊娠中期失眠的且新生儿体重异常的孕妇和psqi量表分数做相关分析，通过分析相关性结果与临床症状的病理吻合性进行验证，得到代谢异常预测脂质分子。
16.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
17.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.在附图中：
19.图1为本发明的流程框图示意图。
具体实施方式
20.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在下列段落中参照附图以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
21.需要说明的是，当组件被称为“固定于”另一个组件，它可以直接在另一个组件上或者也可以存在居中的组件。当一个组件被认为是“连接”另一个组件，它可以是直接连接
到另一个组件或者可能同时存在居中组件。当一个组件被认为是“设置于”另一个组件，它可以是直接设置在另一个组件上或者可能同时存在居中组件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。
22.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
23.请参阅图1，本发明提供的实施例：
24.实施例一
25.一种基于妊娠中期失眠产妇脑脊液脂质组学代谢物预测新生儿异常体重的分析方法，包括以下步骤：
26.s1、样品制备收集行剖宫产手术中孕妇进行腰椎穿刺抽取脑脊液(csf)1ml置于生化管中，放置4℃冰箱中，当日分装，储存于-80℃低温冷冻储存箱，待样本收齐后统一处理，处理方法为:样品前处理，向0.1ml的csf中加入1.4ml的提取液(100％异丙醇)，转入2ml离心管(进口离心管，塑料不易溶于有机溶剂中；axygen品牌)中，漩涡振荡10秒以上，超声处理10分钟，然后在-20度冰箱中冷冻60分钟，取出后在室温下漩涡振荡，用冷冻离心机10000g离心10分钟，然后取上清液1ml并过0.22μm的有机相滤膜到玻璃进样瓶中，保存在冰箱中待测；质量控制(qc)样品通过合并所有csf样品的等分试样代表分析中的csf样品；每5个样品中放置空白样品(异丙醇/水，9:1v/v)和qc样品，经处理后准备进行超高效液相色谱-质谱检测分析，完成脂质组学实验；失眠情况根据匹兹堡睡眠质量指数量表(pittsburghsleepqualityindex，psqi)确定。
27.s2、超高效液相色谱-质谱检测分析：将csf样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，超高效液相色谱-质谱检测分析的仪器分析平台为uplc-qtof/ms(acquity uplc i-class，waters，manchester，uk)，进行电喷雾电离四倍飞行时间质量光谱仪(xevo g2-s q-tof，a waters，manchester，uk)；acquity uplc csh色谱柱c18 column，[1.7μm，1mm(i.d.)
×
50mm(长)]，1/pkg/；用于lc分离和色谱柱保持为55℃；柱温：55度；流速为0.4ml/min，进样体积为2μl；流动相组成：a：acn/h2o(60％/40％)，含有10mm甲酸铵和0.1％甲酸；b：ipa/acn(90％/10％)，含有10mm甲酸铵和0.1％甲酸(注：acn为乙腈，ipa为异丙醇)
[0028]
洗脱程序如下，梯度洗脱，保持自动进样器为4℃：
[0029]
[0030][0031]
质谱条件正离子模式条件以氮气作为雾化、锥孔气体飞行检测模型；正负极毛细管电压为3kv模式，两种模式下的锥形电压均为25v，源设置为120℃，锥形气体流量为50升/h，去溶剂化温度设定为450℃，850升/小时的去溶剂化气体流量；使用两次斜碰撞能量扫描的连续模式获取mse数据；分子量扫描范围：50-2000m/z；分辨率模式(轮廓图)；正负离子模式各采集一次；离子源：电喷雾电离源(esi)；毛细管电压：3kv；锥孔电压：25v；斜碰撞能量：15-60v；源温度：120度；脱溶剂温度：500度；锥孔气体速度：50l/h；脱溶剂气体速度：800l/h；扫描时间：0.2s；使用亮氨酸脑啡肽(watersco.，manchester，uk)被用作锁定质量参考离子，(m/z556.2771，正离子；554.2615，负离子)锁定喷雾以5μl/分钟的速率进行实时校正；使用甲酸钠进行校正。
[0032]
s3、收集csf样本，处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，在进行检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据；采用正交偏最小二乘判别分析(opls-da)和配对样本t检验对数据进行分析，其中opls-da按照opls的vip值挖掘差异代谢物，得到失眠与睡眠正常组有差异的脂质分子，通过交叉比较，得到共有差异脂质分子；再对共有脂质分子与妊娠中期失眠的且新生儿体重异常的孕妇和psqi量表分数做相关分析，通过分析相关性结果与临床症状的病理吻合性进行验证，得到代谢异常预测脂质分子。
[0033]
基于实施例1的一种基于妊娠中期失眠产妇脑脊液脂质组学代谢物预测新生儿异常体重的分析方法工作原理是：本发明抽取交叉验证的优异特点，采用正交偏最小二乘判别分析(opls-da)和独立样本t检验对数据分析结果进行交叉比对，避免交叉验证方法非独立性的缺点，将其应用于妊娠中期失眠孕妇脂代谢异常引起新生儿异常体重的研究中，通过与产妇的睡眠情况、生化指标(alt、ast、生物信息t、tc、tg、ldl)与新生儿体重的相关分析确认并验证差异脂质代谢物，从而在全面、综合地考察妊娠中期失眠对脂代谢异常有较大影响的脂质代谢相关标记物的同时，实现标记物的合理筛选；本方法对妊娠中期失眠导致新生儿体重异常的早期预测和预后提供有利的技术支持。
[0034]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。