本发明专利涉及兽医实验室检测，具体涉及口蹄疫液相阻断elisa试验。
背景技术：
1、口蹄疫(fmd)是由口蹄疫病毒(fmdv)引起的家畜的一种急性、热性、高度接触性传染病，是当今世界上最为严重的传染病，主要感染牛、羊、猪等偶蹄类动物，严重危害畜牧业健康发展和国际畜产品的对外贸易，我国将其列为一类动物疫病，并将其作为强制免疫的动物疫病病种，为了科学评价o型口蹄疫疫苗的免疫效果，目前，最常用的抗体检测方法是液相阻断试验，现有液相阻断elisa试验样品布局为每板10份和20份2种布局，大批量检测时，即费时又费钱，为了节省时间和试剂盒费用，采用每板40份样品布局更经济适用。本发明建立液相阻断elisa试验每板40份样品布局检测方法，并通过与每板10份和20份样品布局检测方法结果进行比较，判定结果完全准确。
技术实现思路
1、试剂o型口蹄疫液相阻断elisa试剂盒，批号：20201013101-5，中国农业科学院兰州兽医研究所生产。
2、试验方法
3、器材准备移液器；抗原抗体反应板；无离子水或蒸馏水。
4、试剂准备磷酸盐-吐温缓冲液(pbst)：试验操作前，将试剂盒配备的25倍的pbst浓缩液用无离子水或蒸馏水稀释成1倍pbst(1份浓缩液加入24份水进行稀释)，进行洗板或血清和病毒抗原的稀释。
5、操作步骤
6、抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应：
7、表1 o型口蹄疫液相阻断elisa试验40份布局
8、
9、稀释血清以表1为例操作，在u型反应板上以160μl/孔的量用pbst 2倍连续稀释血清，每份血清稀释1∶32和1∶642孔，(先在a、c、e、g行的1-10孔各加pbst 155μl，b、d、f、 h行的1-10孔各孔加pbst 80μl，再在a、c、e、g行的1-10孔按顺序加被检血清5μl，做2倍稀释)，在第11列稀释阳性对照血清，从1∶2(即a11孔80μl pbst加80μl阳性对照血清)稀释至1∶256；a12～b12孔稀释阴性对照血清，从1∶2稀释至1∶4；e12～h12孔为病毒抗原对照孔。
10、加病毒抗原：将病毒抗原用pbst稀释至工作浓度，以80μl/孔的量加入到被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100μl/孔稀释至工作浓度的病毒抗原。加入相应病毒抗原后，血清的稀释度加倍，被检血清变成1∶64和1∶128，由于阳性对照血清已经预先作了8倍稀释，则变为1∶32～1∶4096。封板，震荡，4℃静置过夜或37℃温育90min。
11、将抗原抗体混合液从u型反应板上按次序转移至已包被口蹄疫o型兔抗的elisa板上，50μl/孔，封板，37℃温育60min。
12、用pbst连续洗板3～5次，拍干，按50μl/孔加口蹄疫o型豚鼠抗体工作液(红色)，封板，37℃温育30min。
13、同上洗板3～5次，拍干，按50μl/孔加兔抗豚鼠igg-hrp工作液(蓝色)，封板，37℃温育30min。
14、同上洗板3～5次，拍干，将tmb底物a溶液和b溶液以1∶1比例混匀，加入混匀的底物溶液50μl/孔，置37℃显色15min。
15、显色反应结束后，加终止液50μl/孔，终止反应，在酶标仪上读取d450nm值。
16、结果判定
17、试验认可标准每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照d450nm值应在1.0以上，阳性对照抗体效价应在1∶1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1∶8。
18、血清抗体效价的判定病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低d450nm值，计算剩余2孔的平均d450nm值，再除以2，即50％对照值。该值即为临界值，表示阻断50％反应的对照d450nm值。被检血清d450nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔阳性孔。若临界值于稀释倍数最高阳性孔的d450nm值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔d450nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如处于1∶64(反对数值为1.8)与1∶128(反对数为2.1) 之间，则判定该份血清的抗体效价为1∶90(反对数值为1.95)。
19、结果判定抗体效价≥1∶128判为口蹄疫o型抗体阳性；1∶64～1∶128时，判为可疑；＜1∶64，判为阴性，可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价≥1∶128，判为阳性，＜1∶128判为阴性。
20、检测结果比较
21、表2 o型口蹄疫液相阻断elisa试验40份布局、10份布局、20份布局检测结果比较
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23、为了验证o型口蹄疫液相阻断elisa试验40份布局检测结果的准确性，分别与10份和20 份布局检测方法进行检测结果准确性比较，笔者随机采集了60份血清，对60份血清分别一一对应进行o型口蹄疫液相阻断elisa试验40份布局、10份布局、20份布局检测试验，从表2可见，经3种布局检测试验，60份相关血清试验判定结果完全准确。
1.为了科学评价o型口蹄疫疫苗的免疫效果，目前，最常用的抗体检测方法是液相阻断试验，现有液相阻断elisa试验样品布局为每板10份和20份2种布局，大批量检测时，即费时又费钱，为了节省时间和试剂盒费用，采用每板40份样品布局更经济适用。
2.本发明了建立液相阻断elisa试验每板40份样品布局检测方法，并通过与每板10份和20份样品布局检测方法结果进行比较，判定结果完全准确。