一种基于磷光共振能量转移用于特异性检测信使RNA的磷光生物传感器的制备及应用

本发明属于分析化学检测，具体涉及一种基于磷光共振能量转移用于特异性检测信使rna的磷光生物传感器的制备方法及其应用。

背景技术：

1、荧光生物传感器能够以高空间和时间分辨率对离子、小分子、酶、蛋白和核酸进行成像和量化。这些检测往往需要在复杂生物样品中进行，如：血清、细胞裂解液、细胞质和细胞器等。因此，有效避免复杂生物样品中的干扰是有必要的。此外，传统的光学试剂，如有机荧光探针[feng chen,qiujun lu,youyu zhang, shouzhuo yao.sensors and actuatorsb chemical,2019,297,126751.]和无机荧光纳米粒子[shenghao xu,yongyin nie,lipingjiang,jun wang,guiyun xu,wei wang, xiliang luo.analytical chemistry,2018,90(6),4039–4045.]，往往会受到自发荧光、光漂白或光毒性的干扰[shira roth,orrhadass,meir cohen,jasenka verbarg, jennifer wilsey,amos danielli.small,2019,15(3),1803751.]。因此，迫切需要开发出不同的光学传感器，以便于更好的对分析物进行灵敏准确的检测，本发明将 pda作为能量受体和dna探针载体构建一种磷光生物传感器提高检测的选择性、灵敏度和抗干扰能力。

2、持久发光纳米粒子(pl)是一种特殊的发光材料，其中的空穴可以有效储存激发能量，并在激发能量结束一段时间后以持续发光的形式缓慢发出。wang等开发了一种磷光适体传感器，用于检测食品样品中的卡那霉素，所提出的适体传感器被证明可以有效消除来自食品基质的干扰，在复杂样品中仍可以选择性、灵敏和无自发荧光的检测分析物[bei-bei wang,xu zhao,li-jian chen,cheng yang, xiu-ping yan.analytical chemistry,2021,93(4),2589-2595.]。设计的无自发荧光传感平台可以对目标物显示出高选择性和优异的发光性能。尽管，持久发光纳米粒子的应用已经十分广泛，但是构建一种用于检测复杂生物样品中的肿瘤标志物的磷光生物传感器仍然面临着巨大挑战。

3、本发明选择pl作为信号输出、pda作为磷光受体和dna探针载体构建了磷光传感器用于肿瘤标志物tk1 mrna灵敏和特异性检测。pl的持续发光能够消除外界环境带来的干扰，提高了该传感器的检测性能。结果表明，本发明构建的传感器具有高选择性、高灵敏度、低检测限、宽线性等优点，对于肿瘤标志物的高特异性识别和分析检测具有重要的意义和实际应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于磷光共振能量转移用于特异性检测信使rna 的磷光生物传感器的制备方法，并将所述传感器应用于血清中tk1 mrna的特异性检测。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现。

3、一种基于磷光共振能量转移用于特异性检测信使rna的磷光生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于以下合成步骤：

4、(1)pda的制备：将0.018g多巴胺单体溶解在9ml 50℃超纯水中并持续搅拌。随后，将76μl的1.0m naoh快速注入溶液中，并在黑暗中缓慢搅拌5 小时以引发单体聚合。最终溶液以10000rpm离心10分钟，收集产物。将产物在50℃下真空干燥，留待后用。

5、(2)pl的制备：首先将naoh与二氧化锗以2：1物质的量在室温下搅拌至混合液呈透明得到锗酸钠前体溶液。将1ml 2m硝酸锌和0.005mm的硝酸锰溶于10ml超纯水中，在剧烈搅拌下向混合液中加入300μl hno3(68％，wt)，并缓慢滴加1ml 1m的锗酸钠前体溶液。随后，快速向上述溶液中添加氨水，在剧烈搅拌下将ph调至9.5，继续在室温下搅拌孵育60min。随后，将上述混合溶液转移至50ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中并在220℃下继续反应4h。冷却至室温后以10000rpm离心收集化合物，水洗3次后干燥，得到纯净的持久发光纳米粒子(pl)。

6、(3)pl-nh2的制备：称取25mg pl在10ml 5mm的氢氧化钠溶液中剧烈搅拌过夜，离心收集固体并分散于10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，剧烈搅拌下加入200μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在80℃下反应24h。反应完成后的产物通过离心收集，并用dmf洗涤三次，干燥备用，得到氨基修饰的持久发光纳米粒子(pl-nh2)。

7、(4)dna链修饰的持久发光纳米粒子(pl-dna)的制备：首先，将羧基修饰的dna链(i-dna)进行活化，向350μl ph＝5.0的酸性的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲体系中加入50μl 10μm的1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和50μl 2μm的i-dna，在37℃下震荡活化1h，再向其中加入50μl 5mg/ml的pl-nh2和0.001g的n-羟基丁二酰亚胺(nhs)在37℃继续震荡反应 4h，用缓冲液将反应完的粒子清洗3次并重悬于250μl的缓冲液中并于4℃保存留待后用，得到了1mg/ml的pl-dna。

8、(5)磷光生物传感器的制备：取1mg的pda粒子分散在1ml的tris-hcl 缓冲液中，取10μl上述pda溶液并与20μl 10μm的发夹链(h)和底物链(s- 15a)链(1：1)混合，在室温下轻轻震荡1h，并通过离心将未反应完的dna链去掉，此时，制备了pda-dna探针。再将100μl1mg/ml的pl-dna加入到离心后的固体中，在37℃下静置1h。最后将混合物离心以除去未反应的dna链，将固体重悬于100μl的缓冲液中，以成功制备磷光生物传感器。

9、磷光检测条件设置为：激发波长：240nm，发射波长：535nm，激发狭缝： 10nm，发射狭缝：20nm。

技术特征：

1.一种基于磷光共振能量转移用于特异性检测信使rna的磷光生物传感器的制备方法及其应用，其特在于以下合成步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于磷光共振能量转移用于特异性检测信使rna的磷光生物传感器，其特征在于淬灭pl的pda浓度为：10μg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种基于磷光共振能量转移用于特异性检测信使rna的磷光生物传感器，其特征在于磷光检测条件设置为：

技术总结
本发明提供了一种特异性检测信使RNA的磷光生物传感器的制备方法。在本发明中，利用聚多巴胺(PDA)与持久发光纳米粒子(PL)之间的磷光共振能量转移(PRET)构建了磷光生物传感器。该传感器包含了PDA粒子载体三种核酸链：一种是与目标物TK1mRNA互补结合的发夹链(H)，一种是与持久发光纳米粒子通过酰胺键结合的DNA链(PL‑DNA)，还有一种是与PL‑DNA互补的底物链(S‑15A)。无目标物时。PL的磷光被PDA吸收造成信号较弱；加入目标物后，目标物打开H，暴露出的柔性末端将PL‑DNA从S‑15A上置换下来，PL远离PDA造成PRET关闭，磷光信号回升，且磷光信号随着目标物浓度的增大而增强，在0‑200nM呈线性关系。此发明的检测限为1.74nM。

技术研发人员：蔡昌群,姚淑芬,赵晓佳,龚行
受保护的技术使用者：湘潭大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15