一种地龙小分子肽的表面辅助激光解吸电离质谱检测方法

1.本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种地龙小分子肽的表面辅助 激光解吸电离质谱检测方法。


背景技术：

2.基质辅助激光解吸电离质谱(maldi-ms)已成为分析肽、蛋白质、聚合 物、多糖等大分子不可或缺的工具。与其他离子源质谱相比，maldi-tof 更容易获得单电荷准分子离子峰。在maldi技术中，α-氰基-4-羟基肉桂酸 (hcca)、介子酸(sa)等有机底物实现了较高的解吸和电离效率。然而，由于 有机基质的自电离作用，在质谱低于700da的低质量端中造成了严重的背景 干扰，从而影响了小分子化合物的检测。因此，一些研究人员提出了基于 maldi原理的表面辅助激光解吸电离质谱(saldi-ms)。该方法可以扩大 maldi-ms的应用范围，减少小分子检测中的干扰，提高检测灵敏度(minhaset al.,2020；song&cheng,2020)。
3.然而，目前还有很多小分子未能实现saldi-ms检测，例如地龙多肽 f-1。这是由于大多数小分子肽的分子量小于700da，而在低质量端使用传 统的基质会造成严重的背景干扰，故在maldi-ms分析中很难实现小分子 肽的maldi-ms分析。
4.金属有机骨架(metal-organic framework，mofs)，又称多孔配位聚合物 (pcps)，是一种多孔晶体材料，在气体储存、分离、催化、传感和能源等领 域表现出优越的性能。因其具有比表面积大、孔隙率高、功能多样、化学稳 定性好等独特性质而具有优势。mofs在生物研究领域应用广泛，尤其是在 蛋白质组学和多肽研究的样品制备方面中。随着mofs材料和后修饰技术的 发展，用作saldi-ms基质的mofs种类及可分析化合物的种类明显增多。 通过与功能材料结合或修饰特定的功能基团，mof材料可以同时具有底物和 富集的功能(bie,huang,zhang,&chen,2019；yang&xia,2019)。zian lin等 人(l.chen et al.,2016)利用磁性zif-8纳米材料作为maldi基质，实现了脂 肪酸、多肽、性激素等一系列小分子化合物的分析。lianfang chen等人(l. chen et al.,2016)合成两种新材料uio-66-pdc和uio-66-(oh)2作为磷酸吡 哆醛和葡萄糖分析的基质。此外，fan等人(fan et al.,2020)发现，与传统的 底物相比，表面修饰的sba-15@aptes@mof和sio2@aptes@mof可以 作为一系列低分子量化合物分析的底物，具有成本低、灵敏度高、稳定性好 的优点。因此，利用mof作为saldi-ms的底物，可以实现复杂样品中小 分子化合物的快速检测。
5.由于mof材料与小分子的结合能力与其本身的结构有关，为了实现 saldi-ms检测，需针对待检测小分子，寻找一种能够实现特异性结合的 mof材料。此外，在saldi-ms检测中，mof材料的用量等检测条件对检 测方法的灵敏度等也有重大的影响。因此，针对各种小分子进行mof材料 和检测条件的筛选，实现同时满足高特异性、高灵敏度的saldi-ms检测仍 然是本领域的重要研究课题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的缺陷，本发明提供一种地龙小分子肽的表面辅助激光解 吸电离
质谱检测方法，目的在于通过优选基质和基质用量，实现地龙小分子 肽f-1的表面辅助激光解吸电离质谱检测。
7.一种地龙小分子肽的表面辅助激光解吸电离质谱检测方法，包括如下步 骤：
8.步骤1，将待测样品制成待测样品溶液；
9.步骤2，将待测样品溶液和nu-1000溶液点样至靶板上，得到样品点； 其中，所述nu-1000溶液的浓度为0.025-3mg/ml；
10.步骤3，采用表面辅助激光解吸电离质谱对步骤2得到的样品点进行分 析，得到待测样品中地龙小分子肽f-1的检测结果。
11.优选的，所述待测样品为细胞内液。
12.优选的，所述nu-1000是由1,3,6,8-四苯甲酸-芘和zr6(μ
3-oh)8(oh)8配 位得到的三维多孔金属有机骨架材料。
13.优选的，步骤2中，所述点样的方法为分层点样法或混合点样法。
14.优选的，所述分层点样法具体步骤为：将0.5～1μl nu-1000溶液滴在靶 板上，干燥后得到基质点；然后将0.5～1μl待测样品溶液滴在所述基质点上， 干燥后得到样品点。
15.优选的，所述混合点样法具体步骤为：将0.5～1μl nu-1000溶液和0.5～1 μl待测样品溶液混合后滴在靶板上，干燥后得到样品点。
16.优选的，步骤2中，所述nu-1000溶液的浓度为0.5mg/ml。
17.本发明还提供nu-1000作为表面辅助激光解吸电离质谱法检测f-1的基 质的用途。
18.本发明中，所述“f-1”为地龙药材中的活性成分ac-amvss。
19.所述“nu-1000”为由1,3,6,8-四苯甲酸-芘和zr6(μ
3-oh)8(oh)8配位得到 的三维多孔金属有机骨架材料，其金属节点和八个羧基配位，留出的zr配位 点被-oh占据，其中一半的-oh伸向介孔六面体通道中。其比表面积和孔体 积分别高达2320m2/g和1.40cm3/g，同时具有三角形(1.2mm)和六边形(3.0 nm)孔。nu-1000热稳定性高达500℃。nu-1000的制备方法可参考inorganicchemistry,2017,56(22):14178-14188。
20.本发明以nu-1000材料为基质，以地龙小分子肽f-1为检测对象，实现 了表面辅助激光解吸电离质谱检测。从结果可以看出，与传统基质相比， nu-1000在地龙小分子肽f-1的检测方面具有明显的优势，可以增强待测样 品的离子信号强度，实现无背景干扰的地龙小分子肽检测。特别的，作为优 选的方案，基于nu-1000对地龙小分子肽f-1的吸收富集和生物大分子的排 除，可以轻易实现细胞内f-1的分析。因此，本发明具有很好的应用前景。
21.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。
22.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
23.图1为nu-1000的扫描电镜结果；
24.图2为(a)nu-1000的红外光谱图；(b)nu-1000的x射线粉末衍射谱图；
25.图3为nu-1000的x射线光电子能谱图；
26.图4为实施例1检测细胞内液中浓度为1mg/ml的f-1(nu-1000浓度为 1mg/ml；激光强度为70％)的结果；
27.图5为nu-1000固体基质与常规有机基质质谱(检测模式为正离子模式， [m+h]
+
为常规有机基质分子离子峰)；
[0028]
图6为hcca、sa和nu-1000固体基质质谱检测地龙小分子肽的比较 (待测样品分别为f-1、f-2、etp、ptp；浓度:1mg/ml；激光强度70％；*表 示f-1的[m+k-h]
+
衍生离子信号)；
[0029]
图7为不同浓度的nu-1000溶液检测1mg/ml的f-1的检测结果；
[0030]
图8为不同点样方法对f-1检测的影响(f-1浓度为1mg/ml)。
具体实施方式
[0031]
以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品。
[0032]
一、试剂和材料
[0033]
nu-1000(自合成)、f-1(cas:652495，98.75％)、f-2(cas:652496，99.25％)、 ptp(cas:652499，99.38％)和etp(cas:652498，98.31％)均购自glbiochem(上海)有限公司。三氟乙酸(99％)购自sigma-aldrich公司；乙腈 (as#75-05-8)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(hcca)和芥酸(sa)购自brook公司；水 为去离子水。
[0034]
二、仪器和测量
[0035]
傅里叶变换红外光谱仪(bruker vertex 70&alpha)用于对 nu-1000的化学成分进行表征；x射线衍射(xrd，ultima iv)用于表征 nu-1000的结构，测试条件：铜靶，固定靶x射线光源：额定输出功率：3 kw；扫描速度：10
°
/min；测试范围：大于3-159
°
；透射电子显微镜(tem， tecnai g2 f20 s-twin tmp场发射透射电镜；能谱型号：gatangifquantum 963)用于表征nu-1000的形态与尺寸；x射线光电子能谱技术(xps， thermoscientific k-alpha)用于分析nu-1000中结构和原子价态方面的信息； uv-1800型紫外-可见分光光度计(岛津公司，日本)；vortex ql-861型漩 涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国)；kq-300de型超声 波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，中国)；万分之一天平(mettlertoledo，瑞士)；autoflex speed基质辅助激光解析/电离时间分辨质谱(布 鲁克道尔顿，德国)，仪器参数：激光光源为smartbeam-ii激光器，激光波 长为355nm，频率为500hz。
[0036]
实施例1地龙小分子肽f-1的saldi-ms检测方法
[0037]
一、nu-1000合成：
[0038]
按照文献(inorganic chemistry,2017,56(22):14178-14188)的方法合成。 具体步骤为：将70.00mg zrcl4(0.30mmol)，2.7g(22mmol)苯甲酸，8mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)混合，超声溶解。将澄清溶液在80℃的烘箱中温 育1h，向该溶液中加入40.00mg(0.06mmol)1,3,6,8-四(对苯甲酸)芘，并 将混合物超声处理20min。将黄色悬浮液在120℃的烘箱中加热72h。通过 过滤分离黄色物质，然后在甲醇中利用索氏提取器提取过夜，并在80℃下 真空干燥过夜，得到合成后的样品(表示为nu-1000b)。将nu-1000b(400 mg)浸泡在120ml dmf中，然后加入3.3ml浓hcl，将样品放在烘箱中于 100℃下加热24h。待温度降至室温后，将样品混合物进行过滤，并利用索氏 提取器在甲醇中萃取固体过夜。然后将固体在80℃下真空干燥，得到活性 nu-1000样品(为方便起见，表示为nu-1000)。
[0039]
nu-1000的扫描电镜图像(图1)显示其形态为微米级棒状颗粒，颗粒大小 均匀，单分散性优异。
[0040]
xrd图谱(图2右)显示nu-1000在小角度范围内的主要衍射峰与报道一 致(sudip,yuling,yao,xin,&yang,2020；zhao et al.,2020)，说明nu-1000制 备成功。nu-1000的红外光谱如图2左所示。3442cm-1对应于o-h伸缩振 动，1701cm-1对应于-cooh的c＝o伸缩振动，1603cm-1，1416cm-1对应 于-coo-的反对称伸缩振动和对称伸缩振动c＝o，1544cm-1对应于c＝c伸 缩振动，719cm-1，658cm-1对应苯环中c-h弯曲振动，460cm-1对应zr-o 振动。活化nu-1000中的官能团主要为-coo-，苯环，c＝c，zr-o，这几类 化学键在红外光谱中均有出现。从图3(a)中nu-1000的全光谱可以看出，合 成的nu-1000含有c、o、zr元素，符合nu-1000的结构。根据图3(b)中 zr元素的详细图解，可以得出zr3d3和zr3d5的结合能分别为185.32ev和 182.92ev，与xps数据手册和xps数据网站的信息一致。
[0041]
nu-1000制备完成后配制成基质溶液，具体步骤为：nu-1000称取5.00 mg，溶解在1ml纯水中，并将以上基质溶液超声处理10分钟。其他浓度 的基质溶液通过逐级稀释获得。
[0042]
二、细胞实验
[0043]
将在hepg2细胞生长状态极佳融合时，弃去旧培养液，以pbs液冲洗 细胞2次，用25％胰酶于室温条件下消化细胞，2min后，加入等体积的培 养基终止消化。轻轻吹打细胞，吸取出细胞悬液至离心管中，离心4min(800 r
·
min-1
)。弃上清液，加入2ml培养基吹打混匀，并进行细胞计数。hepg2 细胞接种于24孔板中，细胞密度为2
×
105个/ml，置培养箱孵育过夜。实验 分为空白对照组与给药处理组。待细胞完全贴壁后弃掉旧培养基，给药处理 组分为4小组，分别用含地龙小分子肽f-1 50μg/ml的培养液处理0、4、12、 24h。空白对照组加入相同浓度配药所用的甲醇和培养基。然后各实验组均 于37℃、5％co2饱和温度培养孵育。细胞内液中f-1的处理：去掉培养液 后，细胞用pbs清洗3次，25％胰酶消化后，离心10min(9000r
·
min-1
)去 掉上清液，加入100μl pbs混匀后，利用细胞破碎机以裂解细胞。离心10min (9000r
·
min-1
)，收集上清液即为细胞内液，取上清液进行分析。
[0044]
三、saldi-ms检测
[0045]
以上述第二部分得到的上清液作为待测样品溶液，将待测样品溶液和 nu-1000溶液点样至靶板上，得到样品点；采用saldi-ms对得到的样品点 进行分析，得到待测样品中地龙小分子肽f-1的检测结果。
[0046]
本实施例中点样采用分层点样法：首先将1μl的基质溶液滴在靶板 上，之后在室温下干燥，然后再将1μl的待测样品溶液滴在基质上面， 再一次进行室温下干燥。
[0047]
其中，所述基质溶液(nu-1000)溶液的浓度为1mg/ml的检测结果如 图4所示。可以看到，本实施例的检测结果中，检测杂峰少，f-1的峰强度 高，可见本实施例实现了细胞内液中f-1的高特异性、高灵敏度的检测。
[0048]
下面通过实验对本发明的技术方案作进一步说明。
[0049]
实验例1nu-1000在saldi-ms中的信号
[0050]
本实验例将nu-1000和现有的传统基质(hcca和sa)进行对比。
[0051]
一、实验方法
[0052]
基质溶液的配制：hcca和sa各称取10.00mg，分别溶解在1ml的 at50(0.1％tfa水溶液和乙腈1：1混合)中；nu-1000称取5.00mg，溶 解在1ml纯水中，并将以上基质溶液超声
处理10分钟。
[0053]
点样方法：将1μl的基质溶液滴在靶板上，之后在室温下干燥。
[0054]
二、实验结果
[0055]
利用saldi-ms检测三种基质，结果如图5所示。传统基质hcca和 sa由于它们自身在激光轰击下的离解，在低质荷比范围内产生许多背景信 号峰。但当nu-1000作为固体基质时，在低质量电荷比范围内并无观察到自 身信号，在小分子化合物检测中可以有效避免背景干扰。本实验结果表明， nu-1000可用于saldi基质中低分子量化合物的分析。
[0056]
实验例2基质与小分子组合的saldi-ms检测结果
[0057]
本实验例考察了不同基质与小分子组合的saldi-ms检测结果。
[0058]
一、实验方法
[0059]
标准溶液的配制：准确称量1.00mg的地龙小分子肽(f-1、f-2、etp 或ptp)粉末，用70％的乙腈和30％的水溶液配制成1.00mg/ml，其他浓 度溶液通过对原液进行逐级稀释得到。配置好的标准品溶液保存在-20℃条 件下备用。
[0060]
基质溶液的配制：hcca和sa各称取10.00mg，分别溶解在1ml的 at50(0.1％tfa水溶液和乙腈1：1混合)中；nu-1000称取5.00mg，溶 解在1ml纯水中，并将以上基质溶液超声处理10分钟。其他浓度的基质 溶液通过逐级稀释获得。
[0061]
检测方法与实施例1相同。
[0062]
二、实验结果
[0063]
使用4种不同的地龙小分子肽作为分子量低于700da的目标分析物，进 一步评估了nu-1000用于saldi-ms的效率和可行性。如图6所示，在样品 浓度为1mg/ml的条件下，利用传统基质hcca和sa分别与mof材料 nu-1000作为基质对四种地龙小分子肽f-1、f-2、ptp、etp进行了对比检 测分析，考察了四种地龙小分子肽在反射正离子模式下的检测效果。实验结 果显示，使用nu-1000作为新的基质背景清晰，无自身的干扰峰出现。与 hcca相比，nu-1000能够增强f-1信号值，并且在m/z 574.014成功检测 到f-1的[m+k-h]
+
衍生离子信号(*表示)；而对于f-2、etp、ptp小分 子肽，三种基质均无法检测到其相关离子峰。
[0064]
通过本实验例可证明nu-1000对f-1的检测具有较强的增敏效果。
[0065]
实验例3检测条件的优化
[0066]
本实验例对基质溶液的浓度进行优选。
[0067]
一、实验方法
[0068]
标准溶液的配制：准确称量1.00mg的地龙小分子肽(f-1)粉末，用70％ 的乙腈和30％的水溶液配制成1.00mg/ml。配置好的标准品溶液保存在
ꢀ‑
20℃条件下备用。
[0069]
本实验例以上述配制的标准溶液作为待测样品溶液，基质溶液的浓度在 0.025-4mg/ml的范围内选取，其他操作步骤与实施例1相同。
[0070]
二、实验结果
[0071]
如图7所示，当nu-1000的浓度为0.5mg/ml时，观察到最强的离子峰。 进一步升高或降低基质溶液的浓度均会导致峰强度降低。
[0072]
因此，基质溶液的最佳浓度为0.5mg/ml。
[0073]
实验例4点样方法优选
[0074]
本实验例对点样的方法进行优选。
[0075]
一、实验方法
[0076]
本实验例对比两种点样方法对检测结果的影响，两种点样方法如下：
[0077]
分层点样法：首先将1μl的基质溶液滴在靶板上，之后在室温下干燥， 然后再将1μl的待测样品溶液滴在基质上面，再一次进行室温下干燥。
[0078]
混合点样法：将1μl的基质溶液与1μl的待测样品溶液混合后点在靶 板上。
[0079]
其他操作步骤与实施例1相同。
[0080]
二、实验结果
[0081]
如图8所示，对于混合点样法(信噪比＝375.8)，检测到574m/z的低f-1 信号，而当使用分层点样法(信噪比＝2667.9)时，几乎实现了7.1倍的增强。
[0082]
因此，在本发明的检测方法中，分层点样法是更佳的点样方法。
[0083]
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明通过基质和检测条件的优选， 实现了地龙小分子肽f-1的表面辅助激光解吸电离质谱检测。本发明的检测 方法具有无干扰背景、高灵敏度和选择性的优点，具有很好的应用前景。