用于检测靶分析物的方法、测定和系统与流程

本文公开了用于检测且监测样品(例如，生物样品或环境样品)中存在的一种或多种靶分析物的系统、测定和方法。本文公开的方法还包括检测方法、样品制备方法、治疗方法和远程医疗服务。还提供了实施该方法的试剂盒和试剂。

背景技术：

1、定量检测生物样品中的分析物(例如传染因子)的测定照常规用于医学中，以诊断或跟踪疾病或损伤的进展或监测健康状况。在历史上，这些测定已在医疗保健或实验室环境中执行。类似地，检测环境样品中的分析物的测定对于行业例如运输和农业具有重要性，并且通常在实验室环境中进行。在这两种情况下，此类测定通常需要多重步骤和专家分析。

2、仍然需要改善此类测试的数量和价值。特别地，仍然需要由外行人在非临床环境(例如家庭、办公室或现场)中简单且经济地执行此类测定。

技术实现思路

1、本文公开了用于检测样品中的至少一种靶分析物的系统、测定(生物传感器)和方法。有利地，本文公开的系统、测定和方法是快速的，并且即使当由相对未经训练的用户例如外行人执行时，也允许可靠的结果。在某些实施方案中，本文公开的系统、测定和方法可以用于使用小样品体积来检测低浓度的至少一种靶分析物。

2、在第一个方面，提供了用于检测加入系统中的样品(例如，生物样品或环境样品)中的至少一种靶分析物的系统，其包括：(i)包含至少一种捕获试剂和至少一种检测试剂的测定，所述检测试剂能够在底物(例如，由用户添加的底物)的存在下，与至少一种靶分析物(如果存在的话)产生可检测复合物；以及(ii)用于检测可检测复合物的检测装置，其中所述检测装置包括包含至少一个电极的基于酶的电流型传感器，其中所述可检测复合物在至少一个电极上方形成或在系统内迁移以变得定位于至少一个电极上方。

3、通过系统提供结果的时间不同。在一个实施方案中，在约30分钟或更短时间、约10分钟或更短时间、约5分钟或更短时间、约2分钟或更短时间、或者约1分钟或更短时间内检测可检测复合物。在一个特定实施方案中，产生结果的时间小于1分钟或更特别地，约30秒、约20秒、约10秒或约1秒。

4、通过系统检测的靶分析物可能不同。在一个实施方案中，靶分析物选自微生物(例如，病毒、细菌、原生动物、真菌或朊病毒)、蛋白质、肽、细胞因子、激素、类固醇、辅因子、小分子(例如，例如，治疗药物或滥用药物)、维生素等等。

5、在一个实施方案中，通过系统检测的靶分析物是病毒蛋白质。

6、在一个特定实施方案中，通过系统检测的靶分析物是冠状病毒例如sars-cov-2或其变体的核衣壳(n)蛋白。

7、在一个特定实施方案中，靶分析物是冠状病毒例如sars-cov-2或其变体的刺突(s)蛋白。

8、在某些实施方案中，系统检测生物样品中的多于一种靶分析物，例如两个或更多个病毒物种。在一些实施方案中，一个或多个病毒物种是密切相关的。在某些实施方案中，系统检测sars-cov-d和流感。

9、系统的检测限(lod)可能不同。在一个实施方案中，系统具有约1mg/ml或更低、约1ng/ml或更低、约1pg/ml或更低、或者约1fg/ml或更低的lod。

10、在一个特定实施方案中，靶分析物是蛋白质或肽，并且系统具有约500pg/ml或更低，更特别地，约200、约150、约100、约75、约50、约25、约10、约5或约1pg/ml或更低的lod。

11、在一个实施方案中，靶分析物是全病毒，例如全冠状病毒。在一个特定实施方案中，全病毒是sars-cov-2或其变体。

12、在一个实施方案中，靶分析物是全病毒，其具有约10000tcid50/ml或更低、约5000tcid50/ml或更低、约1000tcid50/ml或更低、约100tcid50/ml或更低、约50tcid50/ml或更低、约25tcid50/ml或更低、约10tcid50/ml或更低、或者约5tcid50/ml或更低的lod。

13、捕获试剂和检测试剂可能不同。在某些实施方案中，捕获试剂和检测试剂是选自适体、抗体和蛋白质或其组合的结合试剂。

14、检测试剂可以用酶进行标记。可以使用任何合适的酶标记，例如氧化还原酶。在一个实施方案中，酶选自氧化酶、过氧化物酶、氢化酶、过氧化氢酶、脱氢酶或磷酸酶。

15、在一个特定实施方案中，酶标记是碱性磷酸酶，并且添加的底物选自5′-磷酸吡哆醛(plp)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/盐、l-抗坏血酸-2-磷酸酯/盐、对乙酰氨基酚磷酸酯/盐、4-乙酰氨基苯基磷酸酯/盐、二乙醇胺(dea)中的4-氨基苯基磷酸酯/盐、1-氨基-2-丙醇、n-甲基-d-葡糖胺或tris缓冲液。

16、在另一个特定实施方案中，酶标记是葡萄糖磷酸酶并且添加的底物是葡萄糖。

17、在某些实施方案中，系统进一步包含报道试剂。报道试剂可能不同，例如选自适体或抗体。根据该实施方案，报道试剂与检测试剂结合。检测试剂和报道试剂均可以例如用不同的酶标记进行标记，以提供双重检测系统。

18、在某些实施方案中，捕获试剂存在于溶液中，并且任选地在与至少一种靶分析物结合之前由用户添加。

19、在替代实施方案中，捕获试剂直接地或借助于第一结合试剂固定到固体或多孔支持物上，以提供测试位点。根据后一个实施方案，捕获试剂缀合到第二结合试剂，其中所述第二结合试剂与第一结合试剂结合。

20、在一个实施方案中，第一结合试剂选自链霉抗生物素蛋白、金、银、malamides、丙烯酸酯、胺、羧酸、乙烯基砜、硫醇、硅烷和环氧化物。

21、在一个特定实施方案中，第一结合试剂是链霉抗生物素蛋白并且第二结合试剂是生物素。

22、测定内的结合试剂可以与一种或多种另外的结合试剂交联。在一个实施方案中，第一结合试剂与一种或多种另外的第一结合试剂交联。在另一个实施方案中，捕获试剂与一种或多种另外的捕获试剂交联。

23、在一个实施方案中，检测试剂由用户加入系统中，任选地连同捕获试剂一起。

24、固体或多孔支持物可以是任何合适的此类支持物，例如珠、膜(例如硝酸纤维素膜)或固定在膜上的珠。

25、在某些实施方案中，测定容纳在盒例如一次性盒内。

26、在其中靶分析物是蛋白质的实施方案中，捕获试剂和检测试剂对于蛋白质的亲和力可能不同。在一个实施方案中，捕获试剂和检测试剂对于蛋白质具有约10-10或更大、约10-8kd或更大、或者约10-6kd或更大的kd。

27、系统的准确度可能不同。权利要求1-42的系统，其中所述系统允许至少约90％或更高的准确度、约93％或更高的准确度、约95％或更高的准确度、约95％或更高的准确度、约98％或更高的准确度、或者约99％或更高的准确度。

28、在某些实施方案中，系统连续地产生电化学信号。在一个实施方案中，电化学信号是不连续地收集的，例如，电化学信号以由通过等待期分开的间隔进行收集。

29、在系统中可以利用任何合适的测定形式，包括竞争性或非竞争性测定形式。在一个实施方案中，系统包括横向流测定。在其它实施方案中，系统包括垂直流测定。垂直流测定可以具有多于一层，例如多层垂直流测定。

30、在一些实施方案中，本文描述的系统预期用于临床环境之外，例如用于家庭或工作场所使用的系统。在一些实施方案中，系统预期用于通过个体包括随着时间过去的自我监测。

31、系统可以允许定性、半定量或定量检测。

32、在替代实施方案中，系统是光学系统，其中检测装置是光学读取器。

33、在一个特定实施方案中，样品得自两个或更多个受试者。

34、在第二个方面，公开了包含至少一种捕获试剂和至少一种检测试剂的测定，其中所述检测试剂用酶标记进行标记，并且在至少一种靶分析物和添加的底物的存在下，所述捕获试剂和检测试剂形成可检测复合物。

35、测定可以是电化学或光学(例如，荧光或比色)测定。

36、在一个实施方案中，检测并不需要检测装置。在另一个实施方案中，可检测复合物通过检测装置例如血糖仪、计时电流计(chronoamperometer)或移动电话进行检测。

37、通过测定提供结果的时间可能不同。在一个实施方案中，在约30分钟或更短时间、约10分钟或更短时间、约5分钟或更短时间、约2分钟或更短时间、或者约1分钟或更短时间内检测。在一个特定实施方案中，产生结果的时间小于1分钟或更特别地，约30秒、约20秒、约10秒或约1秒。

38、通过测定检测的靶分析物可能不同。在一个实施方案中，靶分析物是微生物(例如，病毒或细菌)、蛋白质、肽、激素、类固醇、细胞因子、小分子、辅因子、维生素等等。

39、在一个实施方案中，通过测定检测的靶分析物是蛋白质或肽，例如病毒蛋白质或肽。

40、在一个特定实施方案中，通过测定检测的靶分析物是冠状病毒的刺突(s)蛋白或核衣壳(n)蛋白。冠状病毒可以是例如sars-cov-2或其变体。

41、在某些实施方案中，测定可以序贯或同时检测多于一种靶分析物。例如，测定可以检测两个不同的病毒物种。

42、测定的检测限(lod)可能不同。在一个实施方案中，测定具有约1mg/ml或更低、约1ng/ml或更低、约1pg/ml或更低、或者约1fg/ml或更低的lod。

43、在一个特定实施方案中，靶分析物是蛋白质，并且测定具有约1ng/ml或更低、约500pg/ml或更低，更特别地，约200、约150、约100、约75、约50、约25、约10、约5或约1pg/ml或更低的lod。

44、测定可以检测的靶分析物的数目可以不同。在一个实施方案中，测定具有约100个靶分析物/ml或更少，约50、约20、约10或约5个靶分析物/ml或更少的lod。

45、在某些实施方案中，靶分析物是全病毒，例如全冠状病毒或更特别地sars-cov-2或其变体。

46、在一个实施方案中，靶分析物是全病毒，并且测定具有约10000tcid50/ml或更低、约100tcid50/ml或更低、约50tcid50/ml或更低、约10tcid50/ml或更低、或者约5tcid50/ml或更低的lod。

47、测定中使用的捕获试剂和检测试剂可能不同。在一个实施方案中，捕获试剂和检测试剂是选自适体、抗体和蛋白质的结合试剂。

48、检测试剂可以例如用酶标记进行标记。酶可能不同。在一个实施方案中，酶是氧化还原酶。在一个特定实施方案中，酶选自氧化酶、过氧化物酶、氢化酶、过氧化氢酶、脱氢酶或磷酸酶。

49、在一个实施方案中，酶是碱性磷酸酶，并且添加的底物选自5′-磷酸吡哆醛(plp)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/盐、l-抗坏血酸-2-磷酸酯/盐、对乙酰氨基酚磷酸酯/盐、4-乙酰氨基苯基磷酸酯/盐、二乙醇胺(dea)中的4-氨基苯基磷酸酯/盐、1-氨基-2-丙醇、n-甲基-d-葡糖胺或tris缓冲液。

50、在另一个实施方案中，酶是葡萄糖磷酸酶并且添加的底物是葡萄糖。

51、在某些实施方案中，测定进一步包含报道试剂。报道试剂可能不同，例如选自适体或抗体。根据该实施方案，报道试剂与检测试剂结合。检测试剂和报道试剂均可以例如用不同的酶标记进行标记，以提供双重检测系统。

52、在一个实施方案中，捕获试剂固定到固体或多孔支持物上，以提供测试位点。

53、在一个特定实施方案中，捕获试剂借助于第一结合试剂固定到固体支持物上。根据该实施方案，捕获试剂缀合到第二结合试剂，其中所述第二结合试剂与第一结合试剂结合。第一结合试剂可能不同。

54、在一个实施方案中，第一结合试剂选自链霉抗生物素蛋白、金、银、malamides、丙烯酸酯、胺、羧酸、乙烯基砜、硫醇、硅烷和环氧化物。

55、在一个特定实施方案中，第一结合试剂是链霉抗生物素蛋白并且第二结合试剂是生物素。

56、与测定相关的结合试剂可以是交联的。在一个实施方案中，第一结合试剂与一种或多种另外的第一结合试剂交联。在另一个实施方案中，捕获试剂与一种或多种另外的捕获试剂交联。

57、固体或多孔支持物可以是任何合适的此类支持物，例如珠、膜(例如硝酸纤维素膜)或固定在膜上的珠。

58、固体或多孔支持物可以任选地包括对照位点。

59、测定可以任选地容纳在盒例如一次性盒内。

60、在其中靶分析物是蛋白质或肽的实施方案中，捕获试剂和检测试剂对于蛋白质或肽的亲和力可能不同。在某些实施方案中，捕获试剂和检测试剂对于蛋白质或肽具有约10-10kd或更小、约10-8kd或更小、或者约10-6kd或更小的kd。

61、测定的准确度可能不同。在一个实施方案中，测定为至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％或更高。

62、测定的形式可能不同。测定可以是竞争性或非竞争性测定。测定可以是横向流或垂直流测定。在其中测定是垂直流测定的实施方案中，测定可以包括一层或多层。

63、在第三个方面，提供了用于检测样品(例如，生物样品或环境样品)中的至少一种靶分析物的方法，其包括(i)提供样品，(ii)任选地，处理样品；(iii)将样品加入本文公开的系统或测定中，并且(iv)并且如果存在至少一种靶分析物，则检测靶分析物。

64、该方法任选地包括将结果传输给第三方用于审查和任选的进一步行动。

65、在一个实施方案中，进一步的行动包括诊断疾病状态或健康状态的存在。在一个特定实施方案中，可以针对疾病状态(例如，感染)或健康状态来校准结果。疾病可以是病毒感染或细菌感染。临床表现可以是例如上呼吸道感染、下呼吸道感染、肝炎、脑膜炎、脑炎和/或脑膜脑炎、结膜炎、角膜炎、角结膜炎、皮疹或生殖器病变。

66、在一个实施方案中，进一步的动作包括监测向用户施用治疗剂例如药物的结果。根据该实施方案，用户是患者或临床试验受试者。

67、在一个实施方案中，动作包括向用户施用或停止施用治疗剂。

68、在一个特定实施方案中，进一步的动作可以包括调整先前施用于用户的治疗剂的剂量(向上、向下)，以提供用于施用的新剂量。

69、在另一个特定实施方案中，进一步的动作可以涉及向用户施用另外的(例如，第二)治疗剂。

70、在一个实施方案中，批准的治疗剂是小分子药物或生物制品(例如，单克隆抗体、治疗疫苗或抗癌剂)。

71、在一个特定实施方案中，批准的治疗剂是小分子抗病毒剂。代表性的非限制性抗病毒剂包括附着抑制剂、进入抑制剂、脱壳抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和整合酶抑制剂。

72、在一个特定实施方案中，抗病毒剂选自阿昔洛韦、更昔洛韦、膦甲酸；利巴韦林；金刚烷胺、叠氮脱氧胸苷/齐多夫定)、奈韦拉平、四氢咪唑并苯二氮杂庚酮(tetrahydroimidazobenzodiazepinone)(tibo)化合物；依法韦仑；瑞德西韦、地拉韦啶、莫努匹韦、奈玛特韦和利托那韦增强型奈玛特韦。

73、在一个实施方案中，小分子抗病毒剂是瑞德西韦(作为在第一天时的200-mg负荷剂量，随后为每天施用一次的100-mg维持剂量，共长达十天)。

74、在一个实施方案中，批准的治疗剂是生物抗病毒剂。代表性的非限制性生物抗病毒剂包括单克隆抗体(mab)、核酸疗法(例如rnai、反义、dna疫苗、微小rna、shrna或适体)。

75、在一个实施方案中，治疗剂是病毒颗粒阻断剂。

76、在一个实施方案中，单克隆抗体抗病毒剂选自索托维单抗(sotrovimab)(例如，作为500毫克单剂量静脉内施用)、巴马尼单抗(bamlanivimab)(700mg作为单次iv输注)、埃特司韦单抗(etesevimab)和巴马尼单抗(1400mg埃特司韦单抗加上巴马尼单抗700mg作为单次iv输注)、或卡西瑞单抗(casirivimab)和伊德单抗(imdevimab)(在单次iv输注中的1,200mg卡西瑞单抗和1,200mg伊德单抗)。

77、在一个特定实施方案中，治疗剂是抗细菌剂。代表性的非限制性抗细菌剂包括青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、单环内酰胺类和碳青霉烯类和大环内酯类。

78、在一个实施方案中，治疗剂选自苯唑西林(oxicillin)、多西环素、地美环素；依拉环素、米诺环素、奥玛环素、四环素、头孢氨苄、头孢噻肟(defotaxime)、头孢他啶、头孢呋辛、头孢洛林；环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、克林霉素、林可霉素、甲硝唑、阿奇霉素；克拉霉素、红霉素、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶；柳氮磺吡啶、阿莫西林和克拉维酸；万古霉素、达巴万星、奥利万星、特拉万星、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、亚胺培南和西司他丁、美罗培南、多尼培南和厄他培南。

79、在一个特定实施方案中，治疗剂是抗真菌剂。代表性的非限制性抗真菌剂包括唑类、多烯类和5-氟胞嘧啶。

80、在一个特定实施方案中，治疗剂是抗炎剂。

81、在一个实施方案中，抗炎剂选自阿司匹林、塞来昔布、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、萘丁美酮、萘普生、尼达尼布、奥沙普嗪、吡非尼酮、吡罗昔康、双水杨酯、舒林酸、托美丁及其组合。

82、在一个特定实施方案中，治疗剂是抗癌剂。

83、在一个实施方案中，抗癌剂选自烷化剂(或烷化样剂)、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物生物碱、激素剂、拓扑异构酶抑制剂等等。

84、(ii)中的处理可能不同，并且包括例如稀释样品或向测定中添加或多种组分，例如一种或多种结合试剂。在某些实施方案中，将捕获试剂、检测试剂和报道试剂中的一种或多种加入系统或测定中。

85、在第四个方面，公开了试剂盒，其含有本文公开的系统或测定的一种或多种组分以及任选的使用说明书。

86、在第五个方面，公开了血糖计或计时电流计，其配置用于读取免疫测定的结果。

87、在某些实施方案中，计时电流计利用改良计时电流方法(例如，改变电压施加的长度和时期的技术)，任选地与对于酶功能关键的化合物或抗衡离子(例如，mgcl2)的滴定组合。根据该实施方案，改良计时电流法允许下述中的一项或多项：收集信号(电流、电荷)、增加信号、改善信噪比、改善灵敏度(例如检测限)、减少信号时间、在多重工作电极上的多路复用和/或减少背景。变量包括但不限于强制电位、测量前延迟、测量时间、开路时间、循环数目、测量采样率等。

88、在某些实施方案中，方法并不利用恒定计时电流法。在另一个实施方案中，该方法并不利用延迟计时电流法。

89、本文公开的系统、测定和方法有利地允许检测在样品中以低浓度存在的靶分析物。

90、在一个特定实施方案中，本文公开的系统、测定和方法允许检测在样品中以低浓度的靶蛋白或肽(例如，病毒蛋白质或肽，例如冠状病毒例如sars-cov-2或其变体例如“omicron”变体的n蛋白)。

91、在一个特定实施方案中，本文公开的系统、测定和/或方法允许以约100fg/ml或更低，更特别地，约90、约80、约70、约60、约50、约40、约30、约20、约10、约5或约1fg/ml或更低的lod检测靶病毒(例如冠状病毒，例如sars-cov-2或其变体)。

92、在一个特定实施方案中，本文公开的系统、测定和/或方法允许以约25fg/ml或更低的lod检测靶病毒(例如冠状病毒，例如sars-cov-2或其变体)。

93、在一个特定实施方案中，本文公开的系统、测定和/或方法允许以约1012tcid50/ml或更低，更特别地，约1011、约1010、约109、约108、约107、约106、约105、约104、约5000、约2000、约200、约100、约50或约25tcid50/ml或更低的lod检测靶病毒。

94、在另一个特定实施方案中，本文公开的系统、测定和/或方法允许以约1012pfu/ml或更低，更特别地，约1011、约1010、约109、约108、约107、约106、约105、约104、约5000、约2000、约200、约100、约50或约25pfu/ml或更低的lod检测靶病毒。

95、在另一种特定实施方案中，本文公开的系统、测定和/或方法允许小于约100个靶分析物/毫米、约80个靶分析物/ml或更少、约60个靶分析物/ml或更少、约40个靶分析物/ml或更少、约20个靶分析物/ml或更少、约10个靶分析物/ml或更少、约5个靶分析物/ml或更少、或约1个靶分析物/ml的lod。

96、在某些实施方案中，本文公开的系统、测定和/或方法允许约1个分析物/毫米至约100,000个靶分析物/ml或更多的lod。

97、在某些实施方案中，系统允许约1至约5、约5至约10、约10至约20、或者约20至约30个分析物/ml的lod。

98、在某些实施方案中，本文公开的系统和方法利用脉冲检测。

99、在一个特定实施方案中，(ii)中的处理包括在液体介质中稀释样品。

100、在某些实施方案中，本文公开的系统、测定和方法允许高度的特异性和灵敏度。在一些实施方案中，系统、测定和方法具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的特异性。在一些中，系统、测定和方法允许至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的灵敏度。

101、在某些实施方案中，本文公开的系统、测定和方法允许至少一种靶分析物的定性、半定量或定量检测。

102、在某些实施方案中，本文公开的系统、测定和/或方法允许多重靶的同时或序贯检测。在一个实施方案中，系统、测定和/或方法允许两个或更多个病毒物种或者同一病毒物种的两种或更多种毒株的同时或序贯检测。

103、在一个实施方案中，系统、测定和/或方法允许选自冠状病毒(例如，sars-cov-2)、呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒和副流感病毒(piv)的呼吸道病毒和腺病毒的同时或序贯检测。

104、在某些实施方案中，系统、测定和/或方法允许病毒和细菌的同时或序贯检测。在一个实施方案中，病毒是呼吸道病毒，并且细菌选自肺炎链球菌(s.pneumoniae)、流感嗜血杆菌(h.influenzae)、卡他莫拉菌(mcatarrhalis)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)。

105、多路复用系统、测定或方法可以涉及电化学或光学检测。

106、在某些实施方案中，同时或序贯检测是定性的、半定量的或定量的。