一种用蛋白组学技术鉴定冷鲜猪肉辐照异味来源的方法

1.本发明属于辐照保鲜技术领域，具体涉及一种用蛋白组学技术鉴定冷鲜猪肉辐照异味来源的方法。


背景技术：

2.电子束辐照是电离辐射的一种，是利用电子加速器产生的电子束辐照食品产生的物理化学效应，杀菌灭虫、达到食品保鲜的目的。与传统的食品保鲜方式相比，不存在化学残留和放射性污染等问题，是一种绿色食品保鲜加工技术。电子束辐照技术现已广泛应用于肉品保鲜，可以有效地杀灭冷鲜肉制品中致病微生物，提高肉品品质，同时还可以替代部分着色剂亚硝酸盐的作用，达到保色与防腐的双重目的，是目前冷鲜肉制品较好的保鲜技术，然而到目前为止辐照技术在肉类食品中的应用却还受到很大程度的限制。其原因在于辐照处理在杀死肉品中微生物的同时，也会使肉品产生辐照异味和色泽劣变，这在很大程度上会影响消费者对辐照肉类食品的接受程度。目前，国内外学者大多对电子束辐照对生鲜食品杀菌保鲜效果及感官品质的影响进行了研究，但对异味产生途径及控制技术的研究较少。
3.冷鲜肉品在屠宰、分割及加工中易受到沙门氏菌、大肠杆菌和李氏杆菌等致病菌的污染。电子束辐照技术作为一种冷杀菌技术，可以有效杀灭冷鲜肉品中的致病微生物，延长保质期，因而在肉制品加工中应用前景巨大。但是，辐照处理肉品时会由于其强电离作用，在杀死肉品中微生物的同时，肉品的理化及感官品质也发生明显变化，如产生辐照异味、色泽及蛋白质变性等变化，这成为制约辐照技术在肉制品加工领域应用的关键因素。国内外研究发现，辐照异味的产生主要是因为辐照过程中水的主要辐照降解产物羟自由基会进攻食品中的蛋白质和脂肪组分，加速氧化从而产生异味。在肉制品中，辐照异味可能主要来源于脂肪氧化产生的一些醛类化合物以及蛋白质中含硫氨基酸氧化产生的硫化物。研究还发现引起肉品辐照气味的挥发性化合物主要由含硫氨基酸经辐射分解产生，辐照导致的蛋白质侧链氧化或断裂都是形成肉品辐照味的重要反应。目前，有关肉品在辐照过程中蛋白质降解形成的挥发性风味物质已有大量报道，但是引起辐照异味来源的相关信息较少。


技术实现要素：

4.针对冷鲜猪肉辐照异味产生的问题，本发明提供了一种鉴定冷鲜猪肉辐照异味产生来源的蛋白组学方法，以冷鲜猪肉为材料，采用电子加速器对冷鲜肉样品进行辐照处理，利用tmt标记定量蛋白组学技术鉴定与辐照异味相关的差异表达蛋白，揭示与辐照异味相关的核心蛋白及代谢途径。该方法既能鉴定冷鲜肉辐照前后的差异表达蛋白，也能得到差异蛋白主要参与的生物过程，找出与辐照后风味变化相关的差异蛋白及其代谢途径。对于开发制订冷鲜肉品辐照过程中风味品质的控制技术具有重要的指导价值。
5.本发明的技术方案如下：一种用蛋白组学技术鉴定冷鲜猪肉辐照异味来源的方法，包括以下步骤：
（1）冷鲜肉辐照处理：冷鲜里脊肉，剔除结缔组织，辐照处理，真空包装；（2）蛋白提取：称取绞碎的辐照前后放入肉样，加入液氮充分研磨至粉末，加入裂解缓冲液，超声裂解；离心去除细胞碎片，测定上清液中蛋白浓度；（3）胰酶酶解：步骤（2）的蛋白加入预冷丙酮，混匀后沉淀；离心后晾干，加入四乙基溴化铵，超声打散，加入胰蛋白酶酶解；加二硫苏糖醇还原，室温避光孵育；（4）tmt标记：肽段溶解，与tmt标记试剂混合后室温孵育，除盐，真空冷冻干燥；（5）hplc分级：肽段用高ph反相hplc分级，真空冷冻干燥；（6）液质联用分析：采用液相色谱溶解分离步骤（5）的肽段，注入离子源中进行电离，然后进质谱进行分析；（7）差异蛋白筛选及生信分析：用maxquant对质谱检测结果进行检索分析，数据库为uniprot中的猪数据库，并对差异蛋白进行生信分析。
6.优选地，所述步骤（2）中的裂解缓冲液为1% sds和1%蛋白酶抑制剂。
7.优选地，步骤（3）沉淀的条件为：加入4倍体积的预冷丙酮，于小于等于-20℃条件下沉淀2 h以上。
8.优选地，步骤（3）加二硫苏糖醇还原的过程为：加二硫苏糖醇使其终浓度为5 mm，于50-60℃条件下还原20-40 min，室温避光孵育10-20 min。
9.优选地，步骤（4）肽段溶解采用的是乙腈或三乙胺-碳酸缓冲溶液。
10.优选地，所述步骤（5）分级的过程为：60 min分离60个组分，随后肽段合并为9个组分。
11.采用上述方法得到的冷鲜猪肉辐照异味的来源为：参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径的蛋白是引起辐照后冷鲜猪肉异味的蛋白。
12.本发明的有益效果本发明以冷鲜猪肉为材料，采用电子加速器对冷鲜肉样品进行辐照处理，为探究辐照异味的来源，先后将蛋白提取、酶解、还原后，利用tmt标记定量蛋白组学技术鉴定与辐照异味相关的差异表达蛋白，揭示与辐照异味相关的核心蛋白及代谢途径。此方法对于开发制订冷鲜肉品辐照过程中风味品质的控制技术具有重要的指导价值；对于改善消费者对辐照冷鲜肉品的接受性，为突破冷鲜肉品辐照商业化应用的技术瓶颈提供理论依据。
具体实施方式
13.实施例1一种用蛋白组学技术鉴定冷鲜猪肉辐照异味来源的方法，包括以下步骤：(1) 冷鲜肉辐照处理：新鲜的冷鲜猪里脊肉剔除可见的筋腱、筋膜等结缔组织，将其分割成约7 cm
×
5 cm
×
1.5 cm大小的肉块，用聚乙烯包装袋真空包装。真空包装参数为：抽气30 s，热封15 s，放气1.2 s，抽气压强为0.1 mpa。真空包装后将样品随机分成2组，每组6袋，置于4
±
1℃冰箱中，待辐照。电子束辐照剂量设为0和9.0 kgy，能量和功率设为10 mev和10 kw。为了精确确定目标辐照剂量，用重铬酸银剂量计对各剂量进行监测。样品平铺排列，正反辐照以保证辐照均匀。辐照后将标记好的样品放入4
±
1℃冰箱中贮藏备用。
14.(2) 蛋白提取：称取1 g绞碎均匀的肉样于液氮预冷的研钵中，加入液氮充分研磨至粉末，加入4倍体积裂解缓冲液（1% sds，1%蛋白酶抑制剂），超声裂解。于4℃，10000 r/
min条件下离心10 min，上清液转移至新的离心管，利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。
15.(3) 胰酶酶解：取辐照前后蛋白进行酶解，加入适量标准蛋白。加入4倍体积的预冷丙酮，于-20℃条件下沉淀3 h。以4500 g离心5 min，弃上清，晾干沉淀后加入终浓度200 mm的四乙基溴化铵，用超声打散沉淀，加入胰蛋白酶，酶解过夜。加二硫苏糖醇使其终浓度为5 mm，于56℃条件下还原30 min，室温避光孵育15 min。
16.(4) tmt标记：标记试剂解冻后用四乙基溴化铵溶解，与胰酶酶解的肽段混合后室温孵育2 h，标记后的肽段混合后用strata x c18除盐，再进行真空冷冻干燥。
17.(6) 液质联用分析：用流动相a(含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解肽段，流动相b为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。离子源为nsi，电压设置为2.1 kv；肽段分离后被注入离子源中进行电离然后进q exactive
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hf-x质谱进行分析。
18.(7) 差异蛋白筛选及生信分析：用maxquant对质谱检测结果进行检索分析，数据库为uniprot中的猪数据库，并对差异蛋白进行生信分析。
19.实施例2一种用蛋白组学技术鉴定冷鲜猪肉辐照异味来源的方法，包括以下步骤：(1) 冷鲜肉辐照处理：新鲜的冷鲜猪里脊肉剔除可见的筋腱、筋膜等结缔组织，将其分割成约7 cm
×
5 cm
×
1.5 cm大小的肉块，用聚乙烯包装袋真空包装。真空包装参数为：抽气30 s，热封15 s，放气1.2 s，抽气压强为0.1 mpa。真空包装后将样品随机分成2组，每组6袋，置于4
±
1℃冰箱中，待辐照。电子束辐照剂量设为0和9.0 kgy，能量和功率设为10 mev和10 kw。为了精确确定目标辐照剂量，用重铬酸银剂量计对各剂量进行监测。样品平铺排列，正反辐照以保证辐照均匀。辐照后将标记好的样品放入4
±
1℃冰箱中贮藏备用。
20.(2) 蛋白提取：称取1 g绞碎均匀的肉样于液氮预冷的研钵中，加入液氮充分研磨至粉末，加入4倍体积裂解缓冲液（1% sds，1%蛋白酶抑制剂），超声裂解。于4℃，12000 g条件下离心10 min，上清液转移至新的离心管，利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。
21.(3) 胰酶酶解：取辐照前后蛋白进行酶解，加入适量标准蛋白。加入4倍体积的预冷丙酮，于-20℃条件下沉淀2 h。以4500 g离心5 min，弃上清，晾干沉淀后加入终浓度200 mm的四乙基溴化铵，用超声打散沉淀，加入胰蛋白酶，酶解过夜。加二硫苏糖醇使其终浓度为5 mm，于50℃条件下还原40 min，室温避光孵育20 min。
22.(4) tmt标记：标记试剂解冻后用四乙基溴化铵溶解，与胰酶酶解的肽段混合后室温孵育2 h，标记后的肽段混合后用strata x c18除盐，再进行真空冷冻干燥。
23.(6) 液质联用分析：用流动相a(含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解肽段，流动相b为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。离子源为nsi，电压设置为2.1 kv；肽段分离后被注入离子源中进行电离然后进q exactive
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hf-x质谱进行分析。
24.(7) 差异蛋白筛选及生信分析：用maxquant对质谱检测结果进行检索分析，数据库为uniprot中的猪数据库，并对差异蛋白进行生信分析。
25.实施例3一种用蛋白组学技术鉴定冷鲜猪肉辐照异味来源的方法，包括以下步骤：(1) 冷鲜肉辐照处理：新鲜的冷鲜猪里脊肉剔除可见的筋腱、筋膜等结缔组织，将其分割成约7 cm
×
5 cm
×
1.5 cm大小的肉块，用聚乙烯包装袋真空包装。真空包装参数为：抽气30 s，热封15 s，放气1.2 s，抽气压强为0.1 mpa。真空包装后将样品随机分成2组，每
组6袋，置于4
±
1℃冰箱中，待辐照。电子束辐照剂量设为0和9.0 kgy，能量和功率设为10 mev和10 kw。为了精确确定目标辐照剂量，用重铬酸银剂量计对各剂量进行监测。样品平铺排列，正反辐照以保证辐照均匀。辐照后将标记好的样品放入4
±
1℃冰箱中贮藏备用。
26.(2) 蛋白提取：称取1 g绞碎均匀的肉样于液氮预冷的研钵中，加入液氮充分研磨至粉末，加入4倍体积裂解缓冲液（1% sds，1%蛋白酶抑制剂），超声裂解。于4℃，12000 g条件下离心10 min，上清液转移至新的离心管，利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。
27.(3) 胰酶酶解：取辐照前后蛋白进行酶解，加入适量标准蛋白。加入4倍体积的预冷丙酮，于-20℃条件下沉淀2 h。以4500 g离心5 min，弃上清，晾干沉淀后加入终浓度200 mm的四乙基溴化铵，用超声打散沉淀，加入胰蛋白酶，酶解过夜。加二硫苏糖醇使其终浓度为5 mm，于60℃条件下还原20 min，室温避光孵育10 min。
28.(4) tmt标记：标记试剂解冻后用四乙基溴化铵溶解，与胰酶酶解的肽段混合后室温孵育2 h，标记后的肽段混合后用strata x c18除盐，再进行真空冷冻干燥。
29.(6) 液质联用分析：用流动相a(含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解肽段，流动相b为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。离子源为nsi，电压设置为2.1 kv；肽段分离后被注入离子源中进行电离然后进q exactive
™ꢀ
hf-x质谱进行分析。
30.(7) 差异蛋白筛选及生信分析：用maxquant对质谱检测结果进行检索分析，数据库为uniprot中的猪数据库，并对差异蛋白进行生信分析。
31.具体结果分析如下：(1)差异表达蛋白的筛选根据差异倍数（fold change）和p值进行差异表达蛋白的筛选，筛选条件为“fold change＞1.3或小于1/1.3，p＜0.05”，共筛选出31个差异表达蛋白，包含11个上调蛋白和20个下调蛋白，如表1所示。
32.(2)与辐照异味有关的核心蛋白本方法共鉴定出31个与风味相关的蛋白，差异表达蛋白主要富集的通路是蛋白酶体、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢。其中可能与风味相关的蛋白有31种，主要是结构蛋白和代谢酶，与辐照异味相关的核心蛋白是：mdh1、ldhb、got1、cat、aldh9a1、psma4、psmb7、psmb6、prorp、psmb3、tnnt3、tpm2、neb、myh4、ckm、myh7b等，其中参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢的蛋白是引起辐照后冷鲜猪肉异味的主要蛋白，而与蛋白酶体相关的蛋白及结构蛋白间接导致了辐照异味的增强。
33.表1 辐照(9 kgy)冷鲜猪肉中的异味相关蛋白