精子唾液酸酶1/3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法与流程

1.本技术涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种精子唾液酸酶1/3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法。


背景技术：

2.随着社会的不断发展，不育夫妇越来越多，全球不育夫妇占已婚夫妇10％-15％。据统计，男性生殖能力异常的比例不低于50％。传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。多年来，临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原因不育症。常规精液分析只测定精子的数量，存活力，活动率和形态。这些指标只能反映最基本的精液质量，不能反映所有的精子功能。


技术实现要素：

3.本技术提供了一种精子唾液酸酶1/3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法，其能够快速检测精液中精子唾液酸酶neu1或neu3的表达水平。
4.本技术的实施例是这样实现的：
5.在第一方面，本技术示例提供了一种精子唾液酸酶1/3检测试剂盒，其包括：固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液。
6.抗体液包括生物素化抗体neu1或生物素化抗体neu3。
7.在上述技术方案中，本技术的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒能够建立免疫流式间接标记法，其具有特异性强及较高的灵敏度，能对精液中精子唾液酸酶neu1或neu3的表达水平进行检测。同时，本技术的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒检测准确性高，且具有快速和单次检测量大的特点。
8.结合第一方面，在本技术的第一方面的第一种可能的示例中，上述抗体液中生物素化抗体neu1或生物素化抗体neu3浓度为5～10mg/l。
9.结合第一方面，在本技术的第一方面的第二种可能的示例中，上述荧光探针液包括r-藻红蛋白标记链霉亲和素。
10.可选地，荧光探针液中r-藻红蛋白标记链霉亲和素的浓度为4～8mg。
11.在上述示例中，本技术的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒采用生物素化抗体与r-藻红蛋白标记链霉亲和素结合，利用级联放大的反应原理，增强了反应灵敏度，降低非特异性干扰。
12.结合第一方面，在本技术的第一方面的第三种可能的示例中，满足以下条件a～f中的至少一项：
13.a、固定液包括磷酸二氢钠、磷酸氢钠、多聚甲醛和水。
14.b、缓冲液包括磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
15.c、通透液包括聚乙二醇辛基苯基醚、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
16.d、封闭液包括牛血清白蛋白、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
17.e、清洗液包括吐温20、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
18.f、抗体液包括牛血清白蛋白、水以及生物素化抗体neu1或生物素化抗体neu3；
19.g、荧光探针液包括牛血清白蛋白、r-藻红蛋白标记链霉亲和素和水。
20.第二方面，本技术示例提供了上述精子唾液酸酶1/3检测试剂盒的制备方法，其包括：分别制备固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液，然后将固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液分装后组装成精子唾液酸酶1/3检测试剂盒。
21.在上述技术方案中，本技术的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒的制备方法简便，且制得的固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液均分装后再组装，在使用时可以根据不同的步骤选取不同的试剂。
22.第三方面，本技术示例提供了利用上述的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法，其包括：取精液样品，采用清洗液对精液样品进行第一次洗涤处理制得第一样品液，采用固定液对第一样品液进行固定处理制得第二样品液，采用通透液对第一样品进行通透处理制得第三样品液，采用清洗液对第三样品液进行第二次洗涤处理制得第四样品液，采用封闭液对第四样品液进行封闭处理制得第五样品液，在第五样品液中加入抗体液并经第一次孵育处理制得第六样品液，采用清洗液对第六样品液进行第三次洗涤处理制得第七样品液，在第七样品液中加入荧光探针液并经第二次孵育处理制得第八样品液，采用清洗液对第八样品液进行第四次洗涤处理制得第九样品液，采用流式细胞仪检测第九样品液中精子唾液酸酶neu1或neu3的表达水平。
23.在上述技术方案中，本技术检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法比较简便且快速，准确性高。
24.结合第三方面，在本技术的第三方面的第一种可能的示例中，上述封闭处理包括在第四样品液中加入封闭液，静止30～40min，然后离心去除上清液。
25.结合第三方面，在本技术的第三方面的第二种可能的示例中，上述第一次孵育处理包括在第五样品液中加入抗体液，在18～30℃下孵育2～2.5h，然后离心去除上清液。
26.结合第三方面，在本技术的第三方面的第三种可能的示例中，上述第二次孵育处理包括在第七样品液中加入荧光探针液，在18～30℃下孵育1～1.5h，然后离心去除上清液。
27.结合第三方面，在本技术的第三方面的第四种可能的示例中，在上机检测前，在第九样品液中加入缓冲液。
附图说明
28.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
29.图1为本技术对照组1的第一流式检测散点图；
30.图2为本技术对照组1的第二流式检测散点图；
31.图3为本技术对照组1的流式检测直方图；
32.图4为本技术对照组2的第一流式检测散点图；
33.图5为本技术对照组2的第二流式检测散点图；
34.图6为本技术对照组2的流式检测直方图；
35.图7为本技术实施例1的第一流式检测散点图；
36.图8为本技术实施例1的第二流式检测散点图；
37.图9为本技术实施例1的流式检测直方图；
38.图10为本技术实施例2的第一流式检测散点图；
39.图11为本技术实施例2的第二流式检测散点图；
40.图12为本技术实施例2的流式检测直方图；
41.图13为本技术对比例1的第一流式检测散点图；
42.图14为本技术对比例1的第二流式检测散点图；
43.图15为本技术对比例1的流式检测直方图；
44.图16为本技术对比例2的第一流式检测散点图；
45.图17为本技术对比例2的第二流式检测散点图；
46.图18为本技术对比例2的流式检测直方图；
47.图19为本技术对比例3的第一流式检测散点图；
48.图20为本技术对比例3的第二流式检测散点图；
49.图21为本技术对比例3的流式检测直方图；
50.图22为本技术对比例4的第一流式检测散点图；
51.图23为本技术对比例4的第二流式检测散点图；
52.图24为本技术对比例4的流式检测直方图；
53.图25为本技术对比例5的第一流式检测散点图；
54.图26为本技术对比例5的第二流式检测散点图；
55.图27为本技术对比例5的流式检测直方图；
56.图28为本技术对比例6的第一流式检测散点图；
57.图29为本技术对比例6的第二流式检测散点图；
58.图30为本技术对比例6的流式检测直方图；
59.图31为本技术对比例7的第一流式检测散点图；
60.图32为本技术对比例7的第二流式检测散点图；
61.图33为本技术对比例7的流式检测直方图；
62.图34为本技术对比例8的第一流式检测散点图；
63.图35为本技术对比例8的第二流式检测散点图；
64.图36为本技术对比例8的流式检测直方图。
具体实施方式
65.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本技术，而不应视为限制本技术的范围。实施例中未注明具体
条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
66.以下针对本技术实施例的一种精子唾液酸酶1/3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法进行具体说明：
67.本技术实施例提供一种精子唾液酸酶1/3检测试剂盒，其包括固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液。
68.固定液包括磷酸二氢钠、磷酸氢钠、多聚甲醛(pfa)和水。
69.可选地，固定液中多聚甲醛的浓度为35～45g/l，磷酸二氢钠的浓度为0.015～0.02mol/l，磷酸氢钠的浓度为0.13～0.14mol/l。
70.可选地，固定液的ph值为7.0～7.4。
71.缓冲液包括磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
72.可选地，缓冲液中磷酸氢钠的浓度为0.15～0.17mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.035～0.04mol/l，氯化钠的浓度为0.15～0.16mol/l。
73.可选地，缓冲液的ph值为7.2～7.4。
74.通透液包括聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
75.可选地，通透液中聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.8～1.2ml/l，磷酸二氢钠的浓度为0.005～0.0056mol/l，磷酸氢钠的浓度为0.00117～0.00133mol/l，氯化钠的浓度为0.005～0.0053mol/l。
76.封闭液包括牛血清白蛋白(bsa)、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
77.可选地，封闭液中牛血清白蛋白的浓度为10～14g/l，磷酸二氢钠的浓度为0.005～0.0056mol/l，磷酸氢钠的浓度为0.00117～0.00133mol/l，氯化钠的浓度为0.005～0.0053mol/l。
78.清洗液包括吐温20(tween 20)、磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠和水。
79.可选地，清洗液中吐温20的浓度为0.8～1.2ml/l，磷酸二氢钠的浓度为0.005～0.0056mol/l，磷酸氢钠的浓度为0.00117～0.00133mol/l，氯化钠的浓度为0.005～0.0053mol/l。
80.抗体液包括牛血清白蛋白、水以及生物素化抗体neu1或生物素化抗体neu3。
81.生物素化抗体neu1或生物素化抗体neu3的制备方法如下：
82.s1、抗原制备
83.neu1基因的基因序列：
84.nm_000434.3homo sapiens neuraminidase 1(neu1),mrna
85.gagctacttgaagaccaattagagtccgggaagcgcggcggggcctccagaccggggcgggcttaagggtgacatctgcgctttaaagggtccgggtcagctgactcccgactctgtggagtctagctgccagggtcgcggcagctgcggggagagatgactggggagcgacccagcacggcgctcccggacagacgctgggggccgcggattctgggcttctggggaggctgtagggtttgggtgtttgccgcgatcttcctgctgctgtctctggcagcctcctggtccaaggctgagaacgacttcggtctggtgcagccgctggtgaccatggagcaactgctgtgggtgagcgggagacagatcggctcagtggacaccttccgcatcccgctcatcacagccactccgcggggcactcttctcgcctttgctgaggcgaggaaaatgtcctcatccgatgagggggccaagttcatcgccctgcggaggtccatggaccagggcagcacatggtctcctacagcg
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97.aaaatctgactttggcaaatcaaatcctcttttccttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaa
98.蛋白neu1(一共415aas)：
99.》sp|q99519|neur1_human sialidase-1os＝homo sapiens ox＝9606gn＝neu1pe＝1sv＝1
100.mtgerpstalpdrrwgprilgfwggcrvwvfaaiflllslaaswskaendfglvqplvtmeqllwvsg
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105.wsfsngtswrketvqlwpgpsgysslatlegsmdgeeqapqlyvlyekgrnhytesisvakisvygtl
106.neu3基因的基因序列：
107.》nm_006656.5homo sapiens neuraminidase 3(neu3),mrna
108.cttttcgttgccgttacctgtttccggcagtcgacacgctcttcgcttctcggggcttgtctccgtgtcc
109.tccgtctcagttgtttctccctctctatcctcctctgtctcagtctccccagccttggggccggtgcctc
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129.ctctagacccccagatctcagaatcaggcctatttgtgtaggcccatggaaatcactacttgtgaagtag
130.agatgcctttttgtctaa
131.蛋白neu3(一共461aas)：
132.》sp|q9uq49-2|neur3_human isoform 2of sialidase-3 os＝homo sapiens ox＝9606 gn＝neu3
133.mrpadlpprpmeespasssapteteepgssaevmeevttcsfnsplfrqeddrgityripallyippthtfla
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139.qeceqiafrlfthreilshlqgdctspgrnpsqfksn
140.设计引物，构建ppic9k的表达载体的表达载体，构建完成后，测序结果100％正确无突变，进入小试验证，尽量通过助溶标签和温度诱导的方案实现分泌表达，采用金属螯合镍柱进行亲和层析，纯化蛋白。
141.s2、抗原质控
142.sds-page检测，一般免疫8～10只小鼠，蛋白纯度至少在80％以上。
143.s3、小鼠免疫
144.表1小鼠免疫
145.日期内容免疫剂量每个抗原免疫小鼠数量佐剂类型免疫部位首免neu1或neu3一免100ug/只5佛氏佐剂皮下两周后二免50ug/只5佛氏佐剂皮下三周后三免50ug/只5佛氏佐剂皮下
146.s4、尾血采集及效价检测
147.neu1或neu3：三免疫一周后进行尾血采集。
148.少量取血：鼠尾采血法——固定动物并露出鼠尾，将尾部侵入45-50度温水中数分钟，使静脉充血，擦干，再用酒精棉球擦拭消毒。剪掉尾尖约0.2-0.3cm。拭去第一滴血。然后用毛细管定量吸取尾血，并进行效价检测。
149.表2效价检测数据
150.稀释倍数小鼠1小鼠2小鼠3小鼠4小鼠55003.4493.5533.7043.573.28120002.942.8183.0612.7172.57580002.2381.6852.0961.5881.764320001.1940.7050.8610.6290.8381280000.3310.2050.2580.190.2625120000.1180.0890.0870.0790.089pbs0.0810.0840.0840.0850.073
151.5只小鼠效价均达到1：128000。
152.s5、细胞融合及阳性克隆筛选
153.融合：采用液体和半固体相结合的融合方式实现高通量筛选。
154.亚克隆筛选：克隆扩增/上清收集，并对抗体亲和力做筛选排序，将最终抗体应用实验增加到筛选阶段，实现高质量抗体的锚定筛选阳性克隆扩大培养：经2-3轮亚克隆筛选获取稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株，选取验证较好的3-5株进行扩大培养，其余冻存备份。
155.s6、腹水制备及抗体纯化
156.小鼠致敏：液体石蜡致敏balb/c小鼠，以经产鼠为宜，注射体积500ul/只。10天后可注射杂交。
157.瘤细胞制备腹水。
158.注射细胞：收集杂交瘤细胞并用pbs洗涤两遍，取100到150万细胞注射于小鼠腹腔，一周后可见小鼠状态不活跃并且小鼠的腹腔肿大。
159.腹水采集：注射细胞一周后，小鼠腹腔肿大时，用无菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，多次反复采集直到小鼠自然死亡。采集到的腹水分装归类最后于-20℃冰箱保存。
160.采用protein a亲和纯化抗体，透析浓缩，浓度测定，浓度调整为整数，纯度测定。
161.对纯化的抗体进行效价检测
162.s7、抗体配对筛选
163.使用表达抗原及阳性样本，选择最合适的抗体配对。
164.可选地，抗体液中牛血清白蛋白的浓度为10～14g/l，生物素化抗体neu1或生物素化抗体neu3浓度为5～10mg/l。
165.荧光探针液包括牛血清白蛋白和r-藻红蛋白标记链霉亲和素(sa-pe)。
166.可选地，荧光探针液中牛血清白蛋白的浓度为10～14g/l，r-藻红蛋白标记链霉亲和素的浓度为4～8mg。
167.可选地，精子唾液酸酶1/3检测试剂盒包括至少5ml固定液、至少5ml通透液、至少25ml缓冲液、至少5ml封闭液、至少10ml清洗液、至少50μl抗体液和至少2ml荧光探针液。
168.本技术的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒能够建立免疫流式间接标记法，其具有特异性强及较高的灵敏度，能对精液中精子唾液酸酶neu1或neu3的表达水平进行检测。同时，本技术的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒采用生物素化抗体与r-藻红蛋白标记链霉亲和素结合，利用级联放大的反应原理，增强了反应灵敏度，降低非特异性干扰，检测准确性高，且具有快速和单次检测量大的特点。
169.本技术还提供一种上述精子唾液酸酶1/3检测试剂盒的制备方法，其包括：分别制备固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液，然后将固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液分装后组装成精子唾液酸酶1/3检测试剂盒。
170.本技术的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒的制备方法简便，且制得的固定液、通透液、缓冲液、封闭液、清洗液、抗体液和荧光探针液均分装后再组装，在使用时可以根据不同的步骤选取不同的试剂。
171.本技术还提供一种利用上述的精子唾液酸酶1/3检测试剂盒检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法，其包括以下步骤：
172.s1、第一次洗涤处理
173.取0.5ml精液样本，加入1～2ml缓冲液，在3000～3500rpm的转速下离心5～8min，去除上清液，重复上述操作3～5次后，加入1～2ml缓冲液，制得第一样品液。
174.s2、固定处理
175.取200μl第一样品液，在3000～3500rpm的转速下离心5～8min，去除上清液，加入200～300μl固定液，5～30℃下静置10～15min，在3000～3500rpm的转速下离心5～8min，去除上清液，加入200～300μl缓冲液，在3000～3500rpm的转速下离心5～8min，去除上清液，制得第二样品液。
176.s3、通透处理
177.取制得的第二样品液，加入200～300μl通透液，5～30℃下静置15～20min，在3000～3500rpm的转速下离心5～8min，去除上清液，制得第三样品液。
178.s4、第二次洗涤处理
179.取制得的第三样品液，加入200～300μl缓冲液，在3000～3500rpm的转速下离心5～8min，去除上清液，制得第四样品液。
180.s5、封闭处理
181.取制得的第四样品液，加入200～300μl封闭液，5～30℃下静置30～40min，在3000～3500rpm的转速下离心2～5min，去除上清液，制得第五样品液。
182.s6、第一次孵育处理
183.取制得的第五样品液，加入100μl抗体液，在18～30℃下孵育2～2.5h，在3000～3500rpm的转速下离心2～5min，去除上清液，制得第六样品液。
184.s7、第三次洗涤处理
185.取制得的第六样品液，加入200～300μl清洗液，在3000～3500rpm的转速下离心2～5min，去除上清液，制得第七样品液。
186.s8、第二次孵育处理
187.取制得的第七样品液，加入100μl荧光探针液，在18～30℃下孵育1～1.5h，在3000～3500rpm的转速下离心2～5min，去除上清液，制得第八样品液。
188.s9、第四次洗涤处理
189.取制得的第八样品液，加入200～300μl清洗液，在3000～3500rpm的转速下离心2～5min，去除上清液，制得第九样品液。
190.s10、检测
191.避光条件下，向制得的第九样品液中加入300～400μl缓冲液，制成精子悬液，采用流式细胞仪检测精子悬液中精子唾液酸酶neu1或neu3的表达水平。
192.本技术检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法比较简便且快速，准确性高。
193.以下结合实施例对本技术的一种精子唾液酸酶1/3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶1/3表达水平的方法作进一步的详细描述。
194.实施例1
195.本技术实施例提供一种精子唾液酸酶neu1检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu1表达水平的方法。
196.1、精子唾液酸酶neu1检测试剂盒及其制备方法
197.s1、配制溶液
198.配制固定液：称取2.9g nah2po4·2h2o、19.24g na2hpo4和40gpfa，用700ml纯化水充分溶解后，用纯化水定容至1000ml，固定液的ph值为7.4。
199.配制缓冲液：称取174.09g na2hpo4·
12h2o、17.79g nah2po4·
2h2o和27g nacl，用2700ml纯化水充分溶解后，用纯化水定容至3000ml，缓冲液的ph值为7.4。
200.配制通透液：称取1ml triton x-100和100ml缓冲液，用700ml纯化水混合均匀后，用纯化水定容至1000ml。
201.配制封闭液：称取10g bsa和100ml缓冲液，用700ml纯化水充分溶解以及混合均匀后，用纯化水定容至1000ml。
202.配制清洗液：称取1ml tween 20和100ml缓冲液，用700ml纯化水混合均匀后，用纯化水定容至1000ml。
203.配制抗体液：称取10g bsa和5mg生物素化抗体neu1，用700ml纯化水充分溶解以及
混合均匀后，用纯化水定容至1000ml。
204.配制荧光探针液：称取10g bsa和4mg sa-pe，用700ml纯化水充分溶解以及混合均匀后，用纯化水定容至1000ml。
205.s2、组装
206.分别取5ml固定液、5ml通透液、25ml缓冲液、5ml封闭液、10ml清洗液、50μl抗体液和2ml荧光探针液分装后组装成精子唾液酸酶neu1检测试剂盒。
207.2、检测精子唾液酸酶neu1表达水平的方法
208.s1、第一次洗涤处理
209.取0.5ml精液样本，加入1ml缓冲液，在3000rpm的转速下离心5min，去除上清液，重复上述操作3次后，加入1ml缓冲液，制得第一样品液。
210.s2、固定处理
211.取200μl第一样品液，在3000rpm的转速下离心5min，去除上清液，加入200μl固定液，25℃下静置10min，在3000rpm的转速下离心5min，去除上清液，加入200μl缓冲液，在3000rpm的转速下离心5min，去除上清液，制得第二样品液。
212.s3、通透处理
213.取制得的第二样品液，加入200μl通透液，25℃下静置15min，在3000rpm的转速下离心5min，去除上清液，制得第三样品液。
214.s4、第二次洗涤处理
215.取制得的第三样品液，加入200μl缓冲液，在3000rpm的转速下离心5min，去除上清液，制得第四样品液。
216.s5、封闭处理
217.取制得的第四样品液，加入200μl封闭液，25℃下静置30min，在3000rpm的转速下离心2min，去除上清液，制得第五样品液。
218.s6、第一次孵育处理
219.取制得的第五样品液，加入100μl抗体液，在25℃下孵育2h，在3000rpm的转速下离心2min，去除上清液，制得第六样品液。
220.s7、第三次洗涤处理
221.取制得的第六样品液，加入200μl清洗液，在3000rpm的转速下离心2min，去除上清液，制得第七样品液。
222.s8、第二次孵育处理
223.取制得的第七样品液，加入100μl荧光探针液，在25℃下孵育1h，在3000rpm的转速下离心2min，去除上清液，制得第八样品液。
224.s9、第四次洗涤处理
225.取制得的第八样品液，加入200μl清洗液，在3000rpm的转速下离心2min，去除上清液，制得第九样品液。
226.s10、检测
227.避光条件下，向制得的第九样品液中加入300μl缓冲液，制成精子悬液，采用流式细胞仪检测精子悬液中精子唾液酸酶neu1的表达水平。
228.实施例2
229.本技术实施例提供一种精子唾液酸酶neu3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu3表达水平的方法。实施例2在实施例1的基础上改变生物素化抗体neu1为生物素化抗体neu3，其他不变。
230.对比例1
231.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu1检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu1表达水平的方法。对比例1在实施例1的基础上改变sa-pe为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomer，fitc)，其他不变。
232.对比例2
233.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu3表达水平的方法。对比例2在实施例2的基础上改变sa-pe为fitc，其他不变。
234.对比例3
235.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu1检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu1表达水平的方法。对比例3在实施例1的基础上改变固定处理的时间，由25℃下静置10min改为25℃下静置20min。
236.对比例4
237.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu1检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu1表达水平的方法。对比例4在实施例1的基础上改变封闭处理的时间，由25℃下静置30min改为25℃下静置20min。
238.对比例5
239.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu1检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu1表达水平的方法。对比例5在实施例1的基础上改变第一次孵育处理的时间，由25℃下孵育2h改为25℃下孵育1h。
240.对比例6
241.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu3表达水平的方法。对比例6在实施例2的基础上改变第一次孵育处理的时间，由25℃下孵育2h改为25℃下孵育1h。
242.对比例7
243.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu1检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu1表达水平的方法。对比例7在实施例1的基础上改变第二次孵育处理的时间，由25℃下孵育1h改为25℃下孵育0.5h。
244.对比例8
245.本技术对比例提供一种精子唾液酸酶neu3检测试剂盒及其制备方法、检测精子唾液酸酶neu3表达水平的方法。对比例8在实施例2的基础上改变第二次孵育处理的时间，由25℃下孵育1h改为25℃下孵育0.5h。
246.试验例1
247.设置对照组1和对照组2，对照组1在实施例1的基础上，在第一次孵育处理中不加入抗体液，对照组2在实施例2的基础上，在第一次孵育处理中不加入抗体液。对照组1～2的流式检测散点图、流式检测直方图分别如图1～6所示，实施例1～2和对比例1～8的流式检测散点图、流式检测直方图，如图7～36所示，实施例1～2和对比例1～8的阳性比例如表1所
示。
248.表1实施例1～2和对比例1～8的阳性比例
[0249][0250][0251]
由对比例1和实施例1对比、对比例2和实施例2对比可知，将sa-pe换成fitc，检测得到的阳性比例降低。
[0252]
由对比例3和实施例1对比可知，将固定处理的时间增加至20min，检测得到的阳性比例降低。
[0253]
由对比例4和实施例1对比可知，将封闭处理的时间减少至20min，检测得到的阳性比例降低。
[0254]
由对比例5和实施例1对比、对比例6和实施例2对比可知，将第一次孵育处理的时间减少至1h，检测得到的阳性比例降低。
[0255]
由对比例7和实施例1对比、对比例8和实施例2对比可知，将第二次孵育处理的时间减少至0.5h，检测得到的阳性比例降低。
[0256]
以上所述仅为本技术的具体实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。