HPLC分离核苷三磷酸和/或脱氧核苷三磷酸的方法与流程

hplc分离核苷三磷酸和/或脱氧核苷三磷酸的方法
技术领域
1.本发明涉及体外诊断原料质量检测技术领域，具体而言，涉及hplc分离核苷三磷酸和/或脱氧核苷三磷酸的方法。


背景技术：

2.核苷三磷酸(ntp)和脱氧核苷三磷酸(dntp)是核糖核酸合成以及脱氧核糖核酸合成的重要前体物质，为了保证ntp以及dntp在研发和生产的质量控制，十分有必要开发一种能够快速辨别腺苷-5
′‑
三磷酸(atp)，胞苷-5
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三磷酸(ctp)，鸟苷-5
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三磷酸(gtp)，尿苷-5
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三磷酸(utp)以及2
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脱氧腺苷-5
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三磷酸(datp)，2
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脱氧胞苷-5
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三磷酸(dctp)，2
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脱氧鸟苷-5
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三磷酸(dgtp)，2
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脱氧胸苷-5
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三磷酸(dttp)，2
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脱氧尿苷-5
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三磷酸盐(dutp)的分析方法。现有技术cn 107505422 a公开了利用hplc将单磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、腺苷以及脱氧核苷酸进行一次性分离。然而该方法并不能针对多种核苷三磷酸或多种脱氧核苷三磷酸进行一次性分离。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种hplc分离核苷三磷酸和/或脱氧核苷三磷酸的方法。
4.目前，核苷酸或脱氧核苷酸的分离时间普遍较长，不利于应用于相关产品的研发；而色谱峰出峰时间过早又不利于杂质分离。有鉴于此，发明人提供了一种hplc分离核苷三磷酸和/或脱氧核苷三磷酸的方法。
5.本发明是这样实现的：
6.一种利用高效液相色谱分离核苷三磷酸和/或脱氧核苷三磷酸的方法，其包括如下步骤：
7.将待测样品进行hplc检测，流动相条件为：以磷酸三乙胺溶液和乙腈的混合液为流动相或以磷酸三乙胺溶液和甲醇的混合液为流动相进行洗脱；
8.待测样品选自腺苷-5
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三磷酸游离酸或其盐、胞苷-5
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三磷酸游离酸或其盐、鸟苷-5
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三磷酸游离酸或其盐和尿苷-5
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三磷酸游离酸或其盐中的任意一种或多种，和/或选自2
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脱氧腺苷-5
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三磷酸游离酸或其盐、2
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脱氧胞苷-5
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三磷酸游离酸或其盐、2
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脱氧鸟苷-5
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三磷酸游离酸或其盐、2
′‑
脱氧胸苷-5
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三磷酸游离酸或其盐和2
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脱氧尿苷-5
′‑
三磷酸游离酸或其盐中的任意一种或多种。
9.发明人发现，流动相选择磷酸三乙胺溶液和乙腈或甲醇，用c18色谱柱进行洗脱可实现在短时间内完全分离核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸。采用该方法获得的结果精密度高，稳定性好，重现性好，有利于对研发和生产产品的质量控制。通过方法学验证，结果证实本发明提供的方法专属性、检测限、定量限、耐用性良好，符合规定，由此表明本发明提供的检测方法适用于核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸的检测。
10.需要说明的是，待测样品中可能含有核苷三磷酸中的任意几种，例如2种，3种或4种的组合，也可能含有脱氧核苷三磷酸中的任意几种，例如2种，3种，4种或5种的组合，还有
可能同时含有核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸，例如同时含有2种，3种或4种核苷三磷酸与2种，3种，4种或5种脱氧核苷三磷酸。只要采用磷酸三乙胺溶液，乙腈和水作为流动相进行洗脱，进行hplc检测均在本发明的保护范围之内。
11.游离酸或其盐中的盐选自钠盐，锂盐，铵盐，三乙胺盐，三正丁胺盐中的一种或多种。
12.在本发明应用较佳的实施方式中，磷酸三乙胺溶液的浓度为0.01-1mol/l。
13.例如0.08mol/l、0.09mol/l、0.10mol/l、0.11mol/l、0.12mol/l。发明人发现，当磷酸三乙胺溶液在上述浓度范围内时，具有良好的分离效果。
14.在本发明应用较佳的实施方式中，磷酸三乙胺溶液的浓度为0.1mol/l。
15.在本发明应用较佳的实施方式中，磷酸三乙胺溶液的ph为6.0-8.0。在一种可选的实施方式中，磷酸三乙胺溶液的ph为6.8-7.0。例如ph选自6.8，6.9或7.0。尤其在ph为7.0时具有更优的核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸的分离检测效果。
16.在本发明应用较佳的实施方式中，hplc检测时采用的色谱柱为waters xbridge c18色谱柱或效能相当的色谱柱；待测样品的上样量为1-100μl，柱温为30℃-60℃，流速为0.5-1.5ml/min。
17.在一种可选的实施方式中，上述待测样品的进样量为5μl，柱温为35℃-40℃，流速为1.0-1.2ml/min。
18.上样量例如选自5-8μl或6-10μl。柱温为32-40℃，35-40℃或31-38℃。流速在上述条件下既能保证较高的分离效果，完全将待测物中的核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸分离，也能缩短分离时间，提高分离效率。
19.在本发明应用较佳的实施方式中，待测样品的上样量为5μl，柱温为35℃-40℃，流速为1.0-1.2ml/min。例如1.0ml/min，1.1ml/min或1.2ml/min。
20.流动相配比为：乙腈或甲醇比例为1-99％；磷酸三乙胺溶液比例为5％-99％。
21.在本发明应用较佳的实施方式中，梯度洗脱时的洗脱程序如下：
[0022][0023]
发明人发现在上述洗脱程序下具有良好的分离效果。
[0024]
在本发明应用较佳的实施方式中，hplc检测波长为250-280nm。在一种可选的实施方式中，hplc检测波长为254
±
2nm。
[0025]
本发明具有以下有益效果：
[0026]
本发明选择磷酸三乙胺溶液，乙腈或甲醇作为流动相，进行梯度洗脱可实现在短时间内完全分离核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸。采用该方法获得的结果精密度高，稳定性好，重现性好，有利于对研发和生产产品的质量控制。通过方法学验证，结果证实本发明提供的方法专属性、检测限、定量限、耐用性良好，符合规定，由此表明本发明提供的检测方法适用于核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸的检测。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0028]
图1为空白组采用磷酸三乙胺-乙腈梯度洗脱后的检测图谱；
[0029]
图2为针对核苷三磷酸采用磷酸三乙胺-乙腈梯度洗脱后的检测图谱；
[0030]
图3为针对脱氧核苷三磷酸采用磷酸三乙胺-乙腈梯度洗脱后的检测图谱；
[0031]
图4为针对核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸采用磷酸三乙胺-乙腈梯度洗脱后的检测图谱；
[0032]
图5为针对核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸采用磷酸三乙胺-甲醇梯度洗脱后的检测图谱；
[0033]
图6为空白组采用磷酸二氢钾-乙腈梯度洗脱后的检测图谱；
[0034]
图7为针对核苷三磷酸采用磷酸二氢钾-乙腈梯度洗脱后的检测图谱；
[0035]
图8为针对脱氧核苷三磷酸采用磷酸二氢钾-乙腈梯度洗脱后的检测图谱。
具体实施方式
[0036]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0037]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0038]
实施例1
[0039]
仪器：waters e2695高效液相色谱仪，配备2489紫外检测器，液相泵以及自动进样器。
[0040]
试剂：磷酸(色谱纯)，三乙胺(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，纯化水。
[0041]
磷酸三乙胺溶液的制备：量取13.9ml三乙胺加入到900ml纯化水中，然后加入磷酸调节ph为6.8-7.0，最后用纯化水定容至1l。
[0042]
色谱条件：waters xbridge c18(4.6
×
150mm.column，i.d.3.5μm)色谱柱或效能相当的色谱柱；进样体积为5μl；检测波长为254nm；乙腈为流动相a，0.1mol/l的磷酸三乙胺为流动相b，以流速为1.0ml/min，柱温为35℃进行梯度洗脱。
[0043]
表1为梯度洗脱程序
[0044][0045]
专属性鉴别试验(分析方法验证指导，中华人民共和国药典2020版四部9101)。按如下方法进行高效液相色谱分析。
[0046]
空白溶液为纯化水，将2.0mm atp，5.0mm ctp，2.0mm gtp，3.0mm utp混合，作为供试品溶液1；将2.0mm datp，3.0mm dctp，2.0mm dgtp，5.0mm dttp，3.0mm dutp混合，获得供试品溶液2。
[0047]
纯化水、供试品溶液1、供试品溶液2分别进样5μl，记录色谱图，分别参照图1，图2，图3。由色谱图可见，ntp以及dntp混样均能够在10min中实现完全分离，经计算相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5。
[0048]
实施例2
[0049]
与实施例1相比，区别仅在于：色谱柱批次不同，供试品不同，其余步骤和试剂相同。
[0050]
仪器：waters e2695高效液相色谱仪，配备2489紫外检测器，液相泵以及自动进样器。
[0051]
试剂：磷酸三乙胺溶液，乙腈(色谱纯)，纯化水。
[0052]
色谱条件：waters xbridge c18(4.6
×
150mm.column，i.d.3.5μm)色谱柱或效能相当的色谱柱；进样体积为10μl；检测波长为254nm；乙腈为流动相a，0.1mol/l的磷酸三乙胺溶液为流动相b，以流速为1.0ml/min，柱温为35℃进行梯度洗脱。
[0053]
表1为梯度洗脱程序
[0054][0055]
专属性鉴别试验(分析方法验证指导，中华人民共和国药典2020版四部9101)。按
如下方法进行高效液相色谱分析。
[0056]
空白溶液为纯化水，将2.0mm atp，5.0mm ctp，2.0mm gtp，3.0mm utp；2.0mm datp，3.0mm dctp，2.0mm dgtp，5.0mm dttp，3.0mm dutp混合，获得供试品溶液3。
[0057]
纯化水、供试品溶液3分别进样10μl，记录色谱图，参照图4。由色谱图可见，ntp和dntp混样均能够在10min中实现完全分离，经计算相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5。
[0058]
实施例3
[0059]
与实施例1相比，区别仅在于：色谱条件不同，其余步骤和试剂相同。
[0060]
色谱条件如下：waters xbridge c18(4.6
×
150mm.column，i.d.3.5μm)色谱柱；进样体积为8μl；检测波长为254nm；乙腈为流动相a，0.1mol/l的磷酸三乙胺为流动相b，以流速为1.0ml/min，柱温为30℃进行梯度洗脱。
[0061]
实施例4
[0062]
与实施例1相比，区别仅在于：色谱条件不同，其余步骤和试剂相同。
[0063]
色谱条件如下：waters xbridge c18(4.6
×
150mm.column，i.d.3.5μm)色谱柱；进样体积为10μl；检测波长为254nm；乙腈为流动相a，0.12mol/l的磷酸三乙胺为流动相b，以流速为1.0ml/min，柱温为40℃进行梯度洗脱。
[0064]
实施例5
[0065]
与实施例2相比，区别仅在于：流动相中的乙腈换为甲醇，其余步骤和试剂相同。
[0066]
仪器：waters e2695高效液相色谱仪，配备2489紫外检测器，液相泵以及自动进样器。
[0067]
试剂：磷酸三乙胺溶液，甲醇(色谱纯)，纯化水。
[0068]
色谱条件：waters xbridge c18(4.6
×
150mm.column，i.d.3.5μm)色谱柱或效能相当的色谱柱；进样体积为10μl；检测波长为254nm；甲醇为流动相a，0.1mol/l的磷酸三乙胺溶液为流动相b，以流速为1.0ml/min，柱温为35℃进行梯度洗脱。
[0069]
表1为梯度洗脱程序
[0070][0071][0072]
专属性鉴别试验(分析方法验证指导，中华人民共和国药典2020版四部9101)。按如下方法进行高效液相色谱分析。
[0073]
空白溶液为纯化水，将2.0mm atp，5.0mm ctp，2.0mm gtp，3.0mm utp；2.0mm datp，3.0mm dctp，2.0mm dgtp，5.0mm dttp，3.0mm dutp混合，获得供试品溶液3。
[0074]
纯化水、供试品溶液3分别进样10μl，记录色谱图，参照图5。由色谱图可见，ntp和dntp混样能够实现完全分离，经计算相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5。
[0075]
对比例1
[0076]
仪器：waters e2695高效液相色谱仪，配备2489紫外检测器，液相泵以及自动进样器。
[0077]
试剂：磷酸二氢钾(分析纯)，氢氧化钠(分析纯)，乙腈(色谱纯)，纯化水。
[0078]
色谱条件：waters xbridge c18(4.6
×
150mm.column，i.d.3.5μm)色谱柱；进样体积为5μl；检测波长为254nm；乙腈为流动相a，0.03mol/l的磷酸盐溶液(ph值为6.8)为流动相b，以流速为1.0ml/min，柱温为35℃进行梯度洗脱。
[0079]
梯度洗脱程序如下：
[0080][0081][0082]
空白溶液为纯化水，2.0mm atp，5.0mm ctp，2.0mm gtp，3.0mm utp混合，作为供试品溶液1；2.0mm datp，3.0mm dctp，2.0mm dgtp，5.0mm dttp，3.0mm dutp混合，获得供试品溶液2。
[0083]
纯化水、供试品溶液1、供试品溶液2分别进样5μl，记录色谱图，分别参照图6，图7，图8。由色谱图可见，4种核苷三磷酸混样和5种脱氧核苷三磷酸混样无法实现完全分离。
[0084]
由此可见，选择磷酸三乙胺-乙腈梯度洗脱程序可实现在短时间内完全分离核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸。
[0085]
实验例1
[0086]
本发明对实施例1提供的磷酸三乙胺-乙腈梯度洗脱的分析方法进行了方法学验证，结果表明本方法的专属性、检测限、定量限以及耐用性良好，该方法适用于核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸的检测，验证数据总结如下：
[0087]
验证数据汇总表。
[0088]
[0089][0090]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。