基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析检测方法

1.本发明属于生物传感检测技术领域，具体涉及基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析试纸条制备及检测方法。


背景技术：

2.食品安全关系公众身体健康和生命安全，近十年来，食源性致病菌污染始终占据食品安全事件首位。食源性致病菌广泛存在于食物链中，在加工、贮藏、流通等各个环节都能通过受污染的各类食物或者饮用水被摄入人体内，从而导致食物中毒、肠道传染病的发生以及畜禽传染病的流行。常见的食源性致病菌主要有单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等。而检测技术是制约食源性致病菌安全监管的重要瓶颈，为保障食品的安全，对食源性致病菌快速检测的需求更加迫切，同时也提出了更高的要求。
3.许多分析方法已被用于检测食源性致病菌，如传统的活菌培养，免疫学和分子生物学检测方法。传统的活菌检测方法被认为是检测致病菌的金标准，该方法成本低，灵敏度高，但它也因费力和耗时而受到负面影响。此外，活菌培养还尚未具备完全集成和自动化系统。免疫学和分子生物学检测方法显著提高了检测分辨率，并且缩短了分析时间，如酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应(pcr)、实时pcr和荧光生物传感器。然而，这些方法仍然存在耗时、需要专门设备和训练有素的技术人员等问题，这大大限制了它们的实际应用。
4.纳米酶具有合成方案简单可控、催化活性优异、环境稳定性极高等优点，典型的纳米酶包括纳米碳材料、金属、金属氧化物和纳米复合材料等。磁性纳米酶具有易功能化、生物相容性好、稳定性高、准确、快速、廉价、简单等特点，在检测食源性致病菌中发挥着重要作用。而四氧化三铁磁性纳米粒子(fe3o
4 nps)显示出过氧化物酶催化活性，可增强侧流层析传感器的信号输出，提高检测灵敏度。
5.万古霉素(van)作为一种商用抗生素，对革兰氏阳性菌展现出高度特异性的相互作用，它通过与细菌表面d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子形成的五个氢键而特异性识别革兰氏阳性菌。牛血清白蛋白(bsa)被广泛用于降低非特异性吸收的阻滞剂，能够减少非目标分子与靶分子特异性位点的结合。
6.噬菌体作为一种新型的识别物质已被大量研究，它能够以极高的特异性感染宿主细菌。噬菌体的尾丝蛋白(tfp)和尾刺蛋白都可以用于致病菌的快速检测。噬菌体在感染过程中使用tfp锚定宿主细菌，并使用尾刺蛋白溶解细胞壁，将其核酸注入宿主细菌，利用细菌复制机制复制后代。但尾刺蛋白能在短时间内破坏宿主细胞完整性，因此，不具有裂解活性的尾丝蛋白被认为是用于细菌检测的理想识别元件。


技术实现要素：

7.本发明要解决的主要技术问题是提供一种检测灵敏度高、特异性好，操作便捷的基于噬菌体-纳米酶检测食源性致病菌的侧流层析生物传感器。
8.为解决上述技术问题，本发明还提供基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析试纸条制备方法，如下：
9.1、纳米酶探针的制备：称取20mg sfe3o
4 nps溶于无菌的pbs溶液(0.01mol/l，ph为7.4)，在磁场的作用下，充分洗涤sfe3o
4 nps，并将收集的sfe3o
4 nps重悬于pbs溶液中。加入6.5mg nhs和5.8mg edc至重悬液中于室温下避光活化1h，将活化后的sfe3o
4 nps再次用无菌pbs洗涤重悬，加入24mg牛血清蛋白，室温下反应2h，再次洗涤重悬，得到bsa-sfe3o
4 nps溶液；在bsa-sfe3o
4 nps溶液中加入200mg活化后的万古霉素(van)，混合均匀，室温下避光孵育6h，在外加磁场作用下洗涤，并重悬于pbs溶液中，得到van-bsa-sfe3o
4 nps探针。
10.优选的，纳米酶探针均用10ml无菌的pbs溶液洗涤3次，再重悬于8ml无菌的pbs溶液中。
11.2、噬菌体尾丝蛋白提取(为更好地说明该发明，本发明选用单增李斯特菌噬菌体为实验对象，本技术领域的技术人员可根据实际情况选用不同材料，但所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内)：用试剂盒提取单增李斯特菌噬菌体a511的dna，从ncbi上查询噬菌体a511基因组序列(登记号：nc_009811.2)，并根据尾丝蛋白基因序列设计引物。以噬菌体dna为模板，以引物进行pcr扩增，获得尾丝蛋白编码基因片段。用北京全式金生物有限公司 e1 expression kit试剂盒进行重组质粒的构建，重组质粒进行pcr扩增和测序验证。将测序结果正确的重组质粒转到大肠杆菌bl21(de3)plyss感受态细胞中，加入iptg诱导剂诱导尾丝蛋白表达。通过sds-page电泳观察目的蛋白条带，并采用ni-nta纯化系统纯化蛋白。
12.优选的，根据尾丝蛋白基因序列设计引物：f：5'-atgagtgatgtagaatcagg-3'，r：5'-ctgctttagaaaatagctga-3'。
13.优选的，pcr扩增体系为：ddh2o为35.2μl，dntps(2.5mmol/l)为1μl，10
×
pcr buffer为5μl，taq聚合酶(5u/μl)为0.3μl，上下游引物为2μl，mg
2+
为4μl，模板dna为0.5μl。pcr扩增条件为：94℃变性，55℃复性，72℃延伸，30个循环，72℃延伸。
14.3、试纸条组装：将nc膜黏贴到底板上，再由底板的一侧向另一侧依次黏贴样品垫和吸收垫，样品垫和吸收垫分别与nc膜重叠2mm。将35μl尾丝蛋白溶液喷涂在试纸条nc膜上形成检测线，将已喷好的试纸条放在室温下，待喷涂的蛋白晾干。用切条机将试纸条切成3.8mm宽，将制备好的试纸条放入装有干燥剂的包装袋内并置于4℃保存。
15.优选的，所用尾丝蛋白溶液浓度为10mg/ml。
16.4、本发明还提供基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析试纸条制备方法，包括以下步骤：
17.1)sfe3o
4 nps的制备：将无水naac(0.015mol)加到15ml乙二醇中超声溶解，再将fecl3·
6h2o(0.004mol)、柠檬酸钠(0.2g)和peg 6000(0.2g)溶于15ml乙二醇中后加到醋酸钠溶液中，溶液超声溶解后在剧烈的磁力下剧烈搅拌，后转入带有聚四氟内衬的不锈钢反应釜中反应。冷却至室温后将产物用去离子水和无水乙醇洗涤数次，再放入60℃烘箱中干燥12h以获得含羧基的fe3o
4 nps(sfe3o
4 nps)。
18.优选的，反应中剧烈搅拌时间为30min，在不锈钢反应釜中反应条件为200℃、8h。
19.2)万古霉素的活化：将200mg万古霉素溶解于2ml无菌pbs溶液中，再加入47.89mg nhs和169.3mg edc，在室温下避光反应10min。
20.3)尾丝蛋白诱导表达：挑选含有peasy-gp99的bl21(de3)plyss接种于20ml含有氨苄西林(amp)的lb肉汤中培养，在37℃、120r/min培养16h。将上述菌液接种1ml到99ml的lb(amp+)肉汤里，在37℃，200r/min下培养3.5h至菌液的od
600
为0.4-0.6。加入iptg诱导剂进行诱导表达。取1ml菌液迅速离心，用36μl无菌超纯水重悬沉淀，加入4μl 4
×
sds-page loading buffer混合均匀后煮沸3-5min，制备成蛋白质电泳上样液，进行sds-page电泳。
21.优选的，选用iptg最佳诱导浓度为1mmol/l，最佳诱导条件为37℃，200r/min，8h。
22.优选的，lb肉汤中amp浓度为100μg/ml。
23.优选的，菌液离心条件为4℃、12000r/min、1min。
24.5、本发明还提供基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析检测方法，包括以下步骤：在1ml待测样品中加入纳米酶探针，置于摇床中孵育，后进行磁分离，再用100μl pbs溶液重悬获得的菌-van-bsa-sfe3o
4 nps复合物。将样品垫放入上述菌液-van-bsa-sfe3o
4 nps重悬液中，重悬液向吸收垫迁移。10min后，将试纸条放入另一个装有500μl naac(ph 4.5)、10μl h2o2(30％)和10μl dab(10mg/ml)的试管中反应6min，用去离子水快速冲洗试纸条以终止反应。通过肉眼观察显色情况，判读结果：阴性反应：检测线不显色；阳性反应：检测线显色。
25.优选的，纳米酶探针用量为100μl。
26.优选的，摇床中孵育条件为37℃，200r/min，60min，磁分离时间为7min。
27.6、本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：
28.本发明利用食源性致病菌噬菌体的尾丝蛋白作为特异性识别元件，不仅对人体和环境无害，且尾丝蛋白和病原菌结合稳定，灵敏度高，特异性好。这也是首次将噬菌体尾丝蛋白作为识别元件应用到纳米酶试纸条上，对食源性致病菌进行高灵敏度、高特异性、快速、简便的筛查和检测。
29.本发明构思巧妙，检测方便快速，且检测结果可视化，无需专业设备和仪器及不需要专业人员的技术，可用于环境、食品中食源性致病菌的现场快速检测。
附图说明
30.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明，其中：
31.图1为本发明实施例中试纸条的总体结构示意图；
32.图2为本发明中制备的基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析的检测方法在实际样品中应用结果图；
33.图3为本发明中制备的基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析生物传感器稳定性结果图；
34.图4为本发明中制备的基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析生物传感器特异性结果图；
35.图5为本发明中制备的基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析生物传感器灵敏性结果图。
具体实施方式
36.下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的
理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
37.实施例1
38.实验材料
39.本实施例中共有4种微生物用于基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析检测方法，所用的单增李斯特菌与非单增李斯特菌菌株信息见表1。
40.表1
[0041][0042]
实施例2
[0043]
请参阅图1，基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析试纸条，所述试纸条包括底板，底板上黏贴有nc膜，再由底板的一侧向另一侧依次黏贴有样品垫和吸收垫，nc膜涂有致病菌噬菌体的尾丝蛋白以作为检测线。纳米酶捕获食源性致病菌后，将捕获液滴在试纸条样品垫上，在毛细作用的驱动下，负载了致病菌的纳米酶沿着样品垫迁移到nc膜，当混合物抵达检测线，噬菌体tfp对致病菌进行特异性捕获，同时纳米酶会堆积在检测线上，再利用sfe3o
4 nps对dab/h2o2的酶促反应会产生棕色非溶解性产物，从而达到对致病菌的可视化检测。
[0044]
所述样品垫采用上海捷宁生物科技有限公司生产的型号为sb-06的样品垫，吸收垫采用上海捷宁生物科技有限公司生产的型号为jn8306的吸收垫，能够在市面上直接购买获得。
[0045]
实施例3
[0046]
本实施例中的基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析检测方法，包括以下制备步骤：
[0047]
1)纳米酶探针的制备：称取20mg sfe3o
4 nps加入10ml无菌的pbs溶液(0.01mol/l，ph 7.4)，混合均匀备用，在外加磁场的作用下，充分洗涤sfe3o
4 nps，并将收集的sfe3o
4 nps重悬于10ml灭菌的pbs溶液中。加入6.5mg nhs和5.8mg edc至上述重悬液中于室温下避光活化1h，将活化后的sfe3o
4 nps用无菌pbs洗涤重悬，加入24mg牛血清蛋白，室温下反应2h，再次洗涤重悬，得到bsa-sfe3o
4 nps溶液；在bsa-sfe3o
4 nps溶液中加入200mg活化后的万古霉素，混合均匀，室温下避光孵育6h，在外加磁场作用下洗涤3次，并重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到van-bsa-sfe3o
4 nps探针。
[0048]
2)噬菌体尾丝蛋白提取(为更好地说明该发明，本发明选用单增李斯特菌噬菌体为实验对象，本技术领域的技术人员可根据实际情况选用不同材料，但所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内)：用试剂盒提取单增李斯特菌噬菌体dna，从ncbi上查询噬菌体a511基因组序列(登记号：nc_009811.2)，根据尾丝蛋白基因序列设计引物。以噬菌体dna为模板，以引物进行pcr扩增，获得尾丝蛋白编码基因片段。用北京全式金生物有限公
司 e1 expression kit试剂盒进行重组质粒的构建，进行pcr扩增和测序验证。将测序结果正确的重组质粒转到大肠杆菌bl21(de3)plyss感受态细胞中，加入iptg诱导剂进行尾丝蛋白诱导表达，通过sds-page电泳观察蛋白条带，并采用ni-nta纯化系统纯化蛋白。
[0049]
3)试纸条组装：将nc膜黏贴到底板上，再由底板的一侧向另一侧依次黏贴样品垫和吸收垫，样品垫和吸收垫分别与nc膜重叠2mm。将35μl尾丝蛋白溶液(10mg/ml)喷涂在试纸条的nc膜上形成检测线，将已喷好的试纸条放在室温下，待喷涂的蛋白晾干。用切条机将试纸条切成3.8mm宽，将组装好的试纸条放入装有干燥剂的包装袋内并置于4℃保存。
[0050]
所述步骤2)中，根据噬菌体尾丝蛋白基因序列设计引物：f：5'-atgagtgatgtagaatcagg-3'，r：5'-ctgctttagaaaatagctga-3'。
[0051]
本实施例中基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析检测方法还包括以下制备方法：
[0052]
4)磁性纳米酶的制备：将无水naac(0.015mol)加到15ml乙二醇中超声溶解，再将fecl3·
6h2o(0.004mol)、柠檬酸钠(0.2g)和peg 6000(0.2g)溶于15ml乙二醇中后加到醋酸钠溶液中，溶液超声溶解后在剧烈的磁力下剧烈搅拌30min，转入带有聚四氟内衬的不锈钢反应釜中，在200℃下反应8h，冷却至室温后将产物用去离子水和无水乙醇洗涤数次，再放入60℃烘箱中干燥12h以获得含羧基的fe3o
4 nps(sfe3o
4 nps)。
[0053]
5)万古霉素的活化：将200mg万古霉素溶解于2ml无菌pbs溶液中，再加入47.98mg nhs和169.3mg edc，在室温下避光反应10min。
[0054]
6)尾丝蛋白诱导表达：挑选含有peasy-gp99的bl21(de3)plyss接种于20ml含有100μg/ml氨苄西林(amp)的lb肉汤中培养，在37℃、120r/min培养16h。将上述菌液接种1ml到99ml的lb(amp+)溶液里，在37℃，200r/min下培养3.5h至菌液的od
600
为0.4-0.6。加入iptg诱导剂进行诱导表达。取1ml菌液迅速在4℃、12000r/min下离心1min，用36μl无菌超纯水重悬沉淀。加入4μl 4
×
sds-page loading buffer混合均匀后煮沸3-5min，制备成蛋白质电泳上样液。
[0055]
所述步骤6)中，iptg最佳诱导浓度为1mmol/l，最佳诱导表达条件为37℃，200r/min，8h。
[0056]
实施例4
[0057]
本实施例对实施例3中所制得的基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析生物传感器进行实际应用，应用方法如下：
[0058]
选择了四种样品(0.9％生理盐水、牛奶、生菜汁、pbs缓冲溶液)并通过传统的平板培养的方法确认其中不含单增李斯特菌。生菜用次氯酸钠溶液(10％)浸泡10min，后将生菜叶(10g)碾碎，与无菌的pbs缓冲液(90ml)混合，然后用均质器均质5min。其他3种样品直接保存于4℃。
[0059]
将终浓度为104cfu/ml的单增李斯特菌菌液(0.1ml)分别加入0.9ml 0.9％生理盐水、pbs缓冲液、牛奶和生菜汁中，然后加入100μl van-bsa-sfe3o
4 nps溶液，将混合物在37℃、200rpm下孵育60min，通过磁分离7min获得细菌-van-bsa-sfe3o
4 nps复合物。将磁分离获得的上清液置于2ml离心管中，同时用100μl无菌pbs溶液重悬细菌-van-bsa-sfe3o
4 nps复合物。将上清液和细菌-van-bsa-sfe3o
4 nps重悬液(捕获液)分别稀释至适当浓度，通过
tsa平板计数法计算van-bsa-sfe3o
4 nps的捕获效率(菌落数在20-200为有效数据)。捕获效率(％)＝捕获液中菌落总数/(上清液中菌落总数+捕获液中菌落总数)
×
100％。结果如图2。
[0060]
从图2可以看出，van-bsa-sfe3o
4 nps在pbs和生理盐水中的捕获率分别为95.7％和93.2％，两者之间没有显著性差异(p＞0.05)。在牛奶样品和生菜汁样品中，由于一些基质效应的存在，对单增李斯特菌的捕获率降低为82.1％和77.7％，两种样品之间没有显著性差异(p＞0.05)。上述结果表明，制得的磁性纳米酶探针在实际样品中捕获单增李斯特菌具有较好效果。
[0061]
实施例5
[0062]
本实施例对实施例3中所制得的基于噬菌体识别的食源性致病菌纳米酶侧流层析生物传感器进行性能评估，其中包括层析试纸条的稳定性、特异性和灵敏性。
[0063]
(1)层析试纸条稳定性
[0064]
将试纸条分别放置1-6周后，将终浓度为104cfu/ml的单增李斯特菌-van-bsa-sfe3o
4 nps的重悬液滴于放置不同时间的试纸条样品垫上。10min后，将试纸条放入dab+h2o2溶液中反应6min，用去离子水快速冲洗试纸条以终止反应，通过肉眼观察检测线显色情况。结果如图3。
[0065]
图3从左往右分别为放置1-6周的试纸条反应结果。可以看出，放置不同时间的纳米酶试纸条对单增李斯特菌的反应几乎相同，表明该纳米酶试纸条稳定性较好。
[0066]
(2)层析试纸条特异性
[0067]
将单增李斯特菌、大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及阴性对照ddh2o与van-bsa-sfe3o
4 nps探针的重悬液滴于试纸条样品垫上，10min后，将试纸条放入dab+h2o2溶液中反应6min，用去离子水快速冲洗试纸条以终止反应，通过肉眼观察检测线显色情况。结果如图4。
[0068]
图4从左往右以此为单增李斯特菌、大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和ddh2o在试纸条上的反应结果。可以看出，当检测单增李斯特菌时，试纸条上可以观察到明显的条带。在其他细菌溶液和ddh2o中均未观察到条带，且均无假阳性结果，表明该试纸条对单增李斯特菌具有较高的特异性。
[0069]
(3)层析试纸条灵敏性
[0070]
将不同终浓度(0-105cfu/ml)的单增李斯特菌-van-bsa-sfe3o
4 nps重悬液滴于试纸条样品垫上，10min后，将试纸条放入dab+h2o2溶液中反应6min，用去离子水快速冲洗试纸条以终止反应，通过肉眼观察检测线显色情况。结果如图5。
[0071]
图5-a从左到右表示样本中单增李斯特菌液浓度分别为105、104、103、102、10、0cfu/ml,图5-b为单增李斯特菌与检测线信号强度的校准曲线，纵坐标代指检测线上的信号强度，横坐标代指单增李斯特菌液浓度的对数，从左到右依次为0、10、102、103、104、105cfu/ml。从5-a图可以看出，随着单增李斯特菌液浓度的逐步减小，检测线的信号强度也在随之降低。当样品中的单增李斯特菌液的浓度低于10cfu/ml时，检测线上无棕色条带出现，因此可以得出该试纸条的检出限为10cfu/ml。如图5-b所示，检测线上棕色条带的强度与单增李斯特菌的浓度成正比，可以用回归方程y＝763.17x+58.33(r2＝0.9951)来描述。以上结果表明，该纳米酶试纸条可用于食源性致病菌的定量和定性检测。
[0072]
综上，本发明通过制备捕捉-催化活性双功能的纳米酶探针，表达食源性致病菌噬菌体的尾丝蛋白，并添加到试纸条检测线上作为特异性识别物质，设计了一种可视化纸基层析传感器。本发明制备的检测技术不需要对微生物进行增殖，通过噬菌体直接识别特定致病菌，无需标记，并通过纳米酶催化提高灵敏度，不依赖仪器，通过可视化试纸条直接观察致病菌的检测结果。同时本发明建立了试纸条在食品致病菌检测中的应用体系，在食源性致病菌的快速、高灵敏度检测上具有非常大的空间。
[0073]
以上所述实施例仅为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。