乳腺癌相关的生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体而言，本发明涉及一种乳腺癌的自身抗体生物标志物、检测其的抗原组合以及相应地它们在乳腺癌检测中的应用。

背景技术：

1、全球范围内，乳腺癌已成为女性癌症相关死亡的主要原因，在女性中乳腺癌的发病率和死亡率远远超过其他癌症。在中国，50岁以上的女性是患乳腺癌的高发人群，该年龄段的乳腺癌死亡人数占所有年龄段的80％以上。其中，三阴性乳腺癌(triple negativebreast cancer，tnbc)是乳腺癌的一种亚型，其特征是雌激素受体(estrogen receptor，er)、孕激素受体(progesterone receptor，pr)和人表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor 2，her2)在肿瘤组织中缺乏表达。这种乳腺癌被认为是恶性程度最高的乳腺癌类型之一，占所有乳腺癌的12-20％，由于其耐药性强、复发率高、转移性强以及缺乏靶向治疗而具有更高致死风险。

2、针对乳腺癌、特别是三阴性乳腺癌，当前最迫切的需求是提高尽早发现其存在的检测能力，以此减低这种疾病对人类的威胁，提升患者的生存率和生存质量。

3、传统上采用影像学筛查技术对乳腺癌进行检测，例如乳房x线照相、超声检查、乳腺mri检查。但是，这些影像学筛查技术的检测结果与医师的经验与技术质量有关，且存在分辨率低、特异性和敏感性无法保证等缺陷，因此需要开发更准确、操作简单、风险低且非侵入性的技术手段来补充或替代。此外，已经提出了检测肿瘤抗原标志物来进行乳腺癌的筛查，如人表皮生长因子受体2(her2)抗原和糖类抗原15-3(ca15-3)；但是，难以证明这些标志物具有乳腺癌特异性，且易受肿瘤负荷影响，在早期筛查中价值有限。此外，还提出了可检测基因标志物例如brca1和brca2或者检测细胞外的循环dna(cell-free dna，cfdna)或微小rna(micrornas，mirnas)，但是同样存在对降低乳腺癌死亡率并无帮助或方法不成熟等缺陷。

4、自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。在癌症发生早期，肿瘤相关抗原的暴露即可被人体免疫系统识别，产生肿瘤相关自身抗体，甚至在外周血中也可维持高水平的自身抗体，可被本领域常规技术手段灵敏地检测到。本领域公认，肿瘤抗原产生的自身抗体是肿瘤早期诊断的较好指标，利用肿瘤诱导产生的自身抗体来反应患者肿瘤发生机疾病进展过程，正成为寻找用于肿瘤早期诊断及预后判断新靶标的重要方向。

5、已有研究提出将单个自身抗体检测或若干种自身抗体的组合检测用于乳腺癌筛查中。例如p53自身抗体、muc1自身抗体、hsp60自身抗体、hsp90自身抗体、her2自身抗体等的单独检测以及几种自身抗体指标的联测检测，证明具有一定的敏感性和特异性。

6、但是，实验证明，目前已经提出的自身抗体组合检测乳腺癌、尤其是早期乳腺癌仍存在敏感性不够高等缺点，仍有必要发现新的生物标志物，如乳腺癌特异性抗原相关的自身抗体组合，用于乳腺癌早期筛查和辅助早期诊断。并且，也需要提供新能更特异地筛查三阴性乳腺癌的新型自身抗体组合。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明通过检测乳腺癌患者血液中针对不同抗原靶点的自身抗体，最终鉴定了一组可用于筛查乳腺癌、尤其是早期筛查的自身抗体。该自身抗体组合作为生物标志物，在特别是早期肿瘤检测中有足够高的敏感性，尤其是在实验的中国人群中；同时还具有足够高的检测特异性。

2、因此，本发明的一个目的是提供一种乳腺癌的生物标志物，其为自身抗体组合。

3、基于该自身抗体组合作为生物标志物，本发明的另一个目的是提供用于检测该自身抗体组合的试剂，例如抗原蛋白组合；以及提供该自身抗体组合或检测试剂在制备用于乳腺癌的患病风险预测、筛查、预后评估、治疗效果监测或复发监测等产品中的用途。

4、本发明的再一个目的是提供试剂盒以及相应地用于乳腺癌的患病风险预测、筛查、预后评估、治疗效果监测或复发监测等的方法。

5、本发明的技术方案如下。

6、一方面，本发明提供一种乳腺癌的生物标志物，所述生物标志物为自身抗体组合，其包括分别抗以下肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，taa)的自身抗体(tumorassociated autoantibody，taab)中的至少三个：parp1、trim21、p53、brca2、annexin 11、atad2、ny-eso-1和cage。

7、在本发明的上下文中，“肿瘤相关抗原”在uniprot数据库的登记号如下：

8、parp1：p09874

9、trim21：p19474

10、p53：p04637

11、brca2：p51587

12、annexin 11：p50995

13、atad2：q6pl18

14、ny-eso-1：p78358

15、cage：q8tc20

16、优选地，所述自身抗体组合包括分别抗以下肿瘤相关抗原的自身抗体：parp1、trim21和cage。

17、更优选地，所述自身抗体组合还包括分别抗以下肿瘤相关抗原的自身抗体中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个：p53、brca2、annexin 11、atad2和ny-eso-1。其中，所述自身抗体组合优选地包括抗以下肿瘤相关抗原的自身抗体中的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个：annexin 11、atad2、ny-eso-1和p53。

18、根据本发明的具体实施方式，所述自身抗体组合包括分别抗以下肿瘤相关抗原的自身抗体：

19、(1)parp1、trim21、cage；

20、(2)parp1、trim21、cage、p53；

21、(3)parp1、trim21、cage、annexin 11；

22、(4)parp1、trim21、cage、atad2；

23、(5)parp1、trim21、cage、ny-eso-1；

24、(6)parp1、trim21、cage、brca2；

25、(7)parp1、trim21、cage、annexin 11、atad2；

26、(8)parp1、trim21、cage、annexin 11、ny-eso-1；

27、(9)parp1、trim21、cage、annexin 11、p53；

28、(10)parp1、trim21、cage、atad2、ny-eso-1；

29、(11)parp1、trim21、cage、atad2、p53；

30、(12)parp1、trim21、cage、ny-eso-1、p53；

31、(13)parp1、trim21、cage、annexin 11、atad2、ny-eso-1；

32、(14)parp1、trim21、cage、annexin 11、ny-eso-1、p53；

33、(15)parp1、trim21、cage、atad2、ny-eso-1、p53；

34、(16)parp1、trim21、p53、brca2、annexin 11、atad2、ny-eso-1、cage。

35、根据本发明，所述自身抗体为受试者的样本例如全血、血清、血浆、组织或细胞、组织间隙液、脑脊液或尿液中的自身抗体；其中优选地，所述组织或细胞为乳腺组织或细胞、乳腺癌组织或细胞或者乳腺癌的癌旁组织或细胞。

36、优选地，所述受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。

37、优选地，所述自身抗体为iga(例如iga1、iga2)、igm或igg(例如igg1、igg2、igg3、igg4)。

38、优选地，所述乳腺癌包括导管原位癌和浸润性乳腺癌；其中所述浸润性乳腺癌包括浸润性导管癌、浸润性微乳头状癌、浸润性小叶癌和粘液分泌癌。根据tnm分期，所述乳腺癌为i期或ii期乳腺癌。

39、优选地，所述乳腺癌包括三阴性和非三阴性乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌。

40、根据本发明，该生物标志物即自身抗体组合可以在受试者的样本(例如血浆或血清)中进行检测。在本发明中，自身抗体的“存在”或“不存在”与“阳性”或“阴性”可互换使用；对此进行判断为本领域常规技术。例如，可以通过导致该组合中任何自身抗体出现的肿瘤相关抗原与其之间的抗原抗体特异性反应进行检测。因此相应地，另一方面，本发明还提供一种用于检测本发明的生物标志物的试剂。

41、取决于具体技术手段，所述试剂可以是用于酶联免疫吸附法(elisa)、蛋白/肽段芯片检测、免疫印迹、微珠免疫检测或微流控免疫检测等的试剂。优选地，所述试剂用于通过抗原抗体反应对本发明的生物标志物进行检测，例如通过elisa或荧光或化学发光免疫检测。

42、在这一方面，所述试剂可以是抗原蛋白组合，其包括选自以下肿瘤相关抗原中的至少三个：parp1、trim21、p53、brca2、annexin 11、atad2、ny-eso-1和cage。

43、优选地，所述抗原蛋白组合包括以下肿瘤相关抗原：parp1、trim21和cage。

44、更优选地，所述抗原蛋白组合还包括以下肿瘤相关抗原中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个：p53、brca2、annexin 11、atad2和ny-eso-1。其中，所述抗原蛋白组合优选地包括以下肿瘤相关抗原中的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个：annexin 11、atad2、ny-eso-1和p53。

45、进一步优选地，所述抗原蛋白组合包括以下肿瘤相关抗原：

46、(1)parp1、trim21、cage；

47、(2)parp1、trim21、cage、p53；

48、(3)parp1、trim21、cage、annexin 11；

49、(4)parp1、trim21、cage、atad2；

50、(5)parp1、trim21、cage、ny-eso-1；

51、(6)parp1、trim21、cage、brca2；

52、(7)parp1、trim21、cage、annexin 11、atad2；

53、(8)parp1、trim21、cage、annexin 11、ny-eso-1；

54、(9)parp1、trim21、cage、annexin 11、p53；

55、(10)parp1、trim21、cage、atad2、ny-eso-1；

56、(11)parp1、trim21、cage、atad2、p53；

57、(12)parp1、trim21、cage、ny-eso-1、p53；

58、(13)parp1、trim21、cage、annexin 11、atad2、ny-eso-1；

59、(14)parp1、trim21、cage、annexin 11、ny-eso-1、p53；

60、(15)parp1、trim21、cage、atad2、ny-eso-1、p53；

61、(16)parp1、trim21、p53、brca2、annexin 11、atad2、ny-eso-1、cage。

62、再一方面，本发明提供所述生物标志物或试剂在制备用于乳腺癌的患病风险预测、筛查、预后评估、治疗效果监测或复发监测的产品中的用途。

63、优选地，所述乳腺癌包括导管原位癌和浸润性乳腺癌；其中所述浸润性乳腺癌包括浸润性导管癌、浸润性微乳头状癌、浸润性小叶癌和粘液分泌癌。根据tnm分期，所述乳腺癌为i期或ii期乳腺癌。

64、优选地，所述乳腺癌包括三阴性和非三阴性乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌。

65、优选地，所述产品为试剂盒；更优选地，所述试剂盒是用于酶联免疫吸附法(elisa)、蛋白/肽段芯片检测、免疫印迹、微珠免疫检测或微流控免疫检测的试剂盒；优选地，所述试剂盒用于通过抗原抗体反应对所述生物标志物进行检测，例如为elisa试剂盒或荧光或化学发光免疫检测试剂盒。

66、又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的试剂。

67、取决于具体技术手段，所述试剂盒可以是用于酶联免疫吸附法(elisa)、蛋白/肽段芯片检测、免疫印迹、微珠免疫检测或微流控免疫检测等的试剂盒。优选地，所述试剂盒用于通过抗原抗体反应对本发明的生物标志物进行检测，例如为elisa试剂盒或荧光或化学发光免疫检测试剂盒。

68、因此，优选地，试剂盒为酶联免疫吸附法(elisa)检测试剂盒。即，采用该试剂盒，通过酶联免疫吸附法来检测受试者的样本中自身抗体生物标志物是否是阳性的。相应地，所述试剂盒还可包括用于对自身抗体生物标志物进行elisa检测的所需其他组分，这些均是本领域公知的。出于检测目的，例如，试剂盒中的抗原蛋白可连接有标签肽，例如his标签、链霉亲和素标签、myc标签；又如，该试剂盒可以包括固相载体，如具有可固定抗原蛋白的微孔的载体，如酶标板；或者微珠或磁珠固相载体。还可以包括用于将抗原蛋白固定于固相载体上的吸附蛋白、血液如血清的稀释液、洗涤液、带有酶标记的二抗或者荧光或化学发光的物质的二抗、显色液、终止液等。通过间接或直接包被在固相载体表面的抗原蛋白，和血清/血浆/组织液等中的抗体进行反应形成抗原－抗体复合物的原理来检测体液中的相应抗体的浓度。

69、还一方面，本发明提供一种乳腺癌的患病风险预测、筛查、预后评估、治疗效果监测或复发监测的方法，其包括以下步骤：

70、(1)对来自受试者的样本进行本发明提供的自身抗体组合中的每个自身抗体的定量；

71、(2)将所述自身抗体的量与参考阈值进行比较，在其高于参考阈值时，确定所述受试者具有乳腺癌患病风险、患有乳腺癌、预后不良、乳腺癌治疗效果差或具有复发风险。

72、在步骤(1)中，所述定量包括采用本发明提供的试剂(即抗原蛋白组合)或包含该试剂的试剂盒对所述自身抗体组合中的每个自身抗体进行检测。

73、根据本发明，所述受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。

74、优选地，所述乳腺癌包括导管原位癌和浸润性乳腺癌；其中所述浸润性乳腺癌包括浸润性导管癌、浸润性微乳头状癌、浸润性小叶癌和粘液分泌癌。根据tnm分期，所述乳腺癌为i期或ii期乳腺癌。

75、优选地，所述乳腺癌包括三阴性和非三阴性乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌。

76、根据本发明，所述样本为受试者的样本例如全血、血清、血浆、组织或细胞、组织间隙液、脑脊液或尿液；其中优选地，所述组织或细胞为乳腺组织或细胞、乳腺癌组织或细胞或者乳腺癌的癌旁组织或细胞。

77、在步骤(2)中，所述参考阈值可以是来自健康人或健康人群的参照水平；例如，可以被定义为经身体检查确认未患有癌症的人群的平均值加2个标准偏差。

78、与现有技术相比，本发明提供了一种新型的生物标志物，其为全新的一组肿瘤自身抗体，与乳腺癌、特别是三阴性乳腺癌相关。这些自身抗体均在三阴性乳腺癌具有较高的阳性检出率，且具有单独的阳性贡献率；在组合使用时，本发明的自身抗体组合具有很好的检测敏感性和足够高的检测特异性，在三阴性乳腺癌可达到60％以上的敏感性。

79、并且，本发明提供的生物标志物可以在受试者血清样本中进行检测，用以检测乳腺癌、尤其是三阴性乳腺癌这种恶性程度高的乳腺癌，辅助该疾病的临床诊断。通过血清检测以辅助三阴性乳腺癌的临床诊断，有助于发现早期三阴性乳腺癌患者，延长患者生存周期和提升生活质量，具有广阔的应用前景。