一种淫羊藿中黄酮类化合物的紫外分光测定方法与流程

1.本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种淫羊藿中黄酮类化合物的紫外分光测定方法。


背景技术：

2.淫羊藿(学名:epimedium brevicornu maxim.)多年生草本植物，植株高20-60厘米，根状茎粗短，暗棕褐色，二回三出复叶基生和茎生，具长柄，小叶纸质或厚纸质，叶缘具刺齿，花白色或淡黄色，花期5-6月，果期6-8月。
3.淫羊藿味辛甘性温，走肝肾二经。为补命门、益精气、强筋骨、补肾壮阳之要药，临床常用于治疗男子阳痿不举、滑精早泄、小便不禁以及女子不孕等症。
4.现代研究证明，淫羊藿总黄酮为淫羊藿主要有效成分。除其传统用法补肾壮阳祛风湿之外，临床上，淫羊藿还常用于治疗骨质疏松、更年期综合症、乳房肿块、高血压、冠心病等疾病，另外淫羊藿尚具有免疫增强、抗衰老、抗艾滋病等作用，最新研究表明淫羊藿苷对前内腺癌细胞有抑制作用，因而具有巨大的研究和开发潜力。淫羊藿苷并非是其唯一活性成分，淫羊藿总黄酮含量常作为评价淫羊藿质量和提取分离工艺的指标。现有的检测方法主要为紫外分光光度在270nm处，采用自身对照品的方法进行检测，但是采用自身对照品对照一个是价格高昂，不利用市场化检测；二来是对照品一旦买不好，就容易出现检测误差，因而找到一种合适的快速检测淫羊藿含量的方法极为重要。


技术实现要素：

5.为此，本发明提供一种淫羊藿中黄酮类化合物的紫外分光测定方法，以解决现有检测价格高，误差大等问题。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.根据本发明提供的一种淫羊藿中黄酮类化合物的紫外分光测定方法，其所述方法为亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法或三氯化铝分光光度法。
8.进一步的，所述亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法包括芦丁对照液的配制、供试品溶液的制备、检测液的配制、吸收波长的确定和检测。
9.进一步的，所述亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法还包括稳定性实验、回收率实验和重现性实验。
10.进一步的，所述芦丁对照液的配制为准确称取干燥并恒重的芦丁标准品，用乙醇溶解并定容，摇匀得浓度为0.1000g/l标准溶液；
11.和/或，所述供试品溶液的制备为取干燥的淫羊藿叶粗粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇，密塞，称定质量，超声处理，摇匀，滤过，取滤液置量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
12.和/或，所述检测液的配制为将取供试品溶液，加入乙醇，加入5％(w/v)亚硝酸钠摇匀，静置后加入10％(w/v)硝酸铝，静置后加后再加入1mol/l氢氧化钠，混匀，用乙醇稀
释，静置；
13.和/或，所述吸收波长的确定方法为准确吸取芦丁标准溶液，加入乙醇，加入5％(w/v)亚硝酸钠摇匀，静置后加入10％(w/v)硝酸铝，静置加后再加入1mol/l氢氧化钠，混匀，用醇稀释至刻度静置后测定其吸光度值，参比为空白试剂；选取从300nm至600nm，每1nm测定一次，确定检测波长。
14.进一步的，所述乙醇采用30％浓度的乙醇水溶液。
15.进一步的，所述三氯化铝分光光度法包括待测液的配制、吸收波长的确定和检测。
16.进一步的，所述三氯化铝分光光度法还包括稳定性实验、回收率实验和重现性实验。
17.进一步的，所述待测液的配制的方法为准确吸取所要测得溶液中，加入1.5％alcl3和醋酸-醋酸钠的缓冲液，并用乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置。
18.和/或，所述吸收波长的确定方法为准确称取干燥并恒重的芦丁标准品，用乙醇溶解并定容，摇匀得浓度为0.1000g/l标准溶液；准确吸取所述芦丁标准溶液，加入1.5％alcl3和醋酸-醋酸钠的缓冲液，并用乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置选取从200nm至800nm，每nm测定一次，确定检测波长。
19.进一步的，所述醋酸-醋酸钠的缓冲液的ph为5.5。
20.进一步的，所述乙醇水溶液中乙醇的浓度为30％。
21.本实验分析的黄酮类物质，其显色波长都相差不远，所以可以认为是对单一组分进行分析测定，而单组分的测定常用标准曲线法。标准曲线法的制作是配制一系列不同浓度的标准溶液，在选定波长下，分别测定其吸光度，绘制a一c曲线(即吸光度一浓度曲线)。未知试样和标准试样要在相同的操作条件进行测定，可以从工作曲线求出未知样品的含量。也可以利用标准试样所得的数据来进行方程回归，然后根据方程来求出未知物的浓度。
22.本发明具有如下优点：
23.本发明的检测方法采用紫外分光光度法直接测定淫羊藿中总黄酮的含量，不需特殊设备，具有操作简单、快速和重现性较好等特点，可用于快速分析鉴定。
24.本发明是采用芦丁作为对照品，在两种检测方法中，芦丁浓度在4-20mg/l的范围内具有良好的线性关系，nano
2-al(no3)
3-naoh体系分光光度法平均回收率为101.0％，alcl3分光光度法平均回收率为100.5％。两种方法操作简便，结果准确，精密性好，均可用于淫羊藿中总黄酮含量的检测。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
26.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
27.图1为本发明实施例1提供的亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法芦丁紫外扫描波图；
28.图2为本发明实施例1提供的硝酸钠-硝酸铝分光光度法芦丁标准曲线；
29.图3为本发明实施例2提供的三氯化铝分光光度法芦丁紫外扫描波图；
30.图4为本发明实施例2提供的三氯化铝分光光度法芦丁标准曲线。
具体实施方式
31.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.淫羊藿粗粉，98％芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)
33.超声波清洗机(上海branson公司)，
34.瑞士startorius精密电子天平，1-20freeze dryer(德国)，
35.uv-2550型紫外分光光度计，
36.循环水式多用真空泵(河南巩义英峪予华仪器厂)
37.实施例1亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法
38.1.芦丁标准溶液配制
39.准确称取干燥并恒重的芦丁标准品0.0500g，用30％乙醇溶解并定容于500ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.1000g/l标准溶液，避光备用。
40.2.供试品溶液的制备
41.取干燥的淫羊藿叶粗粉约10g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入60％乙醇200ml，密塞，称定质量，超声处理1h，摇匀，滤过，取滤液置500ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
42.3.比色
43.将所要检测的试剂取于10ml容量瓶，用30％乙醇补至约5ml，加入0.3ml5％(w/v)亚硝酸钠摇匀，放置6min后加入0.3ml10％(w/v)硝酸铝，6min加后再加入4ml的1mol/l氢氧化钠，混匀，用30％乙醇稀释至刻度15min后测定其吸光度值，参比为空白试剂，进行比色。
44.4.芦丁标准溶液最佳吸收波长的测定
45.准确吸取芦丁标准溶液1ml于10ml容量瓶中，用30％乙醇补至5ml.加入0.3ml5％(w/v)亚硝酸钠摇匀，放置6min后加入0.3ml10％(w/v)硝酸铝，6min加后再加入4ml1 mol/l氢氧化钠，混匀，用30％乙醇稀释至刻度15min后测定其吸光度值，参比为空白试剂。选取从300nm至600nm，每1nm测定一次，以波长—吸光度值作图，见图1所示，从图1中可以看出，芦丁标准溶液紫外的最佳吸收波长入为510nm。
46.5.线性关系的考察
47.分别取上述芦丁标准溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.o ml、5.0ml于5只10ml容量瓶中，用30％乙醇补充至约5ml，加入0.3ml5％亚硝酸钠，摇匀，静置6min0.3ml10％硝酸铝，摇匀，静置6min，再加入1mol/l氢氧化钠溶混匀，用30％乙醇稀释至刻度，15min后510nm处测吸光度，试剂为空白参比。吸光度值一芦丁浓度表见表1；以芦丁一浓度c为纵坐标，吸收度a为横坐标，进行线性回归，得回归方程为，算出r值。以吸收波长(nm)-吸光值用最小二乘法
作线性回归，得芦丁浓度c与吸光度a的标准曲线回归方程式:回归方程y＝34.599x+0.2364，r2＝0.9999，结果表明芦丁在4-20mg/l范围内线性关系良好，线形关系图见图2。
48.表1吸光度值一芦丁浓度表
[0049][0050]
6.精密度的考察
[0051]
取供试品溶液1ml和已配好的芦丁标准溶液3ml加入10ml容量瓶，以乙醇为空白，照亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法，在510nm处测定吸收值。重复测定5次，计算平均值及相对标准偏差。
[0052]
测出5次芦丁标准液和供试剂的吸光值如表2，算出rsd值分别为0.51％和0.80％都少于3％，说明该方法精密度良好。
[0053]
表2精密度试验结果
[0054][0055]
7.稳定性的考察
[0056]
取制备好的供试品溶液1ml和3ml，已配好的芦丁标准溶液3ml加入10ml容量瓶，以乙醇为空白，照亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法，分别于0h，0.15h，0.30h，0.45h，1.0h测定5次，测定吸收度a，如rsd《2％，则表明供试品溶液在1小时内稳定在510nm处测定吸收值。
[0057]
标准溶液和供试品分别于0h，0.15h，0.30h，0.45h，1.0h测定5次的a值，制的表3，算出rsd值分别为0.29％和0.57％，均小于2％，说明该试验方法在一小时内稳定性良好。
[0058]
表3稳定性试验结果
[0059][0060]
8.回收率试验的考察
[0061]
精密称取淫羊蕾药材粗粉3份，，分别加入适量芦丁对照溶液适量，按上述淫羊藿供试液的制备方法，制备加样回收溶液并用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法测定吸收度。
[0062]
测得淫羊藿苷的质量制的表4，试验结果表明，淫羊藿黄酮回收率在95％与100％之间，表明加样回收良好。
[0063]
表4回收率试验结果
[0064][0065]
9.重现性试验
[0066]
取同一批淫羊藿样品5份，分别按供试品溶液制备项下的方法制备供试品溶液亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法测定含量，算出rsd值。
[0067]
5份淫羊藿样品测得结果制的表5，算出rsd值为2.0％，符合要求。
[0068]
表5重现性试验结果
[0069][0070]
实施例2三氯化铝分光光度法
[0071]
1.芦丁标准溶液配制
[0072]
准确称取干燥并恒重的芦丁标准品0.0500g，用30％乙醇溶解并定容于500ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.1000g/l标准溶液，避光备用。
[0073]
2.比色
[0074]
准确吸取所要测得溶液于25ml容量瓶中，加入1.5％alcl38 ml和醋酸-醋酸钠的缓冲液(ph5.5)4ml，并用30％乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5h，在最大吸收波长下进行比色。
[0075]
3.芦丁标准溶液最佳吸收波长的测定
[0076]
准确吸取制好的芦丁标准溶液1ml于25ml容量瓶中，加入1.5％alcl38ml和醋酸-醋酸钠的缓冲液(ph5.5)4ml，并用30％乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5h。选取从200nm至800nm，每nm测定一次，以波长—吸光度值作图。以吸收波长(nm)一一吸光值作图(见图3)；从图3中可以看出，芦丁标准溶液的最佳吸收波长入为415nm。
[0077]
4.线性关系的考察
[0078]
分别取上述芦丁标准溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml于5只25ml容量瓶中，用30％乙醇补充至约12.5ml，加入1.5％alcl3 8ml和醋酸-醋酸钠的缓冲液(ph5.5)4ml，并用30％乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5h。3.2.2方法测定的波长下测试，以显色液中芦丁的质量(mg)为横坐标，用最小二乘法进行回归，做出线性方程，算出r值，考察曲线。
[0079]
以吸收波长(nm)一一吸光值作表6；
[0080]
表6吸光度值一芦丁浓度表
[0081][0082]
用最小二乘法作线性回归，得芦丁浓度c与吸光度a的标准曲线回归方程式:
[0083]
回归方程c＝32.91a-0.39r＝0.9997,结果表明芦丁在4一20mg/l范围内线性关系良好。由上表，线形关系图见图4。
[0084]
5.精密度的考察
[0085]
取供试品溶液1ml和已配好的芦丁标准溶液3ml加入25ml容量瓶，以乙醇为空白，照三氯化铝分光光度法测定吸收值。重复测定5次，计算平均值及相对标准偏差。
[0086]
测出5次芦丁标准液和供试剂的吸光值如表7，算出rsd值分别为0.45％和0.88％都少于3％，说明该方法精密度良好。
[0087]
表7精密度试验结果
[0088][0089]
6.稳定性的考察
[0090]
取供试品溶液1ml和3ml已配好的芦丁标准溶液加入25ml容量瓶，以乙醇为空白，照三氯化铝分光光度法，分别于0h，0.15h，0.30h，0.45h，1.0h测定5次，测定吸收度a。
[0091]
标准溶液和供试品分别于0h，0.15h，0.30h，0.45h，1.0h测定5次的a值制的表8算出rsd值分别为0.45％和0.62％，均小于2％，说明该试验方法在一小时内稳定性良好。
[0092]
表8稳定性试验结果
[0093][0094]
7.回收率试验的考察
[0095]
精密称取淫羊蕾药材粗粉3份，分别加入芦丁对照溶液适量，按上述淫羊蕾供试液的制备方法，制备加样回收溶液并用三氯化铝法测定吸收度，算出rsd值。
[0096]
测得淫羊藿苷的质量制的表9，试验结果表明，淫羊藿黄酮回收率在95％与100％之间，表明加样回收良好。
[0097]
表9回收率试验结果
[0098][0099]
8.重现性试验的考察
[0100]
取同一批淫羊藿样品5份,分别按供试品溶液制备项下的方法制备供试品溶液并用三氯化铝法测定含量百分比算出rsd值。
[0101]
5份淫羊藿样品测得结果制的表10，算出rsd值为1.04％，符合要求。
[0102]
表10重现性试验结果
[0103][0104]
从实施例1和实施例2结果可知，以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定其总黄酮含量，通过谱图可知nano
2-al(no3)
3-naoh体系分光光度法的最佳波长为510nm，alcl3分光光度法最佳波长为415nm。
[0105]
本专利采用芦丁用实验中两种方法在4-20mg/l的范围内具有良好的线性关系，nano
2-al(no3)
3-naoh体系分光光度法平均回收率为101.0％，alcl3分光光度法平均回收率为100.5％。两种方法操作简便，结果准确，精密性好，可用于淫羊藿中总黄酮含量的检测。
[0106]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。