一种高精度葡萄糖传感器及其制备方法

1.本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种高精度葡萄糖传感器及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病已成为威胁人类健康的疾病之一。糖尿病人的血糖监测对控制病情非常重要。对现在普遍采用的有创测试，病人多有恐惧感和不适感。因此，无创血糖仪的研发成为各国医疗界的重点题目。其中，采用反向离子电渗技术得到皮下间质的糖分子，并通过电化学生物传感器测试皮下渗出的葡萄糖，国外已开展了相关研究。相对于直接采血检测人体血糖(mmol/l量级)来说，皮下渗出葡萄糖的浓度非常低(μmol/l量级)，传统的血糖生物传感器在检测范围和灵敏度上几乎都无法满足要求，而能检测低浓度葡萄糖的传感器由于电极制作的限制无法实用化。在0.42v工作电压下，通过使用过氧化氢传感器实现了皮下血糖的无创检测。然而，较高的工作电位易导致体液中的其他电活性物质易对测试造成干扰。
3.为了避免酶的缺点，无酶葡萄糖传感器越来越受到人们的关注。贵金属，如铂、金和钯，由于其对葡萄糖稳定的氧化催化活性，已被用于无酶葡萄糖传感器的开发。但葡萄糖氧化催化动力学较差，反应时间长，灵敏度低，电解质中的反应中间体和cl-对贵金属电极具有毒性。此外，葡萄糖氧化的电化学电位通常高到足以催化一些人体自身的生理物质，导致抗干扰能力差。
4.为了提高灵敏度和选择性，人们研究采用电镀、阳极氧化和气相沉积等表面改性技术对传感电极进行表面改性。这些技术可以增加电极的表面粗糙度，加速电子从葡萄糖到电极的转移，提高传感器的灵敏度。此外，在贵金属电极上，常见的生理干扰物质(如抗坏血酸(aa)和尿酸(ua))的氧化是扩散控制过程，而葡萄糖氧化是由表面反应控制的。表面粗糙度的增加降低了干扰物质的扩散，但不影响葡萄糖的反应速率，从而提高了选择性。虽然在理论上，通过提高电极表面粗糙度来提高传感器的选择性和灵敏度是可能的，但实际上，这种方法对性能的改进是有限的。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种高精度葡萄糖传感器及其制备方法，。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种高精度葡萄糖传感器的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)对三电极体系的电极表面进行活化处理，然后使偶联有壳聚糖的锇氧化还原聚合物吸附至工作电极表面；
9.(2)将含有葡萄糖氧化酶的酶溶液涂布于工作电极的反应区，室温交联后清洗干燥即可。
10.进一步地，三电极体系由玻碳工作电极、玻碳对电极和ag/agcl参比电极组成。
11.进一步地，活化处理的过程为：
12.依次采用50％硝酸溶液、无水乙醇和超纯水对电极表面进行清洗即可。
13.进一步地，于室温避光条件下，使偶联有壳聚糖的锇氧化还原聚合物吸附至工作电极表面。
14.进一步地，通过戊二醛使葡萄糖氧化酶与锇在真空环境中交联3～5天，形成锇氧化还原聚合物，其中，戊二醛的质量浓度为2～5％。
15.进一步地，酶溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为2～5u/μl，bsa添加量为酶溶液体积的1.5～2％。
16.进一步地，步骤(2)中交联所用交联剂为戊二醛，其在酶溶液中的添加量为酶溶液体积的2～5％。
17.进一步地，步骤(2)中交联时间为3～5h。
18.进一步地，工作电极敏感部位面积为0.85cm。
19.上述方法制备得到的高精度葡萄糖传感器。
20.本发明制备的传感器在使用时，由两只形状相同的传感器共同配合，完成传感器的抽取和检测功能。其中，w1和w2为薄膜玻碳工作电极，c1和c2为玻碳对电极，w和r构成抽取电极回路，r1和r2为丝网印刷ag/agcl参比电极，用于在传感器测试时提供一个稳定的参比电压。(见图1)
21.本发明的有益效果：
22.1、本发明采用偶联有壳聚糖的锇氧化还原聚合物为电子媒介体修饰薄膜玻碳电极，使锇氧化还原聚合物具有可逆的电化学特性；且由于锇可以在电极和酶之间进行电子的快速转移，消除了对本体溶液中氧浓度的依赖。
23.2、本发明采用通过戊二醛法固定葡萄糖酶分子制备出新型生物传感器，有效地降低了传感器的工作电压；同时，交联后的酶溶液，工作电位低，可显著提升其抗干扰能力。
24.3、本发明采用的材料制备方法，都在水溶液中进行，无需使用有机溶剂，生产过程绿色环保，同时无有机溶剂残留，有利于扩大应用范围.
25.4、本发明原材料便宜，合成路径简单，能够快速且大量地制备导电材料，有利于新型柔性生物电子器件的量产及商业化应用。
26.5、本发明制备得到的传感器在5.0-25.0mmol/l的葡萄糖标准浓度范围内，传感器灵敏为250.55na/(μmol
·
l-1
)，最低检测限为0.018μmol/l，相关系数为0.999；在标准皮下葡萄糖浓度5.0-30.0mmol/l浓度范围内，被抽取出的葡萄糖电流响应值与皮下葡萄糖的浓度成线性关系，线性相关系数为0.993，灵敏度为343.21na/(mmol
·
l-1
)；单只传感器对10mmol/l葡萄糖检测的精度为1.34％(n＝10)，不同传感器之间对20mmol/l葡萄糖测量的精度为2.22％(n＝10)，在4℃条件下，传感器的寿命可达14天。
附图说明
27.图1为传感器的三电极体系结构图；
28.图2为传感器对不同葡萄糖浓度下的i-t响应图；
29.图3为传感器对不同葡萄糖浓度下的线性图；
30.图4为传感器的长期稳定性图。
具体实施方式
31.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
32.实施例1
33.一种高精度葡萄糖传感器的制备方法，具体过程如下：
34.(1)采用玻碳工作电极、玻碳对电极和ag/agcl参比电极形成三电极体系；其中，工作电极反应区面积为0.85cm；
35.(2)依次采用50％硝酸溶液、无水乙醇和超纯水对电极表面进行清洗，完成对电极的活化处理；
36.(3)以戊二醛作为交联剂，使葡萄糖氧化酶与锇在真空环境中交联3天形成锇氧化还原聚合物，然后再使壳聚糖与锇氧化还原聚合物偶联，并吸取6μl偶联后的产物滴加至工作电极的表面，于室温避光过夜，使聚合物牢固吸附在工作电极表面；
37.(4)吸取20μl酶溶液均匀涂布于工作电极的反应区，酶溶液中葡萄糖氧化酶的含量为2u/μl，bsa的重量为酶溶液体积的1.5％，戊二醛含量为酶溶液体积的2.7％，然后于室温交联3h；
38.(5)用去离子和pbs冲洗步骤(4)所得产物，洗去游离物质，晾置干燥后，保存在4℃冰箱中备用。
39.实施例2
40.一种高精度葡萄糖传感器的制备方法，具体过程如下：
41.(1)采用玻碳工作电极、玻碳对电极和ag/agcl参比电极形成三电极体系；其中，工作电极反应区面积为0.85cm；
42.(2)依次采用50％硝酸溶液、无水乙醇和超纯水对电极表面进行清洗，完成对电极的活化处理；
43.(3)以戊二醛作为交联剂，使葡萄糖氧化酶与锇在真空环境中交联3天形成锇氧化还原聚合物，然后再使壳聚糖与锇氧化还原聚合物偶联，并吸取6μl偶联后的产物滴加至工作电极的表面，于室温避光过夜，使聚合物牢固吸附在工作电极表面；
44.(4)吸取20μl酶溶液均匀涂布于工作电极的反应区，酶溶液中葡萄糖氧化酶的含量为3u/μl，bsa的重量为酶溶液体积的2％，戊二醛含量为酶溶液体积的2.5％，然后于室温交联3h；
45.(5)用去离子和pbs冲洗步骤(4)所得产物，洗去游离物质，晾置干燥后，保存在4℃冰箱中备用。
46.实施例3
47.一种高精度葡萄糖传感器的制备方法，具体过程如下：
48.(1)采用玻碳工作电极、玻碳对电极和ag/agcl参比电极形成三电极体系；其中，工作电极反应区面积为0.85cm；
49.(2)依次采用50％硝酸溶液、无水乙醇和超纯水对电极表面进行清洗，完成对电极的活化处理；
50.(3)以戊二醛作为交联剂，使葡萄糖氧化酶与锇在真空环境中交联3天形成锇氧化还原聚合物，然后再使壳聚糖与锇氧化还原聚合物偶联，并吸取6μl偶联后的产物滴加至工作电极的表面，于室温避光过夜，使聚合物牢固吸附在工作电极表面；
51.(4)吸取20μl酶溶液均匀涂布于工作电极的反应区，酶溶液中葡萄糖氧化酶的含量为4u/μl，bsa的重量为酶溶液体积的1.8％，戊二醛含量为酶溶液体积的3％，然后于室温交联3h；
52.(5)用去离子和pbs冲洗步骤(4)所得产物，洗去游离物质，晾置干燥后，保存在4℃冰箱中备用。
53.实验例
54.1、工作电极的电化学特性
55.采用8μl的锇聚合物修饰薄膜玻碳工作电极。在不同扫描速率时，氧化还原聚合物的阴阳极峰电流变化值随扫描速率增加而增加。扫描速率分别为5,10,20,50,100,200,500mv/s：其氧化峰电流(i
pa
)与还原峰电流(i
pc
)之比为i
pa
/i
pc
≈1，且峰电流与扫描速率的平方根成线性关系，说明锇氧化还原聚合物具有可逆的电化学特性。
56.2、传感器对标准葡萄糖的电流响应检测
57.图2和图3给出了传感器对标准葡萄糖的电流响应曲线。每个样品重复测3次，工作电压0.21v。由图中看出：当加入葡萄糖溶液后，随着葡萄糖浓度的增加，传感器的电流响应也在逐渐增大，电流值的增加与葡萄糖浓度增加呈线性关系,且电流响应信号快速趋于稳定。同时，在5.0-25mmol/l浓度范围内，葡萄糖溶液的电流响应信号具有非常好的线性关系。在5.0-25mmol/l范围内传感器的线性校正方程i
p
＝0.184x
–
9.44，最低检测限为0.018μmol/l，相关系数r为0.99937，传感器的灵敏度为343.21na/(μmol
·
l-1
)。结果表明：锇聚合物的使用有效地降低了传感器的工作电压。
58.3、传感器对皮下葡萄糖的电流响应
59.采用反离子电渗技术进行了皮下葡萄糖的经皮抽取和检测实验。皮下葡萄糖的抽取过程为本领域常规过程，具体过程可参考公开文献。其中，皮下葡萄糖的浓度范围分别0,3,7,10,14,19mmol/l，传感器贴在鼠皮表面，传感器抽取检测周期为10min，工作电压为0.21v，取传感器100s的电流响应值为检测结果。传感器对抽取出的葡萄糖的电流相遇与皮下葡萄糖的反离子电渗技术进行了皮下葡萄糖的经皮抽取和检测实验。结果表明传感器对抽取出的葡萄糖的电流相遇与皮下葡萄糖的相差不大。
60.4、传感器重复性检测
61.研究了所研制的同批单只生物传感器和批间不同传感器之间分别对10mmol/l葡萄糖重复测试的精度，传感器在响应时间100s处对10mmol/l葡萄糖重复测试10次所获得电流响应结果。批内精度指1只传感器重复10次测试10mmol/l葡萄糖的电流响应结果。批间精度指用10只传感器分别测试10mmol/l葡萄糖的电流响应结果。如图4所示，表明传感器的批内和批间精度分别为4.07％和3.22％。均小于5％，表明所制备的传感器具有较好的重复性和一致性。
62.5、传感器稳定性检测
63.传统的寿命试验是通过检测传感器在4℃条件下存放多长时间来评估其性能。在物理化学中，化学反应的速率随反应温度升高而加快。生物试剂在不同温度中保存，试剂失
效的“速率”和存放的温度时间也符合物理化学上的反应速率关系。阿仑尼乌斯经验式归纳了这个物理化学的规律。阿仑尼乌斯描述温度对反应速率的影响经验式如下：lnk＝-eart+b，式中k为反应速率；t为反应的绝对温度。设计试验，进行多个温度下保存试剂出现失效的保存时间，该时间(天数或小时数)的倒数即为在该温度下试剂变坏的速率。将试验温度换算为绝对温度t和保存时间倒数形成各个数据在半对数纸上作图，令lnk为y，1/t为x。在图上绘制一条最佳的配合线，由该线倒推至t为277k(4℃)时对应的反应速率的对数值。由该对数值求反对数(指数)，再求该值的倒数，即为估计的稳定时间。本文依据上述原理对葡萄糖生物传感器进行了寿命稳定性能的观察。在20,35,55℃进行试验。以4℃生物传感器的响应为对控制品检测结果,检测结果以在4℃条件下生物传感器响应结果的90％或以下的为失效。
64.将x(1/t)和y[lg(1/d)]的成对结果绘图或进行直线回归处理(在半对数纸上呈直线关系)。由回归式推算4℃的绝对温度277k下，预期稳定的天数为14d。所以，由试验推算，所制备的生物传感器在4℃下可以稳定保存的时间约14d。